全 文 ：中国农学通报 2011,27(15):239-244
Chinese Agricultural Science Bulletin
0 引言
植物的无融合生殖是指不经过精卵融合而以种子
进行繁殖的一种特殊的无性生殖方式[1-2]。平邑甜茶
[Malus hupehensis (Pamp.) Rehd. var. pingyiensis Jiang]
为湖北海棠的一个变种，原产于中国山东省平邑县，具
有非常强的无融合生殖能力，其无融合生殖率在 95%
基金项目：国家自然科学基金资助“苹果属四倍性皱叶矮生株系的生殖特征及形成机理研究”（30971975）。
第一作者简介：甄睿，男，1985年出生，山西大同人，在读硕士，研究方向为果树种质资源评价与利用。通信地址：110866辽宁省沈阳市沈河区东陵路
120号沈阳农业大学园艺学院，E-mail：yyxyyy04205@163.com。
通讯作者：董文轩，男，1963年出生，河北三河人，教授，博士，研究方向为果树种质资源研究。通信地址：110866辽宁省沈阳市沈河区东陵路120号
沈阳农业大学园艺学院，Tel：024-88487143，E-mail：wxdong63@126.com。
收稿日期：2011-04-08，修回日期：2011-05-11。
SERK基因片段在平邑甜茶和四倍性后代花期前后的
表达特性研究
甄 睿，张丽杰，梁 敏，高书燕，董文轩
（沈阳农业大学园艺学院，沈阳 110866）
摘 要：为了探索SERK基因在苹果属植物无融合生殖习性上的功能与作用，阐明该基因在胚胎发育早
期在子房或胚珠组织的表达特性，以平邑甜茶及其与扎矮山定子杂交所得四倍性矮生后代28#和33#花
期前后的子房中段为试材提取总RNA；利用通过平邑甜茶叶片中扩增并测序的SERK基因片段设计的
特异引物，在以18S rRNA为内参基础上，采用RT-PCR技术分析了已得SERK基因片段在3份试材花期
前后的表达情况。半定量RT-PCR分析结果表明，再次获得的SERK基因片段在3份试材胚胎发育的不
同阶段均有表达，但表达强度有所不同。文中讨论了SERK基因片段的表达特性与胚胎发育和无融合
生殖特征的关系。
关键词：无融合生殖；SERK基因；半定量RT-PCR；平邑甜茶
中图分类号：S661.1 文献标志码：A 论文编号：2011-1001
Expression Characteristics of SERK in Periods Nearby Florescence of Pingyi Tiancha
and Tetraploid Offspring
Zhen Rui, Zhang Lijie, Liang Min, Gao Shuyan, Dong Wenxuan
(College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866)
Abstract: In order to explore the functions of SERK gene on apomictic characteristics in Malus and discuss
the expression characteristics of the SERK gene in the early periods of the ovary or ovule, the middle parts of
the ovary from 28#, 33# (which are the offspring of Pingyi TianchaבZha’ai Shandingzi’) and Pingyi Tiancha
were taken as the materials in the research. Based on the RNA extractions from all the materials and the SERK
sequences obtained from leaves of Pingyi Tiancha, the specific primers were designed and 18S rRNA was
taken as the internal standard, the SERK fragments RT-PCR analysis was carried out in the 3 different
materials about the expression situation around florescence. The results indicated that SERK gene fragments
expressed in all different materials and stages, but expression intensity displayed differences. The relationship
between SERK gene fragment expression characteristics and embryonic development, apomictic features was
discussed in this article.
