全 文 ：第 37 卷　第 7 期
2009 年 7 月
西北农林科技大学学报(自然科学版)
Journal of No rthwest A&F Univer sity(Nat.Sci.Ed.)
Vo l.37 No.7
Jul.2009
短芒大麦 DREB1转录因子的克隆与特性分析＊
王呈玉1 , 万　甡2 , 翟凤艳3 ,张明哲2 ,吕世友2 , 李彦舫2
(1 吉林农业大学资源与环境学院 ,吉林长春 130118;2吉林大学 植物科学学院 ,吉林长春 130062;
3河南科技学院 资源与环境学院 ,河南 新乡 453003)
[ 摘　要] 　【目的】克隆强抗寒性牧草———短芒大麦 DREB1(dehydration responsiv e element binding pro tein 1)
转录因子 ,分析其生理生化特性 , 为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定理论基础。【方法】利用 RACE-PCR(Rapid
am plification of cDNA ends-polymerase chain reaction)技术分离短芒大麦 DREB1 转录因子全长 cDNA 序列 , Nor th-
ern杂交和凝胶滞留试验分析其在逆境条件下的表达情况 , 及其与 DRE(dehydra tion re sponsive element)元件的结合
活性。【结果】从强抗寒性短芒大麦中成功分离了 1 个新的 DREB1类转录因子 HbDREB1 , 该基因全长 899 bp , 其蛋
白序列中含有 1 个典型的 AP2/ EREBP DNA 结构域及“ PKK/ RPAGRxKFxETRH P” 和“ DSAWR” 、“ LWSY” 3 个
DREB1 特征标签序列;序列比对分析表明 , HbDREB1 与其他植物的 DREB1 类转录因子的同源性较高。 HbDREB1
在转录水平上明显受冷胁迫诱导表达 ,具有结合 DRE-顺式作用元件的功能及作为转录因子必备的核定位特性。【结
论】HbDREB1基因参与了非生物胁迫信号转导 ,具有提高植物抗寒性的潜能。
[ 关键词] 　DRE-结合蛋白;短芒大麦;非生物胁迫;凝胶滞留分析;亚细胞定位
[ 中图分类号] 　 Q785;S512.301 [ 文献标识码] 　 A [ 文章编号] 　1671-9387(2009)07-0059-09
Cloning and characteristic analysis of DREB1 gene
in Hordeum brevisubulatum (Trin.)Link
WANG Cheng-yu1 ,WAN Shen2 ,ZHAI Feng-yan3 , ZHANG Ming-zhe2 ,
LV Shi-you2 , LI Yan-fang2
(1 Col leg e o f Resources an d Environmental S ciences , Ji l in Ag ricul tural Universi ty , Changchun , Ji l in , 130118 , China;
2 Col lege o f P lant S cience , J i lin Univer sity , Chang chun , J i lin 130062 , Ch ina;3 Col leg e o f Resources an d Environmenta l
S ciences, Henan Inst i tute of Science and Technolog y , X in xiang , Henan 453003 , China)
Abstract:【Objective】Cloning and phy sio logical and biochemical characte ristics analy sis of DREB1
gene in Hordeum brevisubulatum provided a theo retical basis for the screening and utilization of ideal re-
sistant gene.【Method】The cDNA sequence of DREB1 gene in Hordeum brevisubulatum was isola ted by
RACE-PCR;and i ts expression in adver sity condi tion and binding activi ty w ith DRE element w ere analyzed
by northern hybridization and elect ropho re tic mobility shif t assay respectiv ely .【Result】A new gene , Hb-
DREB1 , was isolated f rom DREB1 successfully .A full leng th o f 899 bp , HbDREB1 contains a typical AP2/
EREBP DNA structure zone in its pro tein sequence and PKK/ RPAGRxKFxET RHP and DSAWR se-
quences.Sequence comparison show ed HbDREB1 has high homo logy wi th DREB1 genes of other plants.
