全 文 ：2 0 0 9 年 3 月
第 4 6 卷 第 2 期
四川 大学学报 ( 自然科学版 )
J o u r n a l o f S ie h u a n U n i v e r s i t y ( N a t u r a l S e ie n e e E d i t io n )
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2 0 0 9
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4 6 N o
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2
文章编号 : 0 4 9 0一 6 7 5 6 ( 2 0 0 9 ) 0 2一 0 5 0 4 一 0 5
秋花独蒜兰原球茎液体快速增殖和分化培养研究
胡晓丽 ` , 成 倩 ’ , 王莹莹 ` , 魏兴强 2 , 张 健 ` , 纳海燕`
(l
. 四川大学生命科学学院 ,成都 6 10 0 6 4 ; 2 . 云南英茂生物农业技术公司 ,安宁 6 5 0 3 0 1 )
摘 要 : 采用液体振荡培养的方 法进行秋花独蒜兰原球茎 的快速增殖和分化试验 , 分别研究
了不 同基本培养基 、 激素种类及其浓度 、 不 同天然添加物 对原球茎增殖的影响 ,在此基础上进
行 了原球 茎快速分化的研究 . 实验结果表明 ,秋花独蒜 兰 原球 茎的快速增殖培养基为 : 花 宝
。 . 3% 十糖 2 % + B A o . 5 m g / L ; 而液体~ 固体培养基形式的 分化培养 比 固体 ~ 固体培养基形
式的分化速度快 , 且分化的芽的粗壮程度高于 固体一 固体培养基形式中的 芽 .
关键词 : 秋花独蒜 兰 ; 原球茎 ;液体培养 ; 固体培养 ;快速增殖 ; 快速分化
中图分类号 : Q 9 43 文献标识码 : A
R a P i d P L B s P r o l i f e r a t i o n a n d r e g e n e r a t i o n i n l i q u i d e u l t u r e
o f P l e i o n e m a c u l a t e L i n d l
.
H U X i a o
一
L i ` , C H E N G Q i a n
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WA N G iY n g
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Z H A N G J i a n
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( 1
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o l l e g e o f L if e S e ie n e e s
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A b s t r a e t
: T h e p r o t o e o r m l ik e b o d ie s o f P l e i o n e m a c u l a t a L i n d l
.
w e r e u s e d a s e x p l a n t s f o r t h e r
a p id p r o
-
1if e r a t i o n a n d r e g e n e r a t i o n i n l i q u id e u l t u r e w i t h d i f f e r e n t m e d i a
、 o r g a n i e m a t t e
r s a n d d i f f
e r e n t e o n e e n t r a
-
t i o n o f h o r m o n e s
.
T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e b e s t m e d i u m f o r p r o li f e r a t i o n o f P
.
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e u l a 乙a P L B s w a s
h y p n e x 0
.
3% + S u e r o s e Z% + B A o
.
5 m g / L
.
T h e : a t e o f P L B S : e g e n e r a t i o n i n t h
e c u l t u
r e s t y l e o f l i q u i d
t o s o li d m e d i u m w a s s i g n i f i e a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i n t h e e u l t u r e s t y l e o f s o l i d t o s o l id m e d i u m
, a n d t h e
p l a n t l e t s i n t h e e u l t u r e s t y l e o f l i q u i d t o s o l id tn e d i u m w e r e rn u e h s t r o n g e r
.
eK y w
o r d s : P l e i o n e
.
m a c u l a t a L i n d l
. ,
p r o t o e o rm l i k e b o d i e s ( P L B s )
,
l i q u i d e u l t u r e
, s o l id e u l t u r e
, r a p id
P r o l if e r a t i o n
, r a p i d r e g e n e r a t a t i o n
1 引 言
秋花独蒜兰 ( P I。 i o n 。 m a 。 u l a t。 L in d l . )是 附生
型草本独蒜兰属植物 ,花色 白或淡紫红 , 带有此属
植物中少见的芳香气味 ,秋花独蒜兰是很珍贵的小
型盆栽 兰花 , 具较高 的观赏价值 , 深受人 们 的喜
爱 lj[ . 其假鳞茎是传统的名贵中药 ,可用于治疗肝
硬化 、 黄疽 ,尤其是对降低 y 一球蛋 白 , 升 高 白蛋 白
的效果更为显著 ;其汁液可用于乳腺癌 、 食道癌等
抗癌治疗〔幻 . 独蒜兰属植物 (包 括秋花独蒜兰 ) 是
一种优良的园林及盆栽观赏植物 ,在美 、 日 、 欧等地
区栽培较普遍并且少量 已进人商业性栽培 , 目前
我国对独蒜兰的研究与开发尚处于初级阶段比 `〕 ,
人们观赏的独蒜兰多采 自野生 ,资源破坏严重 .