Key words: apomixes; SERK gene; PT-PCR; Pingyi Tiancha
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以上 [3]。扎矮山定子 [M. baccata (L.) Borkh.‘Zha’ai
Shandingzi’]发现于内蒙古自治区呼伦贝尔盟扎兰屯，
是普通山定子的矮生型突变，与普通山定子或苹果品
种的杂交后代中高株与矮株比例1:1，并可以保持高抗
寒性。董文轩等以平邑甜茶为母本与扎矮山定子杂
交，共获得100多株皱叶矮生型有性杂交后代，以期得
到既具有矮化抗寒特性，又具有无融合生殖特性的苹
果砧木资源。后经鉴定，选出的皱叶型后代皆为四倍
体[4]。
近年来在无融合生殖习性的研究中，除了从胚胎
发育角度进行组织学探索外[5-6]，随着分子生物学的发
展，通过 RAPD、RFLP、AFLP 以及 cDNA 文库和
mRNA差异显示等技术和方法已经在一些无融合生
殖型的植物中发现了一些与无融合生殖有关的基因或
基因片段 [8]。SERK（Somatic Embryogenesis Receptor-
like Kinase）基因就是已经发现的一个重要的与无融
合生殖相关的基因。
SERK基因全称为“体细胞胚胎发生相关类受体
蛋白激酶”[9]，是体细胞胚发生过程中最重要的基因，
通常认为与无融合生殖习性密切相关，最初是在胡萝
卜（Daucus carota）中发现的，但是随后便在多种植物
中分离到不同的SERK基因，如向日葵、鸭茅、可可、蜜
桔、草地早熟禾等。广泛存在的SERK基因在不同的
植物中有特定的表达方式。除了少数基因的表达在体
细胞胚内检测不到外，其他已经报道功能的SERK基
因一般都参与了体细胞胚的发生。Clement等[10]研究
向日葵 IZE培养物的SERK转录体时发现，SERK基因
在两种发生途径的前期均表达。然而，某些植物的
SERK基因并不仅仅局限于胚性细胞中表达。在可可
树中发现了TcSERK基因不仅在胚性愈伤组织中高度
表达，同时也在成熟体胚和合子胚中表达。因此，
SERK基因的表达和体细胞的成胚能力紧密相关，可
以作为具有胚胎发生能力体细胞的标记，是与无融合
生殖方式中孤雌生殖密切相关的基因[11-12]。
为进一步探讨无融合生殖相关基因在苹果属植物
胚胎发育不同阶段的表达特性，即开花前后的的表达
强度，笔者以平邑甜茶以及平邑甜茶与扎矮山定子杂
交所得的四倍体矮生后代为试验材料，以 18S rRNA
为内参基因、SERK基因为检测目的基因，应用逆转录
多聚合酶链式反应（RT-PCR）技术对无融合相关基因
的表达进行半定量分析 [13-15]，建立一个特异、稳定的
RT-PCR半定量检测体系，为进一步研究其表达调节机
制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
所用试材是无融合生殖类型平邑甜茶为母本、矮
生型资源扎矮山定子为父本进行杂交而获得的皱叶矮
生型株系28#、33#以及平邑甜茶。所有试材均采自沈
阳农业大学果树基地。在花期前7天开始每天采集花
蕾，采集后迅速回实验室进行横切，取子房中段立即液
氮冷冻，然后存放在-70℃冰箱中备用。试材采集时间
持续到开花后8天。
1.2 所用主要试剂
AMV，RNA酶抑制剂皆购自 TaKaRa公司，Taq
DNA Polymerase购自北京天根生物公司，其他化学试
剂均为国产试剂。
PCR引物序列设计，根据本实验室已经得到的
SERK基因序列，利用 Primer Premier 5.0设计特异引
物，其中上游引物命名为SERK1F，序列为 5-AGGGG
TCCTTCTTATTTG-3。下游引物命名为 SERK1R：
5-ATTGGGGAGCCTTGTGTG -3，扩增片段长度为
458 bp（AGGGGTCCTTCTTATTTGCATGAT CACTG
TGACCCGAAGATTATTCACCGTGATGTGAAAGCT
GCAAACATTTTGCTGGATGAGGAGTTTGAGGCTG
TTGTTGGAGACTTTGGTTTGGCTAAACTTATGGA
CTACAAAGACACCCACGTCACTACTGCTGTACGT
GGCACAATTGGACATATAGCTCCAGAGTACCTGT