Expression of HbDREB 1 at transcript ion level is induced obviously by co ld stress , and , HbDREB1 can bind
wi th DRE cisacting element and has nucleic localization cha racteristics.【Conclusion】HbDREB1 gene par-
ticipated in signal t ransduction in abio tic stress condition and has a po tential fo r enhancing co ld resistance
＊ [ 收稿日期] 　2008-10-23
[ 基金项目] 　国家自然科学基金项目(30471229)
[ 作者简介] 　王呈玉(1975-),女 ,吉林四平人 ,讲师 ,博士 ,主要从事环境生物技术研究。
[ 通信作者] 　李彦舫(1937-),女 ,吉林长春人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事生物化学与分子生物学研究。
of plants.
Key words:DRE-binding pro tein;Hordeum brev isubulatum ;abiot ic stress;EMSA ;subcellular lo caliza-
tion
　　随着人类经济的发展 ,生物赖以生存的环境发
生了巨大的变化 。低温 、干旱和高盐等环境因素已
对植物的生长发育产生了严重的逆境胁迫作用 ,由
此造成的作物严重减产也已成为全球性的问题 ,其
中气候变化是妨碍植物生长的一个重要限制因子。
如何通过生物工程技术手段开发抗逆的植物种质新
资源 ,不仅是关系到国计民生的重大问题 ,而且已经
成为当代生物工程研究和植物改良领域的一大热
点。
低温 、干旱 、高盐等非生物胁迫是影响植物生长
发育及产量的重要环境胁迫因子[ 1] 。当受到低温 、
干旱和高盐胁迫时 ,许多植物能够感知低温等胁迫 ,
并通过体内一系列的生理生化变化引发特异性胞内
信号通路的激活或抑制机制 ,对逆境胁迫刺激做出
相应的反应 ,以增强抗逆性[ 1-3] 。同植物的抗虫 、抗
病等其他相关性状相比较 ,植物的抗逆性状要复杂
得多 ,是多个基因共同作用的结果[ 4] 。以前通过基
因工程手段对植物进行抗逆性改良主要集中于单一
基因的遗传转化 , 所采用的基因有低温诱导的
cor15a 、脯氨酸合成酶基因和甜菜碱合成酶基因
等[ 4-7] 。虽然这些基因也能提高作物的耐寒性或耐
盐性 ,但不能使植物的抗逆性得到较为理想的综合
改良 。即使是能同时被干旱 、高盐及低温诱导的
rd29A ,它的转基因也能提高植物对干旱 、高盐及低
温的耐性 ,但最终还是不及利用 DREB 类转录因子
基因的转化。因此 ,要综合改良植物的抗逆性状 ,
DREB类转录因子是迄今为止较为理想的基因[ 4 , 8] 。
短芒大麦 [ Hordeum brevisubulatum(Trin.)
Link]是禾本科大麦属中的一种多年生草本植物 ,俗
称野大麦 。它主要分布在荒漠化草原和高山草原的
边缘 ,具有耐寒性(冬季越冬最低温度可达 -40
℃)、耐旱耐瘠性 、耐盐碱性等优良的抗逆性状[ 9] 。
因此 ,从短芒大麦中克隆与耐寒性状相关的DREB1
转录因子基因 ,对于改良重要的单子叶粮食作物的
抗逆性可能具有更大的优势。为此 , 本研究利用
RACE技术 ,从抗逆性较强的短芒大麦中克隆了转
录因子 HbDREB 1 ,并对其转录因子的结合特性及
核定位特性进行了研究 ,以期为植物抗逆性的遗传
改良提供新的材料和方法 。
1　材料和方法
1.1　植物材料
将短芒大麦[ H .brevisubulatum(T rin.)Link]
种子(吉林大学植物基因工程中心保存),播种于土
质较肥沃的土壤中 , 25 ℃条件下正常培养 ,苗龄 2
周后 ,在连续光照的条件下 ,分别置于冷(4 ℃)、盐
(NaC l 300 mmo l/L)、干旱(200 g/L PEG6000)以及
ABA(100 μmol/L)进行胁迫处理 0.5 ,2 ,4 ,6 , 8 , 12
和24 h 。对照组在正常条件下生长。按时剪取不同
处理 、不同时间及对照的叶片 ,贮存在-80 ℃备用。
1.2　短芒大麦总 RNA 的提取
