全 文 ：第 1 6卷 增刊 热 带 作 物 学 报
1 99 5年 1 2 月 CH I NE S E J OU R N AI J OF T R O PI CI AJ CR O PS
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.
1 S 6up p le m e nt
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.
19 9 5
香英兰体细胞培养再生植株的研究 ·
张树珍 曾宪松 郑学勤 陈惠吟 咎 丽梅
(中国热带农业科学院 热带作物生物技术 国家重 点实验室 海 南据州 7 51 73 7 )
摘要 香英兰幼茎在 M s + A B, + N A A S 培养基上培养 40 d , 其表面形成白色 、 团状的愈伤组织 ,
这类愈伤组织可继代培养而增殖 。 愈伤组织在 M S + B ZA 一 3 + N AOA . 5培养基上培养 3 0d 后 形成许
多颗粒状原球茎 , 原球茎可进一步继代增殖 。 将原球茎接种在 l/ Z M S + B A I 十 lB 与 . 5培养基上培
养约 30 d . 原球茎即可发育形成小植株 , 小植株进一步增殖形成丛生芽 。 无根苗在 l/ ZM S 十
I A A : 培养基上培养 20 d 后生根 , 移栽成活率达 10 0 % 。
关键词 香英兰 组织培养 愈伤组织 原球茎 再生植株
中图法分类号 55 7 3 . 9 3Q 43 . 6
香荚兰 ( v an il a lP an i of il a A dn r ) 又名香草兰 。 其主产品是食品工业及化妆品工业 的重
要配香原料 , 是 人工 合成香料及其它天然香料难 以替代的一种名贵天然香料 。
近年来 , 香 英兰的人工栽培 已引起人们的广泛重视 。 国内外生产及研究工作均 已取得了
较大进展 , 商业种植者 已取得明显的经济效益 , 产品仍价高货缺 。 但香荚兰在栽培 过程中 ,
会遭受多种病害的侵害 。 国外 已报道的香英兰病害约 30 种 , 海南也发现一些病害 , 有 的病
害甚至成为某个 地区发展香荚兰的限制因子 〔’ , 2 ] 。 因此培育抗病香荚兰新品种无疑具有 深远
的意义 。
用组织培养方法进行抗源的离体筛选以及抗病基因的转化 , 是培育抗病品种行之有效的
途径 。 关于香荚兰组织培养 国内外文献均有报道 〔3一 7〕 , 主要是通过腋芽一~ 诱导丛 生芽 的
育苗途径进行快繁 。 本研究 i盯过愈伤组织一~ 原球茎一~ 再生植株的方法 , 可为进一步建立
香荚兰基因转化体系提供科学的依据 , 为进一步培育抗病 品种打下 良好的基础 。
1 材料和方法
1
.
1 外植体种类及处理
外植体的种类 : 健康植株的幼叶 、 幼茎 、 气生根 、 花瓣 、 幼果 。
外植体灭菌处理 : 上述各种外植体先用 自来水 冲洗干 净 , 并用 70 % 酒精洗涤 30 5 后 ,
再用 0 . 1% 的升汞消毒 12 im n , 无菌水洗涤 3一 4 次 。
1
.
2 愈伤组织的诱导
将处理好的材料切成 o . cZ m 厚 的薄片 , 叶 片切成 0 . s c m 见方的小块 , 接种在半固体诱
导培养基上 , 置 25 ℃一 28 ℃ 下黑 暗培养 。
收稿 日期 : 19 9 5一 12一 1 2
增刊 张树珍等 :香荚兰体细胞培养再生植株的研究
诱导培养基采用 M S 、 合M s 、 B 。 、 K c 四种基本培养基 , 设有 下列激素组合 :
( 1 ) K ot
一 2 + 2
,
4 一 D I 一 1 0
( 2 ) K ot
一 2 + N A A , 一 。
( 3 ) BOA
一 2 + 2
,
4 一 D l 一 1。
( 4 ) B扬 一 : + N A A , 一 ,。
( 5 ) Z T O
一 : + 2
,
4 一 D , 一 : 。
( 6 ) Z T o
一 2 + N A A I
一 1。
(激素浓度单位为 “岁 m L , 下同 )
1
.
