全 文 ：15 min内翻正反射消失 ,对各组动物翻正反射消失
率进行组间比较 ,经 χ2检验 ,化州柚提取物各剂量
组翻正反射消失发生率与空白对照组比较无显著性
差异(P>0.05),提示化州柚提取物对阈下剂量戊
巴比妥钠催眠作用无协同作用 。
3.4 　化州柚提取物对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠
睡眠时间影响　各组动物睡眠时间见表 4。由表 4
　表 3　　化州柚提取物对阈下剂量戊巴比钠所致
小鼠翻正反射消失的影响(n=10)
组别 翻正反射消失数(只)
翻正反射未消失数(只)
翻正反射消失率(%)
空白对照组 2 8 20
化州柚提取物高剂量组 2 8 20
化州柚提取物中剂量组 1 9 10
化州柚提取物低剂量组 2 8 20
　表 4　　化州柚提取物对阈上剂量戊巴比妥钠所致
小鼠睡眠时间的影响( x±S, n=10)
组别 睡眠时间(min)
空白对照组 36.9±10.8
化州柚提取物高剂量组 36.2±12.4
化州柚提取物中剂量组 40.6±13.8
化州柚提取物低剂量组 39.5±14.6
可见 ,各组动物在注射戊巴比妥钠后 ,全部动物均在
15 min内翻正反射消失并进入睡眠 ,对各组动物睡
眠时间进行组间比较 ,经 t检验 ,化州柚提取物各组
与空白对照组比较无显著性差异(P>0.05),提示
化州柚提取物对阈上剂量戊巴比妥钠催眠作用无协
同作用。
4　讨论
实验结果表明:化州柚提取物低 、中 、高剂量组
对小鼠自主活动 、协调运动能力无明显影响 ,对戊巴
比妥钠催眠无协同作用 ,提示化州柚提取物对小鼠
中枢神经系统无不良影响。这为化州柚提取物的临
床研究和安全用药提供了实验依据。
参 考 文 献
[ 1] 李沛波 , 马燕 ,杨宏亮 , 等 .化州柚提取物的抗炎作用 .
中草药 , 2006, 37(2):251-252.
[ 2] 李沛波 ,马燕 , 王永刚 ,等 .化州柚提取物的止咳化痰平
喘作用 .中国中药杂志 , 2006, 31(16):1350-1352.
[ 3] 彭代银 ,刘青云 , 戴敏 ,等 .荫风轮总苷的一般药理学试
验研究 .安徽医药 , 2005, 9(7):486-488.
[ 4] 徐叔云 , 卞如濂 ,陈修 .药理实验方法学 .第三版 .北
京:人民卫生出版社 , 2003:804-805.
(2007-05-18收稿)
菝葜不同溶剂提取物抑制钙调磷酸
酶活性作用的研究
陈东生 1 ,华小黎1 ,于丽秀 2
(1.华中科技大学同济医学院附属协和医院 ,湖北武汉 430022;2.华中科技大学同济医学院 ,湖北武汉
430022)
　　摘要　目的:研究菝葜不同溶剂提取物对钙调磷酸酶(CaN)活性的抑制作用。方法:以对硝基磷酸酚为底物 ,
通过测定底物水解产物的光密度 ,考察 CaN酶活力的变化 ,从而评价不同菝葜提取物对靶酶的作用效果。结果:菝
葜提取物均有抑制 CaN活性的作用 , 作用强弱顺序依次为:正丁醇部位 >乙酸乙酯部位 >乙醇部位 >水部位。结
论:菝葜的免疫抑制作用机理与其抑制 CaN活性有关 ,并且发挥该作用的活性部分主要集中在正丁醇萃取部位 ,该
部位活性最强。
关键词　菝葜;提取物;钙调磷酸酶
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2007)11-1436-04
基金项目:湖北省科委重点攻关计划项目资助(编号:2002P1105)作者简介:陈东生 ,男 ,主任药师 ,硕士生导师;Tel:027-85726077。
　　菝葜(SmilaxchinaL.)系百合科菝葜属植物 ,
其根 、茎 、叶均可入药 ,尤以根茎入药最为常见 。菝
葜具有消肿解毒 、祛风利湿 、抗炎镇痛 、抗肿瘤等药
理活性〔1〕 ,其制剂主要用于妇科慢性炎性包块 、附
件炎等 ,疗效较好 。多项药理实验表明菝葜还能治
疗免疫类疾病 ,调节体内免疫因子 〔2 ～ 4〕 ,但作用机理
1436 中 药 材 JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 30卷第 11期 2007年 11月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2007.11.032