按照 TriZol试剂盒(Invi tro gen , Carlsbad ,CA ,
USA)操作说明 ,分别提取各胁迫处理和正常条件
下短芒大麦幼苗的总 RNA 。
1.3　短芒大麦 DREB1基因全长 cDNA 的克隆
根据已经获得的 HbDREB1 基因的 3′-RACE
结果(该内容由吉林大学植物基因工程中心的万甡
博士完成 ,结果未发表), 设计 5′-RACE 试验巢式
PCR 引物:DREB1-GSP1(5′-GATCAGTCGAAC
TAA TAGCTC-3′)、DREB1-GSP2(5′-ATCCAGTG
CTCG TCG TCCAG-3′)和 DREB1-GSP3(5′-GTCG
CTTGAGGTGATGGAG-3′)。按照 5′-RACE试剂
盒(5′-RACE System , version 2.0 , Invi tro genTM
Life Technolo gies)操作说明 ,获得 HbDREB1基因
5′末端序列 ,并对扩增产物进行测序;对 HbDREB1
基因 cDNA 3′末端和 5′末端序列进行合并获得 Hb-
DREB1基因全长 cDNA 。在该 cDNA 序列开放阅
读框两端设计基因全长特异引物 D1-GFP-up(5′-
TAAGA TCTATGGACACGGT TGCCGTCT-3′)和
D1-GFP-down (5′-TAACTAGTA TAGCTCCA-
CAGCGACGTGGA-3′)。引物中下划线部分表示
Bg l Ⅱ和 S pe Ⅰ酶切位点 ,用于植物表达载体的构
建。对获得的 HbDREB1 基因编码区序列扩增并
测序 ,利用 DNAman软件进行生物信息学分析。
1.4　HbDREB1基因在不同条件下的表达模式
以 HbDREB1 基因编码区为探针 , 按照 Dig
DNA Labeling and Detection Kit操作说明 ,对 Hb-
DREB1基因在不同胁迫处理和正常条件下的表达
模式进行 Northern blot分析[ 10] 。
60 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 37 卷
1.5　HbDREB1与 DRE元件结合活性的分析
1.5.1　HbDREB 1的原核表达　设计引物 D1-up
(5′-TAGGATCCATGGACACGGTTGCCGTCT-3′)和
D1-down(5′-CGGAATTCATAGCTCCACAGCGACGT -
GGA-3′),扩增 HbDREB1基因的编码区 ,引物中下划
线部分分别表示BamH Ⅰ和 EcoR Ⅰ酶切位点 。将
测序正确的 HbDREB 1基因与经 BamH Ⅰ和 EcoR
Ⅰ双酶切的 pET32a (+)原核表达载体(N ovagen ,
Germany)连接 ,构建重组表达质粒。重组质粒转入
大肠杆菌 BL21(DE3),挑取阳性单克隆 ,接入 LB培
养基 ,将过夜培养物按 1∶100体积比接种于新鲜且
预热的培养基中 ,振荡培养至 OD 600为0 .5 ～ 0.7时 ,
取出 1 mL 菌液作为对照 ,向培养物中加入 IPTG ,
使其终浓度为 0.8 mmol/ L ,以诱导重组蛋白的表
达 ,继续培养 3 ～ 5 h 后 10 000 r/min 离心 ,收集菌
体 ,冰浴中超声裂解表达重组蛋白的大肠杆菌 BL21
(DE3)细胞 ,按照 pET 表达系统提供的方法 ,将所
得的可溶性总蛋白用 Ni-NTA(nickel-nit rilot riace-
tic acid)树脂 ,通过亲和层析纯化重组蛋白[ 11] 。
1.5.2 　DRE元件的探针标记 　根据 GenBank 中
已经注册的 rd29A基因启动子序列[ 12] ,人工合成含
有 4个首尾相接 DRE 元件的 2条互补单链寡核苷
酸 DRE-1 (5′-AAAAGA TATACTACCGACA T-
GAGT TAAAAGATA TACTACCGACATGAGT T
AAAAGA TA TACTA CCGACA TGAGTTAAAAG
ATATACTA CCGACATGAGTT-3′, 下 划 线 表 示
DRE元件核心序列)、DRE-2(序列与 DRE-1互补),
突变 DRE 元件的 2条互补单链寡核苷酸 mDRE-1
(5′-AAAAGATATACTA C TTTTATGAG TTAAA
AGA TA TACTAC T TT TATGAGT TAAAAGAT