3 原球茎的诱导及增殖
把在诱导培养基上形成的 愈伤组 织转移到原球茎诱导培养 基上 , 置 25 ℃一 28 ℃ 下 , 每
夭在光照 10 0 0 lx 下培养 1 6 h 。 培养基为 M S + BOA 一 5 + N A A o . 5 。
1
,
4 原球茎再生植株
取直径为 。 . 2 c m 大小的原球茎接种 于粤M S + B & . 5 一 。 + I BOA 一 2培养基上 , 培 养条件同一 、`
~ ~
/ 切 “ ’ 一 “ ` 一 / 、 , 曰 J ,J 、 一勺 -一 ~ , ’ 刁 2 ` ’ - 一 一 ` , ’ 〕 一 。 一 ` , 一 ` 一 目 少 ’ 一一 ’ 一 目 户 ’ /` 、 ” ’ 刁
再生芽生根形成完整植株
把在上述培养基上长出的无根苗分割开来 , 接种在生根培养基上培养
。 生根培养基为冬`
M s + N从l , 合M s + I从 1 , 告M s + I B A I , 培养条酮
6 再生植株的移栽
移栽基质为河沙 , 室 内用花盆 , 室外用有 50 % 遮光率的砂床 。
2 结果和分析
2
.
1 愈伤组织的诱导
本实验采用了 4 种基本培养基 , 蔗糖浓度为 3% , 结果以 M S 为基本培养基效果较好 。
香荚兰是典型的兰科植物 , 愈伤组织的诱导较为困难 。 我们对诱导培养基的激素组合作
了大量的实验 , 发现诱导香荚兰愈伤组织 时 , 接种材料对 2 , 4一D 不敏感 , 只在切 口 处有
细胞伸长 , 不久即硬化 、 难于生长 。 而 N A A 在与 B A 配 合使用的条件下能较好地诱导愈伤
组织的产生 , 其中在 M S 十 B A I + N AA S 培养基上产生的愈伤组织量多 , 且质量较好 , 呈 白
色的团状愈伤组织 (见图 1 ) 。
不同外植体对愈伤组织的诱导差别也很大 。 我们采用了气生根 、 幼叶 、 幼茎 、 花瓣 、 幼
果等几种外植体 , 只有幼茎诱导出白色 、 团状的愈伤组织 。 这种愈伤组织生长较快 , 可分成
小块在同样培养基上继代多次 。
2
.
2 原球茎的诱导及增殖
将诱导产生的愈伤组 织或经多次继代的愈伤组织 , 转 移到原球茎分化培养 基上 , 培养
3一4 周后愈伤组织表面产生了许多颗粒状淡黄色突起 , 这些突起进一步 长大 , 形成球形 的
组织 , 这便是香荚兰的原球茎 (见图 2) , 它与某些兰花的原球茎极相似 [“ 〕 。
B A 的浓度对原球茎的形成有很大的影 响 , 其中以 B凡 一 3为最好 , 原球茎的形成率高且
每块愈伤组织形成的原球茎个数为最多 (见表 1 ) 。
增刊 张树珍等 : 香荚兰体细胞培养再生植株的研究
诱导培养基采用 M S 、 合M s 、 B 。 、 K c四种基本培养基 , 设有 下列激素组合 :
( 1 ) K ot
一 2 + 2
,
4 一 D I 一 1 0
( 2 ) K ot
一 2 + N A A , 一 。
( 3 ) BOA
一 2 + 2
,
4 一 D l 一 1。
( 4 ) B扬 一 : + N A A , 一 ,。
( 5 ) Z T O
一 : + 2
,
4 一 D , 一 : 。
( 6 ) Z T o
一 2 + N A A I
一 1。
(激素浓度单位为 “岁 m L , 下同 )
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3 原球茎的诱导及增殖
把在诱导培养基上形成的 愈伤组 织转移到原球茎诱导培养 基上 , 置 25 ℃一 28 ℃ 下 , 每
夭在光照 10 0 0 lx 下培养 1 6 h 。 培养基为 M S + BOA 一 5 + N A A o . 5 。
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4 原球茎再生植株
取直径为 。 . 2 c m 大小的原球茎接种 于粤M S + B & . 5 一 。 + I BOA 一 2培养基上 , 培 养条件同一 、`
~ ~
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再生芽生根形成完整植株
把在上述培养基上长出的无根苗分割开来 , 接种在生根培养基上培养
。 生根培养基为冬`
M s + N从l , 合M s + I从 1 , 告M s + I B A I , 培养条酮
6 再生植株的移栽
移栽基质为河沙 , 室 内用花盆 , 室外用有 50 % 遮光率的砂床 。
2 结果和分析
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1 愈伤组织的诱导