收稿日期 : 2 0 0 7一1 1一 0 1
基金项 目 : 成都市建委应用研究基金 ( 2。。 7 7 22)
作者简 介 : 胡 晓丽 ( 19 8 2一 ) ,女 , 硕士研究生 , 研究方向为植物遗传学 . -E m ial : h u ix ao h 2 09 @ 12 6 . 。 。 m
通讯作者 : 纳海燕 . E一m a i l : h a y a n a @ s e u . e d u . c n
第 2 期 胡晓丽等 :秋花独蒜 兰原球茎液体快速增殖和分化培养研究
秋花独蒜兰在 国内仅产于云南西部 ,生于阔叶
林中树干上或苔鲜覆盖的岩石上 , 海拔 6 0 一 1 6 0 0
m
. 尼泊尔 、 不丹 、 印度 、 缅甸和泰 国也有分布川 ,
其在 国内外市场上都有较大需求 . 在 自然条件下 ,
独蒜兰的种子不易萌发 , 而以假鳞茎分株繁殖 , 繁
殖速度慢且数量有限 . 近年来仅有少量关于独蒜
兰属植物组织培养 的报道 〔卜 ` 3〕 , 但都 是以 固体 培
养基为培养基质的 ,液体培养还未见报道 . 本研究
希望通过原球茎液体培养 、 液体~ 固体结合培养等
方法 ,建立秋花独蒜兰原球茎液体培养的快速稳定
的增殖系和快速分化途径 .
2 材料和方法
2
.
1 材 料
实验采用无菌播种形成的实生原球茎作为外
植体材料 .
增殖培养基 :
M
: 1 2/ M S 培养基 + 糖 1 . 5% + B A o . 5 m g / L
T : T H + 糖 2 . 0% + B A o . 5 m g / L
H O
: 花宝 0 . 3 % + 糖 2%
H l
: 花宝 0 . 3 % + 糖 2% + B A o . 5 m g / L
H Z
: 花宝 0 . 3 % + 糖 2% + B A I . 0 m g / L
H 3
: 花宝 。 . 3 % 十糖 2% 十 B A 2 . 0 m g / L
H 4
: 花宝 0 . 3 % + 糖 2% + 2 , 4一 D 0 . 5 m g / L
H S
: 花宝 。 . 3 % + 糖 2% 十 2 , 4二D 1 . o m g / L
H 6
: 花宝 。 . 3 % + 糖 2% + B A o . 5 m g / L 十 50
m l/ L 土豆提取物
H 7
: 花宝 0 . 3% + 糖 2% + B A O . 5 m g / L 十 50
m l/ L 香蕉提取物
H S
: 花宝 0 . 3 % + 糖 2 % + B A o . 5 m g / L 十
1 5%椰汁
W
:
W hi t e 培养基十糖 1 . 5% + B A o . 5 m g / L
液体分化培养基 : 花宝 0 . 3% + 糖 2% + B A
0
.
5 m g / L
固体分化培养基 : 花宝 0 . 3% 十糖 2% + B A
。 . 5 m g / L + 琼脂 1%
生根培养基 : T H + B A O . 5 m g / L + N A A 0 . 1
m g / L 十琼脂 1纬
2
.
2 方 法
2
.
2
.
1 基本培养基对原球茎增殖的 影响试验 将
原球茎分别接人 M 、 T 、 H l 和 W 培养基 中进行液
体培养 , 2 周后 和 4 周后统计原球茎 的平均增殖
率 ,进行比较 . 定时继代 , 记录形成稳定 液体增殖
系所需的时间 .
2
.
2
.