ATACTACT TT TATGAGT TAAAAGATA TAC-
TACT TT TA TGAG TT-3′,下划线表示 DRE 元件
核心序列突变位点)、mDRE-2(序列与 mDRE-1互
补)。
分别等物质的量混合 2条互补寡核苷酸链 , 85
℃加热 5 min ,室温下缓慢冷却 ,实现退火 , 得到
DRE 元件(4 ×DRE)和突变 DRE 元件(4 ×
mDRE),并分别进行 Digoxigenin标记 ,作为凝胶滞
留分析试验的探针 ,以未被标记的 DNA 片段作为
凝胶滞留分析试验的竞争剂。
1.5.3　HbDREB1的 DRE 结合活性分析　使用非
同位素 EMSA(Digoxigenin标记法)检测 HbDREB1-
DRE 结合活性 ,DNA-蛋白质相互作用混合体系(20
μL)包含以下成分:100 ng DNA 片段 ,不同浓度的
蛋白质 ,50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),1 mmo l/L
EDTA , 150 mmo l/L KC l , 1 mmo l/L DTT(二硫苏
糖醇)。室温放置 30 min后 ,用 60 g/L 的非变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳 , 150 V 电泳 1.5 ～ 2.0 h。电泳
结束后 ,撬开凝胶板 ,按 Northern blo t 方法进行吸
印转膜及结果检测。
1.6　HbDREB1的亚细胞定位分析
利用含有 BglⅡ和 S pe Ⅰ 酶切位点的引物 D1-
GFP-up和 D1-GFP-down ,扩增 HbDREB 1基因编
码区序列 ,将测序正确的序列与经 Bgl Ⅱ和 S pe Ⅰ
双酶切的植物表达载体 pCambia1302(吉林大学植
物基因工程中心保存)进行连接 ,构建 HbDREB1-
GFP 融合表达载体 ,并对重组载体进行酶切和测
序。采用农杆菌介导的方法对烟草进行转化[ 13] 。
将诱导生根的转基因烟草根尖伸长区以下区段
切成小段 ,用 20 g/L 纤维素酶和 2 g/ L 果胶酶酶解
10 m in。把酶解过的根尖置于载玻片上 ,滴加 1滴
ddH2O ,盖上盖玻片 ,轻轻按压 ,置荧光显微镜下 、以
488 nm 光激发进行荧光观察 。
2　结果与分析
2.1　HbDREB1基因的克隆与序列分析
采用 RACE-PCR的方法 ,成功克隆了短芒大麦
HbDREB 1基因 ,该基因全长 899 bp ,推测其编码
220个氨基酸的多肽 ,基因序列提交 NCBI GenBank
数据库 ,基因的登录号为 DQ 250027。序列分析结
果表明 , HbDREB 1与其他植物的 DREB1 类转录
因子的同源性较高 ,含有 1 个典型的 AP2/EREBP
结构域 , 并且在 A P2/ EREBP 结构域两侧还含有
DREB1类基因的标签序列(“ PKK/RPAGRxKFx-
ETRHP” 、“DSAWR”和“ LWSY”)(图 1)。比对所
用 序 列 的 GenBank 接 收 号 为 DREB1 H.b.
(DQ250027)、CBF2 H .v.(AF442489)、DREB1 F.a.
(AJ634001)、DREB1A A .t.(AB007787)、 DREB1A
O .s.(AF300970)、DREB1B A.t.(AB007788)和
DREB1C A .t.(AB007789)。
根据 Sakuma 等[ 14]的分类方法 ,本研究从拟南
芥 AP2/ERF 家族每个小组中 ,分别选取有代表性
的基因作为分类的基本框架 ,然后将 GenBank中登
陆并且有文献报道的 、来自其他植物的 DREB类转
录因子 DNA 结合域的氨基酸序列 ,用 DNAman软
件进行序列比对分析 ,并构建进化树 ,结果见图 2。
图 2 显示 , HbDREB 1 与 HvCBF2 、FaDREB1 、At-
DREB1A ～ 1C 被划分到 A-1 g roup , 表明 Hb-
61第 7 期 王呈玉等:短芒大麦 DREB1 转录因子的克隆与特性分析
DREB1属于 DREB1类转录因子。图2中所用序列
的GenBank接收号为 DREB1 H .b.(DQ250027)、
CBF1 H .v.(AF418204)、 CBF3 A .t.(NM
118680)、DREB1A A .t .(AB007787)、DREB1B A .