未见报道 。其可能与关键信号酶———钙调磷酸酶
(CaN)调控与免疫相关的 T淋巴细胞有关 。 CaN作
为蛋白磷酸酶家族的一员 ,其活性直接受细胞内第
二信使 Ca2+ /CaM的调节。抑制 CaN活性的 CaN
抑制剂 ,则能阻断 TCR的信号传导通路 ,使 T细胞
不能活化 ,从而发挥免疫抑制作用。本实验希望通
过研究菝葜不同溶剂提取物对 CaN活性水平的影
响 ,来探讨菝葜提取物发挥免疫调节作用的机理 ,并
为筛选菝葜有效部位 ,确定提取工艺提供实验基础 。
1 　材料与仪器
1.1 　实验材料　药材菝葜(SmilaxchinaL.)采自
湖北省大悟县 ,经武汉协和医院中药鉴定室鉴定 ,经
干燥后 ,粉碎成粗粉 ,过 20目备用 。对硝基磷酸酚
(p-NPP, Sigma公司),钙调磷酸酶测试盒(Biomol
ResearchLaboratories),乙醇 、乙酸乙酯 、正丁醇 、二
甲亚砜(DMSO)等所用试剂均为分析纯 ,水为重蒸
水(自制)。
1.2 　实验仪器　DZF-6021型真空干燥器(上海精
宏实验设备有限公司 )、KQ-250型超声波清洗器
(昆山市超声波仪器厂)、RE-52AA型旋转蒸发器
(上海亚荣生化仪器厂)、HW102-1型恒温鼓风干燥
箱(武昌实验器械厂)、高压灭菌锅 (山东新华)、
303-10A数显隔水式培养箱 (南通科学仪器厂)、
HH-4型数显恒温水浴锅 (常州国华电器有限公
司)、超净工作台(苏州净化公司)、BR16型高速冷
冻离心机 (BAIYANG)、ALPHA1-4型冷冻干燥机
(CHRIST)、医用超低温冰箱 (SANYOElectricBio-
medicalCo., Ltd)、 UV-2450型紫外分光光度计
(SHIMADZU)、AUW2200D型分析天平(SHIMAD-
ZU)、PHST-4 PH浓度仪 (上海精科)、微量加样器
(Eppendorf公司)。
2 　方法与步骤
2.1 　菝葜不同溶剂提取物样品溶液的制备
2.1.1　乙醇提取物:称取 50 g菝葜粗粉 ,置圆底
烧瓶中 ,加 95%的乙醇浸泡过夜 ,回流提取 2次 ,每
次 3h。合并煎煮液 ,旋转蒸发 ,浓缩至干 ,得干燥固
体 8.366 g。取 0.5 g以 50%DMSO溶液超声溶解
制成 5 mg/ml的样品溶液 , 等比稀释制成 1、0.2、
0.04mg/ml的样品溶液 ,备用 。
2.1.2　水提取物:称取 200 g菝葜粗粉 ,置圆底烧
瓶中 ,加蒸馏水浸泡过夜 ,回流提取 2次 ,每次 3 h。
合并煎煮液 ,等分为 3份 ,其中一份浓缩至干 ,得干
燥固体 18.988 g。取 0.5 g以 25%DMSO溶液超声
溶解制成 5 mg/ml的样品溶液 ,等比稀释制成 1、
0.2、0.04 mg/ml的样品溶液 ,备用。
2.1.3 　乙酸乙酯萃取物:取 2.1.2项中煎煮液 ,加
入乙酸乙酯萃取 ,合并萃取液 ,减压浓缩 ,得干燥固
体 1.450 g。取 0.5 g以 20%DMSO溶液超声溶解
制成 5 mg/ml的样品溶液 ,再稀释制成 1、0.2、0.04
mg/ml的样品溶液 ,备用。
2.1.4 　乙酸乙酯萃取剩余物:合并 2.1.3项中萃
取剩余液减压浓缩 ,得干燥固体 13.626g。取 0.5 g
以 95%DMSO溶液超声溶解制成 5 mg/ml的样品溶
液 ,再稀释制成 1、0.2、0.04 mg/ml的样品溶液 ,备
用。
2.1.5 　正丁醇萃取物:取 2.1.2项中煎煮液 ,加入
正丁醇萃取 ,合并萃取液 ,减压浓缩 ,收得干燥固体
2.113 g。取 0.5 g以 80%DMSO溶液超声溶解制成
5mg/ml的样品溶液 ,再稀释制成 1、0.2、0.04 mg/
ml的样品溶液 ,备用 。
2.1.6 　正丁醇萃取剩余物:合并 2.1.5项中萃取
剩余液减压浓缩 ,得干燥固体 9.340 g。取 0.5 g以
80%DMSO溶液超声溶解制成 5 mg/ml的样品溶
液 ,再稀释制成 1、0.2、0.04 mg/ml的样品溶液 ,备
用。
2.2　菝葜提取物样品溶液抑制作用强弱的筛选
2.2.1 　原理〔5〕:由于 CaN在体外能水解对硝基磷
酸酚小分子底物(p-NPP),水解下的对硝基酚可直
接生色。故本实验应用发色底物法 ,确定以 p-NPP
为底物 ,通过测定底物水解产物的光密度 OD值 ,确