2 激素种类和浓度对原球茎增殖的 影响 试验
将原球茎 分别接人 添加不 同浓度 B A 的 H l 、
H Z
、
H 3 培养基 , 和不同浓度 2 , 4一 D 的 H 4 、 H S 培
养基中 , 并以 H o 作为对照 , 2 周后和 4 周后统计原
球茎的平均增殖率 ,进行比较 .
2
.
2
.
3 天然添加物对原球茎增殖的影响试验 将
原球茎分别接人 H 6 、 H 7 、 H S 培养基 中 , 以 H l 作
为对照 , 分别研究土豆提取物 、 香蕉提取物和椰汁
对原球茎增殖的影响 , Z w 后和 4 w 后统计原球茎
的平均增殖率 ,进行 比较 .
培养条件 : 培养时 40 颗原球茎外植体 /瓶 , 培
养基 p H 5 . 6 , 光照强度 2 0 0 0 一 2 5 0 0 l x , 摇床 转速
10 0 r/ m in
, 温度 23 士 2 ℃ . 每种处理重复 3 次 .
2
.
2
.
4 原球 茎快速分化试验 将大小相近的原球
茎分别接人液体和固体分化培养基中 ,统计原球茎
开始分化所需的时间和分化率 , 记录结果并进行 比
较 . 然后将液体 和固体分化培养基 中的芽分别转
人生根培养基中进行生根实验 ,形成液一固形式和
固~ 固形式的分化培养体系 , 记录结果 , 统计生根
率并进行 比较 .
2
.
2
.
5 计算方 法 增殖率 的计算 方法 : 增殖率
(% ) ~ 已发生增殖的原球茎个数 /原球茎的总个数
* 10 0%分化率和增殖率的算法同增殖率的算法相
同 .
3 结果与分析
原球茎增殖实验
基本培养基 中原球 茎的增殖 结果见表
表 1 不同基本培养基中原球茎的增殖情况
T a b
.
1 P L B s p r o li f e r a t io n in d if f
e r e n t m e d i a
培养基
类型
原球茎增殖率 ( 写 )
Z w 4 w
原球茎颜色形成稳定液体 增殖系所需时间 ( w )
3
:
6
::
晶莹绿色
黄绿色
绿色
深绿
.856
T
H 1
由表 1 可知 , 4 w 时 H l 培养基中原球茎的增
殖率最高 , 而且原球茎的颜色也为正常绿色 , 形成
稳定液体增殖系所需时间最短 ( 图 3 , ① ) ; M 培养
基中的原球茎在 16 w 时才可形成稳定的液体增殖
系 ,所需 时间太长 ; T 培养基中原球茎增殖情况 良
好 ,但原球茎颜色发黄 ,可能是 由于 T 培养基 中 N
元素不足所致 ; W 培养基 中原球茎 在早期增殖较
四川大 学学报 ( 自然科学版 ) 第 4 6 卷
慢 ,但 4 w 后增殖迅速 , 在 s w 时原球茎的增殖率
就可达到 8 7 . 5写 .
3
.
1
.
2 激素种类及浓度对原球茎增殖的影响 结
果见图 1 , 图 2 .
ǎ享à并测臀
时 l司 ( w )
图 1 不 同浓度 B A 对 P L B s 增 殖的影响
F i g
.
1 T h e e ff
e e t s o f B A
e o n e e n t r a t io n
o n P L B s P r o ]i fe r a t io n
由图 1可知 , B A 对秋花独蒜兰原球茎的增殖
有促进作用 ,但浓度不宜过高 , 高浓度 B A 的促进
作 用 低 于 低 浓 度 的 促 进 作 用 , 最 适 浓 度 为
0
.
5 m g / L
.
由图 2 可知 , 添加 2 , 4一 D 的培养基中原球茎的
增殖率低于对照 , 说明 2 , 4一 D 对秋花独蒜兰原球茎
的增殖有强烈的抑制作用 .
3
.
1
.
3 天然添加物对原球茎增殖的影响 结果见
表 .2
表 2 天然添加物对原球茎增殖的影响
T a b
.
2 E f f
e e t s o f o r g a n ie m a t t e r s f o r P L B s P r o l if e r a t io n
原球 茎增殖率 ( % )
培养基 —Z w 4 WH I 5 6 . 7 9 5H 6 4 2 7 0H 7 3 3 、 3 6 3 . 5H S 5 2 . 8 9 4 . 2
目引日J (w )
图 2 不 同浓度 2 , 4一 D 对 P L B s 增 殖的影响
F ig
.