t.(AB007788)、 DREB1C A .t.(AB007789)、CBF
B.n.(AF370733)、CBF2 H.v.(AF442489)、DREB1 F.
a.(AJ634001)、DREB1A O.s.(AF300970)、DREB1B O.
s.(AF300972)、DREB1A Z.m.(AF450481)、DBF2 Z.
m.(AF493799)、DBP3a G.h.(DQ224382)、DREB2 O.s.
(AF300971)、DREB2A A.t.(AB007790)、DRF1 H.v.
(AY223087)、ABI4 A.t.(NM 129580)、ABI4 Z.m.
(AY125490)、RAP2.1 A.t.(NM 103607)、 RAP2.10
A.t.(NM 119854)、DBF1 Z.m.(AF493800)、DBP2 G.
h.(AY619718)和 RAP2.4 A.t.(NM106457)。
图 1　HbDR EB1 与来自其他植物的 DREB1 类转录因子氨基酸序列的比较
＊表示 HbDREB 1;下划线部分表示 AP2结构域;方框内序列表示 DREB1类转录因子的标签序列
F ig.1　Amino-acid sequence comparison of DREB1 type proteins isolated fr om plants
＊Indicates HbDREB1 ;Underlin e indicates the AP2 dom ain;The signatu re sequ ences are show n in boxes
2.2　不同非生物胁迫条件下 HbDREB1基因的表
达模式
利用 Northern blo t方法分析了 HbDREB1基
因在各种处理条件下的表达模式 ,结果见图 3。从
图 3可以看出 , HbDREB1基因在正常条件下(CK)
不表达 ,其转录水平明显受低温诱导 ,低温胁迫处理
2 h 后就出现杂交信号 ,随着处理时间的延长 ,表达
量迅速增加 ,至 12 h 达到最大值 ,之后随处理时间
62 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 37 卷
延长表达量逐渐降低;HbDREB 1基因受盐胁迫和
干旱胁迫诱导表达均较微弱 ,且表达模式相同 ,在盐
和干旱胁迫 8 h 后开始微弱表达 ,至 24 h 时表达量
均达到最高;ABA 处理不能诱导 HbDREB1 基因
在转录水平的表达 。与已报道的 DREB 亚家庭成
员在受到低温 、干旱等非生物胁迫条件下的表达情
况[ 8] 相比 , HbDREB 1基因与 DREB1类转录因子在
低温诱导下的表达模式相似 ,即短时间内表达量迅
速提高 , 24 h 后逐渐下降。以上结果表明 , Hb-
DREB1基因与短芒大麦冷胁迫信号转导密切相关 。
图 2　DREB 类转录因子系统进化树的分析
A-1～ A-6表示 DREB亚家庭各组[ 14] ;方框表示 HbDREB1
Fig.2　Phy lo genetic relationship among DREB type pro teins iso lated from plant
The scale indicates b ranch leng th s;A-1 to A-6 indicate subgroup s of DREB sub family;The g rou p A-1 containin g HbDREB1 is exhibited in box
图 3　不同非生物胁迫条件下 HbDR EB1基因在转录水平的表达模式
F ig.3　Nor thern blo t analy ses of the HbDREB1 transcript induced by various abiotic str esses
63第 7 期 王呈玉等:短芒大麦 DREB1 转录因子的克隆与特性分析
2.3　HbDREB1基因与 DRE元件的结合特性
将构建正确的原核表达载体转入大肠杆菌
BL21(DE3)细胞 ,经 IPTG 诱导后通过 SDS-PAGE
检测目的蛋白的表达(图 4)。
图 4　H is-tag:H bDREB1 融合蛋白在大肠杆菌 BL21(DE3)细胞中的表达
M .低分子量蛋白标准;1.BL21(DE3)0.8 mmol/ L IPTG 诱导后的总蛋白(对照);2.转化 pE T32a(+)载体的 BL21(DE3)0.8 mm ol/ L
IP TG 诱导后的总蛋白;3.转化 HbDREB1基因的 BL21(DE3)0.8 mm ol/ L IPTG 诱导后的总蛋白;箭头所指为 His-tag:HbDREB1融合蛋白