CTACCGGGAAGTCATCTGAGAAAACTGATGTTTT
CGGTTACGGTATCATGCTTCTGGAGCTTATTACTG
GTCAGAGGGCTTTTGATCTTGCTCGCCTTGCAAA
TGATGATGATGTCATGTTGCTTGATTGGGTGAAA
GGACTACTGAAGGAGAAAAAGCTAGAAATGCTG
GTTGATCCTGATCTCCAGAGTAATTATGTAGAAG
CTGAGGTAGAGCAGCTAATTCAAGTTGCACTGC
GCTCTGCACACAAGGCTCCCCAAT）。
内参选定为苹果18S rRNA[16]，扩增上游引物命名
为 18SF，序列为 5-GGGTTCGATTCCGGAGAGG-3，
下游引物命名为 18SR，序列为 5-CCGTGTCAGGATT
GGGTAAT-3。引物由赛百盛合成。
1.3 方法
1.3.1 总RNA提取、定量与完整性检测 用改良CTAB
法分别提取各时期试材的总RNA。具体步骤如下：将
预处理的试材子房中段约0.1 g在液氮中研碎，迅速移
入 1.5 mL离心管中；加入 588 μL预热的 2% CTAB提
取缓冲液（1.4 mol/L NaCl，100 mmol/L Tris-HCl，
20 mmol/L EDTA，2.0% β-ME，1.0% PVP）和 12 μL 2%
β-巯基乙醇，混匀后 65℃水浴 30 min，期间颠倒几次；
·· 240
甄 睿等：SERK基因片段在平邑甜茶和四倍性后代花期前后的表达特性研究
然后加等体积氯仿，颠倒混匀5 min，10000 r/min下4℃
离心 10 min进行抽提；重复进行抽提一次；取上清液
于新管中，加入四分之一体积10 mol/L氯化锂在-20℃
沉淀1 h；弃上清液，用400 μL DEPC水溶解沉淀，待沉
淀溶解后加入 1/10 体积的 3 mol/L NaAc 水溶液
（pH 5.2），混匀后再加入2.5倍体积的冰凉无水乙醇颠
倒混匀，-20℃放置30 min，而后10000 r/min下4℃离心
10 min；弃上清液，加入 300 μL DEPC水，使沉淀溶解
后加入 4 μL RNase-free DNaseΙ，10 μL DNaseΙ buffer，
1 μL RNase，酶解 4 h；取上清液移入新管后加入 1/10
3 mol/L NaAc（pH 5.2），2.5倍体积的冰凉无水乙醇颠
倒混匀，-20℃放置30 min，而后10000 r/min下4℃离心
10 min；用 70%乙醇洗涤沉淀，后于超净工作台吹干，
加入 30 μL DEPC水溶解。在核酸蛋白分析仪上检测
A260/A280的比值，计算总RNA纯度，通过A260的值分别
对不同时期的试材进行定量。在 1%普通琼脂糖凝胶
电泳上分离总RNA，检测RNA完整性。
1.3.2 cDNA第一链的合成 根据定量后总RNA的浓
度，取不同时期平邑甜茶及四倍性皱叶矮生植株等量
的总RNA，按逆转录酶AMV 20 μL标准反转录体系的
要求严格操作。在离心管中加入 1 μg总RNA，oligod
（T）18 primer（0.5 μmol/L）0.5 μL，random primer 9
（0.5 μmol/L）0.5 μL，dNTPs（10 μmol/L）1 μL，用
RNase-free ddH2O补足体积至 14.5 μL。弹指混匀，
65℃水浴 5 min，立即置冰上 2~3 min。而后加入 5×
Reaction Buffer 4 μL，RNase Inhibitor（20 U/μL）
0.5 μL，AMV（5 U/μL）1 μL，离心混匀，37℃恒温
2.5 h。之后70℃ 10 min。-20℃保存。
1.3.3 半定量RT-PCR的条件摸索 首先进行PCR梯度
实验，摸索合适的引物退火温度Tm。PCR的反应体
系为20 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL，10×buffer 2 μL，
上游引物和下游引物（5 μmol/L）各1.6 μL，cDNA模板
1 μg，Taq聚合酶 0.4 μL，加 ddH2O 11.8 μL至总体积为
20 μL。反应以 57℃为中心温度，摸索范围为 57±7℃。
反应条件如下：95℃预变性3 min；95℃ 30 s，57℃ 30 s，