2 T h
e e
ff
e e t s o f Z
,
4
一
D e o n e e n t r a t io n
o n P L B
s P r o lif e r a t io n
由上表可知 ,土豆提取物和香蕉提取物对秋花
独蒜兰原球茎 的增殖都没有促进作用 . 添加椰 汁
在早期对秋花独蒜兰原球茎的增殖没有影响 ,但 6
W 后 H S 培养基 中有部分原球茎开始褐化死亡 ,
不能形成稳定的液体增殖系 .
综上所述 ,在液体振荡培养条件下 , 培养基种
类 ,激素种类及其浓度 , 天然添加物对秋花独蒜兰
原球茎的增殖均有较大影响 ,秋花独蒜兰原球茎液
体快速增殖培养的最佳配方 为 : 花宝 0 . 3% + 糖
2肠+ B A o . 5 m g / L , 稳定的液体增殖 系为每 2 周
继代一次 .
3
.
2 秋花独蒜兰原球茎的快速分化
结果如表 3 .
表 3 两种 方式下原球茎的分化比较
T a b
.
3 P L B s r e g e n e r a t i o n i n t w o e u lt u r e s t y le s
分化芽 生根
培养方式 所需时间
( w )
l o w 时分化率
(% )
所需时间
( w )
10 w 时生 根率
(% )
l o w 时根的长度
( e m )
液 ~ 固
固 ~ 固
8 2
.
3
2 1
.
1
由上表可知 , 液~ 固形式的分化培养体系中 ,
原球茎只需 6 w 即可分化芽 ,将已分化的芽转人生
根培养基 中 Z w 就有生根现象 ; 而固~ 固形式的分
化培养体系中 ,原球茎 10 w 才开始分化芽 ,将分化
的芽转人生根培养基 s w 后才有生根现象 . 液~
固形式的培养体系比固~ 固形式 的培养体系中原
球茎分化芽快 4 w ,生根快 6 w , 整个分化快 10 w ,
说明液~ 固形式可以加速原球茎的分化 ,快速获得
第 2 期 胡晓丽等 :秋花独蒜 兰原球茎液体 快速增殖和分化培养研究
分化的小植株 .
实验中还发现 ,液~ 固培养体系中原球茎分化
的芽较固~ 固培养体系中分化的芽粗壮 , 有壮苗的
作用 ( 图 3 , ②③④ ) .
图 3 原球茎增殖及分化情 况
F ig
.
3 P L B s p r o l if e r a t io n a n d r e g e l、 e r a t io n
① . H l 液体培养基 中原球茎的增殖情况 ; ② . 液体和 固体培养基 中的新生芽 (上面一 行是液体培
养基中的新生芽 , 下面一行是固体培养基 中的新生芽 ) ;③ . 液~ 固分化培养体系与固一 固分化培
养体系中生根 比较 (左面为液~ 固分化培养体 系中的根 , 右面为 固 ~ 固分化培养体 系中的 根 ) ;
④ . 由液体培养基转人固体培养基中待生根的新生芽
3 讨 论
在 1 2/ M S 、 T H 、 花宝和 W ih t e 培养基 中 , 花宝
培养基最适合秋花独蒜兰原球茎的增殖 ,形成稳定
增殖系所需的时间最短且增殖率最高 , 4 w 时原球
茎的增殖率就可达到 95 % , 明显高于 1 2/ M S ( 3 .
5% )
、
T H ( 7 6 % ) 和 W h i t e ( 1 0% ) 培 养基 , 原球茎
形成稳定液体增殖 系所需时间最短的是花宝培养
基 , 为 4 w ,最长的是 1 2/ M S 培养基 , 为 16 w ,相差
1 2 w 的时间 . 所 以说 , 花宝培养基最为秋花独蒜
兰原球茎增殖的基本培养基最大的优点是 : 原球茎
可以稳定增殖 , 且稳定增殖所需的时间最短 . 这主
要是 由于花宝培养基中氮 、 磷 、 钾的比例适 中 ,满足
秋花独蒜兰原球茎增殖的需要 ,是兰科植物组织培
养的一种很好的培养基 .