Fig.4　SDS-PAGE analysis of the recombinant H bDREB1 protein over-expr essed in E.coli BL21(DE3)
M .Low m olecu lar w eig ht p rotein M arker;1.T otal protein of E .coli BL21(DE3);2.The total proteins of the E.coli which
w as t ransformed by pE T32a(+)and in duced w ith IP TG for 3 h;3.The total p roteins of the E.co li w hich was t ran sform ed by
pET32a-HbDREB1 and indu ced w ith IPT G for 3 h;The arrow indicated the recombinant protein
图 5　His- tag:HbDREB1 融合蛋白的纯化结果
M .低分子量蛋白标准;1.Ni-N TA 亲和层析纯化的融合蛋白;
箭头所指为 His-t ag:HbDREB1融合蛋白
Fig.5　Purification of the recombinant HbDREB1 pro tein
over-expressed in E.coli BL21(DE3)
M .Low molecular w eight protein Marker;1.Fu sion protein
purif ied by Ni-NTA af finity chromatog raphy;
A rrow indicate His-tag and H bDREB1 fusion p rotein 　　
　　表达的 His-tag:HbDREB1融合蛋白的分子量
约为 25 ku ,与推测的 HbDREB1大小接近(图 4)。
裂解表达重组蛋白的大肠杆菌 BL21(DE3)细胞 ,将
所得的可溶性总蛋白通过 Ni-N TA 树脂进行亲和
层析纯化 ,得到了电泳纯的 、N-末端带有 His-tag 的
HbDREB1蛋白(图 5)。
　　采用非同位素 EMSA 的分析方法(Digoxigenin
标记法)检测了 HbDREB1蛋白与 DRE元件的结合
能力 ,结果如图 6所示。图 6显示 ,当含有 DRE 元
件的 DNA 片段与 HbDREB1蛋白的 DNA 结合域
在体外室温条件下温浴 30 min 后进行电泳 ,经转
膜 、预杂交和杂交 ,结果发现 ,在凝胶上有明显滞后
的条带 ,而且该条带颜色的深度随着加入蛋白量的
增大而呈正比例增加;当加入未标记探针后 ,随着未
标记探针加入量越少 ,标记的探针与 HbDREB1蛋
白结合后产生的滞后带颜色越深 ,且与突变的 DRE
元件无结合条带 ,这说明该滞后条带不是由于非特
异性结合造成的。 EMSA 试验结果表明 , Hb-
DREB1能够在体外条件下与 DRE 元件形成复合
体 ,是一个 DRE元件结合蛋白。
64 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第 37 卷
图 6　HbDREB1 与 DRE 元件结合的试验结果
A.DRE元件和突变的 DRE元件基序 ,下划线表示DRE元件的核心位点和突变位点;B.凝胶滞留分析试验结果;4×DRE.含 4个依次相连的
DRE元件探针;4×mDRE.含 4个依次相连的突变的 DRE元件探针;C om p.竞争剂;FP.游离的探针;BP.HbDREB1蛋白与 DRE元件
结合引起滞后的条带;×100 , ×75 , ×50.加入的未标记 DRE元件是标记元件的倍数;1.未加 H bDREB1蛋白;2～ 4.蛋白的上样量
分别为 10 , 20 , 30 ng;5～ 8.竞争性试验 ,竞争剂为未标记的 DRE元件探针;9～ 12.HbDREB1蛋白特异性结合 DRE元件试验
Fig.6 　Results o f HbDREB1 binding activity w ith DRE element
A.DRE element and mutation al mot if , underline indicates core an d mu tat ional si tes;B.Resu lt s of EMSA;4×DRE.Probe containing four
conjoint DRE element;4×mDRE.Probe con taining fou r m utat ional DRE elem en t;Comp.Com pet iti ve drug;FP.Free probe;