定酶的活力变化 。一般 OD值与酶活性强弱成正比
关系。 OD值越小 ,酶活力越弱 , 则菝葜提取物对
CaN酶的活性抑制作用越强。菝葜对 CaN酶的抑
制率计算公式如下:
　　抑制率(%)=1-OD药 +酶 -OD药对照OD酶 ×100%
2.2.2　实验分组:空白对照组:水;药物对照组:菝
葜样品溶液 +水;酶对照组:酶溶液 +水;实验组:菝
葜样品溶液 +酶溶液。其中各菝葜提取样品溶液 ,
在某一浓度时 ,实验组均设 3个平行管 ,并设 3个平
行酶对照管 ,检测结果取平均值。见图 1。
图 1　实验分组
1437中 药 材 JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 30卷第 11期 2007年 11月
2.2.3　酶活性测定方法:取干净试管若干 ,置冰浴
中 ,分别向每支试管中加入某一浓度(0.04、0.2、1、5
mg/ml)的菝葜样品溶液 10 μl、CaN酶溶液 10 μl,
于冰浴中孵育 5min,再分别加入测活液 180 μl,混
匀 ,置 30℃的水浴中反应 20min,取出 ,立即加入终
止液 1800 μl。用分光光度计在 420 nm处测定 OD
值 ,各药物浓度设 3个平行管 ,并设 3个平行酶对照
管 ,检测结果取平均值 。
3 　结果与分析
3.1 　结果　菝葜不同溶剂提取物样品溶液对 CaN
酶的活性抑制作用 ,见表 1 ～ 6。
　表 1 　乙醇提取物的酶活性测定
浓度(mg/ml)
OD值
酶 药物对照 (药 +酶)均值
酶活抑制率(%)
0 0 0.243 0
0.04 0.000 0.242 0.41
0.2 0.243 0.001 0.232 4.94
1 0.004 0.227 8.23
5 0.017 0.225 14.40
　表 2 　水提取物的酶活性测定
浓度(mg/ml)
OD值
酶 药物对照 (药 +酶)均值
酶活抑制率(%)
0 0 0.208 0
0.04 0.002 0.209 0.33
0.2 0.208 0.001 0.207 0.68
1 0.008 0.213 1.02
5 0.023 0.223 3.84
　表 3 　乙酸乙酯萃取物的酶活性测定
浓度(mg/ml)
OD值
酶 药物对照 (药 +酶)均值
酶活抑制率(%)
0 0 0.196 0
0.04 0.005 0.200 0.51
0.2 0.196 0.004 0.194 3.06
1 0.007 0.187 8.17
5 0.026 0.183 19.90
　表 4 　正丁醇萃取物的酶活性测定
浓度(mg/ml)
OD值
酶 药物对照 (药 +酶)均值
酶活抑制率(%)
0 0 0.269 0
0.04 0.005 0.27 1.48
0.2 0.269 0.004 0.249 8.92
1 0.009 0.182 35.69
5 0.032 0.179 45.35
　表 5 　乙酸乙酯萃取剩余物的酶活性测定
浓度(mg/ml)
OD值
酶 药物对照 (药 +酶)均值
酶活抑制率(%)
0 0 0.222 0
0.04 0.002 0.224 0
0.2 0.222 0.001 0.220 1.19
1 0.002 0.207 7.65
5 0.005 0.211 7.21
　表 6 　正丁醇萃取剩余物的酶活性测定
浓度(mg/ml)
OD值
酶 药物对照 (药 +酶)均值
酶活抑制率(%)
0 0 0.228 0
0.04 0.001 0.229 0
0.2 0.228 0.002 0.227 1.31
1 0.005 0.228 2.63
5 0.021 0.233 7.03
3.2　结果分析
3.2.1 　实验选用不同极性的溶剂提取菝葜药粉 ,
从而筛选最佳提取溶剂 。由四种溶剂所萃取得到的
菝葜样品溶液 ,均对 CaN酶有一定的抑制作用。作
用强弱顺序依次为:正丁醇部位 >乙酸乙酯部位 >
乙醇部位 >水部位 。证明菝葜的有效部位主要集中
在正丁醇部位 。见图 2。
图 2　不同溶剂萃取物的酶活抑制作用对比效果图
3.2.2　实验分别对比了正丁醇与乙酸乙酯的萃取
物及萃取剩余物的作用效果 ,结果(图 3)证明有效
成分主要集中在正丁醇萃取部位 。
4　讨论
4.1　CaN在细胞因子介导的 T细胞活化中起到调
节枢纽的作用 ,它通过脱磷酸化活化 T细胞核因子