72℃ 60 s，35循环；72℃最终延伸 10 min。之后进行
1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色。
1.3.4 进行 SERK和 18S rRNA基因的 PCR扩增 PCR
反应采用 20 μL反应体系，分别加入 3份试材 16个时
期的 cDNA 1 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL，10×buffer
2 μL，上游引物和下游引物（5 μmol/L）各 1.6 μL，
cDNA模板 1 μg，Taq聚合酶 0.4 μL，加 ddH2O 11.8 μL
至总体积为 20 μL。PCR反应程序如下：95℃预变性
3 min；95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 60 s，35循环；72℃最
终延伸 10 min。之后进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳，EB
染色。
所有试材均取样 3次，进行 3次RT-PCR分析时，
要求相同结果达到两次以上。
2 结果与分析
2.1 RNA电泳检测
总RNA提取后，取样品3 μL与2 μL溴酚蓝混匀，
1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，电泳图上
出现两条谱带，(28S RNA，18S RNA)。且28S RNA的
亮度是 18S RNA的两倍。利用核酸蛋白分析仪对所
提取的RNA样品进行测定，OD260/OD280比值均在 2.0
左右，说明样品纯度合格。
1 2 3 4 5 6 7 8
28S RNA
18S RNA
1~8泳道分别为花前7天至开花当天的样品
图1 花期子房RNA提取物电泳图
2.2 退火温度的确定
反应以28#花前7天cDNA样品为底物，以57℃为中
心温度，摸索范围为57±7℃。从第1泳道至第10泳道的
退火温度分别为：50、50.4、51.3、52.5、54.2、56.4、58.9、
61.0、62.7、63.9℃。结果（图 2）表明，在 10种退火温度
下，SERK基因均被成功扩增，条带清晰，没有杂带，依
据亮度的差异，选择54℃作为后续试验的退火温度。
2.3 引物SERK1和内参引物进行分管PCR
用28#在开花当天和花前7天进行分管PCR，同时
进行 18S RNA内参引物的扩增。28#与 18S的扩增产
物在同一点样孔进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳。结果表
明，28#在花前 7天到开花当天均有 SERK基因的表
达，表达强度有差异；但 18S RNA内参扩增出的产物
亮度一致，表达稳定（图3）。
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2.4 相同时期不同试材之间SERK基因表达情况对比
由图 4和图 6可以看出：33#在花前 7、4、3、2、1天
的SERK基因表达强度明显高于28#和平邑甜茶，在花
前 6天和开花当天三者差异不明显；而平邑甜茶除了
在花前3天、花前1天表达强度略弱于28#外，其余6天
均强于28#。从图5和图6可以看出：在花后1~4天，各
试材间SERK基因的表达强度差异较明显；在花后1~2
天时 28#表达最强，3~4天时平邑甜茶表达最强（特别
是花后 3天，平邑甜茶的表达强度明显高于 28#和
33#），在花后 1~4天中均以 33#表达最弱；在花后 5~8
天，各试材间SERK基因的表达强度差异较小，特别是
花后5~7天28#和平邑甜茶之间基本无差异，但都略高
强于 33#。总的来看，花前各试材的表达差异大于花
后时期。
3 讨论
利用RT-PCR技术确定SERK基因在花期前后的
表达强度，是基于胚胎学观察结果，分析无融合生殖各
时期SERK基因表达强度的重要方法。强风风对金茶
花 SERK的研究表明：金茶花胚胎发生各时期 SERK
基因都有不同程度的表达，其中子叶胚的表达量最大，
1 2 3 4 5 M 6 7 8 9 10
M：100 bp DNA Ladder；1~10泳道分别为在不同退火温度下28#花前7天的样品