B A 和 2 , 4一 D 是促进植物外植体增殖 常添加
的激素 , 本试验 中 , B A 对秋花 独蒜兰原球茎的增
殖有促进作用 , 不同浓度 的 B A 促进作用不同 ,其
中以 。 . s m g / L 浓度的 B A 促进作用最大 ,浓度过
高促进作用反而有所 下降 . 但 2 , 4一 D 对秋花独蒜
兰原球茎的增殖却有强烈的抑制作 用 . 这说明不
同的植物对激素 的敏感度不同 , 必须具体分析 ,不
能一概而论 .
天然添加物在此实验 中没有对秋花独蒜兰原
球茎的增殖起到促进作用 ,可能是因为独蒜兰大多
生于树干或岩石上 ,对营养要求较低 ,所 以营养过
于丰富反而不利于其生长 .
关于秋花独蒜兰原球茎的快速分化 ,本研究主
要采用了液体~ 固体结合培养的方式 ,综合了液体
培养和固体培养 的优点 ,使秋花独蒜兰原球茎在液
体培养基 中快速分化芽 ,之后转人固体培养基中生
根 ,这样大大缩短了分化所需 的时间 , 可快速获得
小植株 .
国内外独蒜兰属植物的快繁 已经有了一些相
关报道 , 比如白花独蒜兰的组织培养圈 和独蒜兰的
组织培养 0[] ;滇独蒜兰 以叶 、鳞茎 和种子作为外植
体进行快繁研究 ,结果发现以种子作为外植体效果
最佳闭 ; 毛唇独蒜 兰在 T H + N A A o . 2 m g八 J + 6 -
B A I
.
0 m g / L 的 培 养 基 中 丛 生 芽 的 出芽 率 最
高 l2[ 〕 ; 台湾独蒜 兰愈伤组织 的高频快 繁闭 以及云
四 川大学学报 ( 自然科学版 ) 第 4 6 卷
南独蒜兰种子的无菌萌发研究〔 , 3〕等 , 但这些都是
以固体培养基作为培养基质 的 , 本文采用液体振
荡培养的方式对秋花独蒜兰原球茎的增殖和分化
进行 了研究 , 突出了液体培养 快速 的优点 ,克 服了
单纯固体培养的缺点 ,希望对独蒜兰属其它种的研
究有所帮助 .
植物组织培养技术是兰花实现种苗快速繁殖
的主要方式 ,其突出特点是繁殖速度快 , 能够保持
原种苗的优 良性 状 . 固体培养 的最大优点是操作
简单 ,但缺点是外植体 只有底 部表面能接触培养
基 , 而上部则较难充分吸收养分 ,影响生长速度 6j[ .
液体培养则能让所有的外植体各部分充分而均匀
地吸收养分 、但液体培养的不足主要是氧气和玻璃
化的问题川 . 本实验研究了培养基类型 、 激素种类
及其浓度 、 天然添加物对原球 茎液体增殖 的影响 ,
建立起稳定的原球茎增殖体系 , 同时采用液~ 固体
转换分化培养的形式 ,基本克服了单纯固体或液体
培养的缺点 ,这就为秋花独蒜兰原球茎提供了一条
快速分化的途径 . 但在具体的培养 当中 ,实际上通
气量 、摇床转速 、 光照等因素对培养物也有影响 ,有
待进一步研究 . 本实验 中还发现 : W 液体培养基 中
原球茎呈深绿色 , 而且培养基 也呈绿色 , 有可能是
原球茎在这种培养基中分泌色素 ,此问题也有待进
一步研究 .
随着生物技术的发展 ,人们对兰花的研究已经
从组织培养向诱变育种和转基因研究方面发展 ,而
原球茎正是这些 研究 的重要材料 . 本研究建立 了
秋花独蒜兰原球茎的快速稳定增殖体系和快速分
化体系 ,从这个意义上说 , 本实验不仅对独蒜兰组
织培养和快速繁殖有意义 , 而且对独蒜兰诱变育种
和转基因研究也有重要意义 [ 3〕 .
先 生在实验材料方面的 支持 , 感谢 中科院 昆明植物
研究所的 刘方媛教授给予材料的种名 鉴定 !
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[责任编辑 : 白林含」
致 谢 感谢云 南英茂生物 农业技 术公 司的 范 昆