(NF-AT),暴露其上的核定信号 ,使 NF-AT转位到
核内 ,然后参与IL-2、IL-4、TNF-α等各种基因的转
1438 中 药 材 JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 30卷第 11期 2007年 11月
图 3　正丁醇 、乙酸乙酯萃取物 /萃取剩余物作用效果图
录过程 ,最终刺激 T细胞的增殖。因此可以推测菝
葜发挥免疫抑制作用原理可能是:菝葜提取物与
CaN结合 ,抑制了 CaN磷酸酶活性并封锁其介导的
脱磷酸化反应 ,抑制 NF-AT移位入核中 ,进而抑制
了参与 T淋巴细胞生长分化的生长因子 IL-2等的
转录过程 ,抑制了 T细胞的分化生长 ,从而发挥免
疫抑制作用 。这与文献报道 〔2 ～ 4〕的菝葜能够治疗
AA、ITP等免疫性疾病 ,降低 IL-2等免疫因子水平 ,
降低 CD+4 T细胞及其介导的迟发性超敏反应等一
致 。
4.2 　CaN广泛存在于哺乳动物的组织细胞中 ,参
与多种细胞功能的调节。 CaN作为一种钙依赖性磷
酸酶 ,它不仅与 T细胞的活化有关 ,还与心肌肥大
细胞周期的调控等密切相关。因此研究新的毒副作
用小 、价格适宜的 CaN抑制剂 ———菝葜有效成分提
取物 ,对于治疗免疫性疾病 、心血管疾病以及癌肿等
都有极大意义〔6〕。
4.3　本实验应用乙醇 、水 、乙酸乙酯 、正丁醇等提
取菝葜 ,比较了不同溶剂 、正丁醇萃取 /萃取剩余部
位 、乙酸乙酯萃取 /萃取剩余部位等抑制 CaN作用
的强弱。发现提取物均有一定程度的抑制 CaN作
用 ,其中尤其以正丁醇萃取部位抑制作用最强 ,证明
通过抑制 CaN而发挥免疫抑制作用的菝葜有效部
位主要集中在正丁醇部位。这与我们前期所做的菝
葜相关免疫药理实验结果〔3〕一致。
4.3　菝葜作为传统中药 ,在临床应用广泛。本实
验证明菝葜能够抑制 CaN活性 ,这一发现有利于开
发菝葜新的药理作用 ,扩大其临床应用范围 。
参 考 文 献
[ 1] 江苏新医学院 .中药大辞典(下册).上海:上海人民出
版社 , 1997:1390-1392.
[ 2] 吕永宁 , 陈东生 ,邓俊刚 , 等.菝葜对小鼠佐剂性关节炎
作用的研究 .中药材 .2003, 26(5):334-336.
[ 3] 吕永宁 , 陈东生 ,熊先智 .菝葜不同提取物对小鼠佐剂
性关节炎的作用 .中国医院药学杂志 .2004, 24(9):
517-519.
[ 4] 华小黎 ,陈东生.菝葜有效部位对特发性血小板减少性
紫癜动物模型的实验研究 .世界临床药物 , 2006, 27
(2):123-125.
[ 5] 符民桂 , 唐朝枢.钙调神经磷酸酶活性测定.中国动脉
硬化杂志 , 2000, 8(1):82-83.
[ 6] 于翠娟 , 闫力君 , 魏群 .钙调神经磷酸酶及其研究进
展 .生命科学 , 2000, 12(2):89-92.
(2007-05-11收稿)
作者简介:陶箭飞 ,安徽马鞍山人 ,在读硕士研究生;E-mail:lyptjfl@ 163.com。＊通讯作者:都述虎 ,教授 ,主要从事天然药物提取分离新技术与新方法研究;E-mail:shuhudu1@yahoo.com.cn。
·制剂与质量·
Doehlert设计优化利咽颗粒中水提工艺
陶箭飞 1, 2 ,陈立娜1 ,都述虎 1＊
(1.南京医科大学 ,江苏南京 210029;2.安徽省马鞍山市中心医院 ,安徽马鞍山 243002)
　　摘要　目的:研究利咽颗粒中水提最佳工艺。方法:采用 HPLC测定利咽颗粒中质量控制指标次野鸢尾黄素
含量 , 并以此含量测定结果及水提取部位出膏率为考察指标 ,选用 Doehlert设计安排实验 , 对影响水提效果诸因素
(加水量 、煎煮时间 、煎煮次数)进行了优化。结果:利咽颗粒最佳水提工艺为加水 8倍 ,煎煮 3次 , 每次 2 h。结论:
该提取工艺可行 , 实验结果为确定利咽颗粒中水提工艺提供了实验依据。
关键词　利咽颗粒;Doehlert设计;渴求函数
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2007)11-1439-05
1439中 药 材 JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 30卷第 11期 2007年 11月