BP.Hy steretic bind af ter HbDREB1 bindin g w ith DRE elemen t;×100 , ×75 , ×50.Mul tiple for int rant u nlabel led DRE element w ith
labelled one;1.No H bDREB1 protein;2-4.Protein inject ion am ount:10 , 20 , 30 ng;5-8.Competive essay , competi ti ve d rug
is un labelled DRE elem ent;9-12.specif ic binding essay of HbDREB1 wi th DRE element
图 7　HbDREB1-GFP融合蛋白核定位分析
A , B.GFP 绿色荧光蛋白的表达;C , D.35S-HbDREB1-GFP 融合蛋白的表达;A , C.明视野;B, D.暗视野;标尺表示 100 μm
Fig.7　Nuclei localization analysis of HbDREB1-GFP fusion pro tein in tobacco roo t cells
A , B.Exp ression of GFP;C , D.Exp res sion of HbDREB1-GFP fusion protein;A , C.Brigh t fi eld;B , D.Dark field;Scale.100 μm
65第 7 期 王呈玉等:短芒大麦 DREB1 转录因子的克隆与特性分析
2.4　HbDREB1基因的亚细胞定位分析
将构建好的 HbDREB1与绿色荧光蛋白融合表
达的植物表达载体 pCambia-DREB1-GFP ,采用冻
融法导入农杆菌 EHA 105中 ,并利用叶盘法转化烟
草 ,其中以转化 GFP 基因的烟草作为对照。
将纤维素酶和果胶酶酶解的转基因烟草根尖置
于荧光显微镜下观察 ,结果如图 7所示 。图 7显示 ,
当GFP 单独表达时 , GFP 荧光则充满整个烟草根
尖细胞中;而当 HbDREB1与 GFP 融合表达时 ,此
融合蛋白特异性的定位于烟草根尖细胞的细胞核
中。这表明 HbDREB1 蛋白是细胞核定位的蛋白 ,
具备作为转录因子的基本特性 。
3　讨　论
本研究从强抗寒性单子叶植物 ———短芒大麦中
成功分离了 1 个新的 DREB1 类转录因子 Hb-
DREB 1 ,其蛋白序列中含有 1个典型的 AP2/EREBP
结构域及“PKK/RPAGRxKFxETRHP”和“DSAWR” 、
“LWSY” 3 个 DREB1 特征标签序列 ,这充分说明
HbDREB 1属于与低温胁迫相关的 DREB1类转录
因子 。序列比对分析表明 , HbDREB 1与以前研究
中 DREB1类转录因子在氨基酸水平上 ,特别是在
AP2/ EREBP 结构域部分存在很高的同源性。
EMSA 试验结果表明 , HbDREB1 蛋白能够与已知
的 DRE顺式作用元件结合 ,且这种结合以序列特异
性的方式进行。在对它的同源蛋白 , 如拟南芥
DREB1[ 8] 、水稻 DREB1[ 15] 和棉花 DREB1[ 16] 的研
究中也得到相似结果 。亚细胞定位试验进一步验证
了该基因表达的蛋白具有作为转录因子所必备的核
定位特性 ,因此可以推测该基因在短芒大麦中参与
调控低温胁迫信号的转导 。
与拟南芥和其他植物中的 DREB1 类转录因
子[ 17-20]相似 , HbDREB 1也受低温的诱导 ,且其转录
在盐和干旱处理条件下也有增加。一些研究结果表
明 ,某些 DREB1类基因除受低温胁迫诱导外 ,还受
到其他非生物胁迫的诱导 ,这些基因都编码能够直
接抵御胁迫的效应物[ 1 , 7 , 21-23] 。新近的研究结
果[ 15 , 24-26]与本研究结果显示 , DREB1类基因受低温
和盐胁迫诱导 ,进一步说明 DREB1类转录因子除
参与冷胁迫的信号通路外 ,还参与了渗透压胁迫的
信号通路 。
本研究报道了短芒大麦 DREB1类转录因子基
因的 cDNA 克隆和特性分析 ,该基因编码的蛋白含
有 1个典型的 AP2/EREBP 结构域和 2 个 DREB1
特征序列。体外条件下 , HbDREB1的 DNA结合区
能结合到已知的 DRE 顺式作用元件上 。此外 , Hb-
DREB1受到低温以及干旱和高盐胁迫处理的诱导 ,
这些结果丰富了有关 DREB1 类转录因子的信息 ,
同时为植物抗逆性的遗传改良提供了新的材料和方
法。
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