图2 梯度PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳结果
M 1 2 3 4 5 6 7 8
A
0
0.5
1
1.5
2
2.5
花
前
7
花
前
6
花
前
5
花
前
4
花
前
3
花
前
2
花
前
1
开
花
取样时间/d
SERK 18S B
M：100 bp DNA Ladder；1~8泳道分别为花前7天至开花当天的样品；
A图为表达情况电泳图，B图为表达情况灰度值折线图
图3 28#花前7天至开花当天SERK基因的表达情况
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
M：100 bp DNA Ladder；1—12泳道分别为28#、平邑甜茶、33#花前7天至花前4天的样品
A
表
达
强
度
灰
度
值
×
10
7
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甄 睿等：SERK基因片段在平邑甜茶和四倍性后代花期前后的表达特性研究
成熟胚和花状多子叶胚次之，球形胚和心形胚最小[12]。
在本试验中，根据以往胚胎学研究结果，平邑甜茶的无
融合生殖率在95%以上，而28#和33#的无融合生殖率
在50%左右，两类试材的无融合生殖率差异非常明显；
而且花前7天到花后8天也是3份试材胚囊发生、形成
直到原胚出现的时期，即胚胎发育早期变化非常迅速
和剧烈的时期；花前1天到花后1天为成熟的8核胚囊
形成期，花前 2~5天为单核胚囊到八核胚囊形成时
期，花前5天以前为单核胚囊形成期；花后2~5天为卵
细胞发育期（有授粉条件时就是花粉管生长和受精时
期）；花后 6~8天是卵细胞休眠并开始分裂的时期[4,7]；
但从试验结果看，无融合生殖率和胚胎发育阶段与所
观测SERK基因片段的表达，没有确定的关系。上述
M：100 bp DNA Ladder；1~12泳道分别为28#、平邑甜茶、33#花前3天至开花当天的样品；
每天对比的试材顺序从左到右依次为28#、平邑甜茶、33#
A：花前7天到4天28#、平邑甜茶、33#表达强度对比；B：花前3天到开花当天28#、平邑甜茶、33#表达强度对比
图4 28#、平邑甜茶、33#花前7天至开花当天SERK基因表达强度对比电泳图
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
B
M：100 bp DNA Ladder；1~12泳道分别为28#、平邑甜茶、33#花后1天至花后4天的样品
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
M：100 bp DNA Ladder；1—12泳道分别为28#、平邑甜茶、33#花后5天至花后8天的样品；每天对比的试材顺序同图4
A：花后1天到4天28#、平邑甜茶、33#表达强度对比；B：花后5天到花后8天28#、平邑甜茶、33#表达强度对比
图5 28#、平邑甜茶、33#花后1天至8天SERK基因表达强度对比电泳图
A
B
0代表开花当天，-7到8代表花前7天至花后8天
图6 28#、平邑甜茶、33#花前7天至花后8天
SERK基因表达强度对比灰度值折线图
00.5
11.5
22.5
33.5
44.5
-7-6-5-4-3-2-1012 345 678
取样时间/d
表
达
强
度
灰
度
值
/?0
7 28号 平邑甜茶 33号
表
达
强
度
灰
度
值
/×
10
7
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试验结果的出现，可能与无融合生殖习性发生的具体
时期要与试验取材合理对应有一定的关系，其中更详
细的原因有待进一步探讨。
由于无融合生殖发生的时间段主要集中在花前、
花后近一个月的时间内，如何合理的划分时间段取材，
是否应延长取材的时间跨度都是影响无融合生殖具体
时期SERK基因表达强度合理性的因素，这也是将来
要探索的方向。
4 结论
再次获得的 SERK基因片段在平邑甜茶、28#和
33#株系的胚胎发育不同阶段均有表达，但表达强度有
所不同，且花前各试材的表达差异大于花后时期；然
而，表达强度与胚胎发育时期和无融合生殖率高低没
有确切关系。
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