本实验采用了 4 种基本培养基 , 蔗糖浓度为 3% , 结果以 M S 为基本培养基效果较好 。
香荚兰是典型的兰科植物 , 愈伤组织的诱导较为困难 。 我们对诱导培养基的激素组合作
了大量的实验 , 发现诱导香荚兰愈伤组织 时 , 接种材料对 2 , 4一D 不敏感 , 只在切 口 处有
细胞伸长 , 不久即硬化 、 难于生长 。 而 N A A 在与 B A 配 合使用的条件下能较好地诱导愈伤
组织的产生 , 其中在 M S 十 B A I + N AA S 培养基上产生的愈伤组织量多 , 且质量较好 , 呈 白
色的团状愈伤组织 (见图 1 ) 。
不同外植体对愈伤组织的诱导差别也很大 。 我们采用了气生根 、 幼叶 、 幼茎 、 花瓣 、 幼
果等几种外植体 , 只有幼茎诱导出白色 、 团状的愈伤组织 。 这种愈伤组织生长较快 , 可分成
小块在同样培养基上继代多次 。
2
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2 原球茎的诱导及增殖
将诱导产生的愈伤组 织或经多次继代的愈伤组织 , 转 移到原球茎分化培养 基上 , 培养
3一4 周后愈伤组织表面产生了许多颗粒状淡黄色突起 , 这些突起进一步 长大 , 形成球形 的
组织 , 这便是香荚兰的原球茎 (见图 2) , 它与某些兰花的原球茎极相似 [“ 〕 。
B A 的浓度对原球茎的形成有很大的影 响 , 其中以 B凡 一 3为最好 , 原球茎的形成率高且
每块愈伤组织形成的原球茎个数为最多 (见表 1 ) 。
增刊 张树珍等 : 香荚兰体细胞培养再生植株的研究
诱导培养基采用 M S 、 合M s 、 B 。 、 K c四种基本培养基 , 设有 下列激素组合 :
( 1 ) K ot
一 2 + 2
,
4 一 D I 一 1 0
( 2 ) K ot
一 2 + N A A , 一 。
( 3 ) BOA
一 2 + 2
,
4 一 D l 一 1。
( 4 ) B扬 一 : + N A A , 一 ,。
( 5 ) Z T O
一 : + 2
,
4 一 D , 一 : 。
( 6 ) Z T o
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3 原球茎的诱导及增殖
把在诱导培养基上形成的 愈伤组 织转移到原球茎诱导培养 基上 , 置 25 ℃一 28 ℃ 下 , 每
夭在光照 10 0 0 lx 下培养 1 6 h 。 培养基为 M S + BOA 一 5 + N A A o . 5 。
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4 原球茎再生植株
取直径为 。 . 2 c m 大小的原球茎接种 于粤M S + B & . 5 一 。 + I BOA 一 2培养基上 , 培 养条件同一 、`
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再生芽生根形成完整植株
把在上述培养基上长出的无根苗分割开来 , 接种在生根培养基上培养
。 生根培养基为冬`
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6 再生植株的移栽
移栽基质为河沙 , 室 内用花盆 , 室外用有 50 % 遮光率的砂床 。
2 结果和分析
2
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1 愈伤组织的诱导
本实验采用了 4 种基本培养基 , 蔗糖浓度为 3% , 结果以 M S 为基本培养基效果较好 。
香荚兰是典型的兰科植物 , 愈伤组织的诱导较为困难 。 我们对诱导培养基的激素组合作
了大量的实验 , 发现诱导香荚兰愈伤组织 时 , 接种材料对 2 , 4一D 不敏感 , 只在切 口 处有
细胞伸长 , 不久即硬化 、 难于生长 。 而 N A A 在与 B A 配 合使用的条件下能较好地诱导愈伤
组织的产生 , 其中在 M S 十 B A I + N AA S 培养基上产生的愈伤组织量多 , 且质量较好 , 呈 白
色的团状愈伤组织 (见图 1 ) 。
不同外植体对愈伤组织的诱导差别也很大 。 我们采用了气生根 、 幼叶 、 幼茎 、 花瓣 、 幼
果等几种外植体 , 只有幼茎诱导出白色 、 团状的愈伤组织 。 这种愈伤组织生长较快 , 可分成
小块在同样培养基上继代多次 。
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2 原球茎的诱导及增殖
将诱导产生的愈伤组 织或经多次继代的愈伤组织 , 转 移到原球茎分化培养 基上 , 培养
3一4 周后愈伤组织表面产生了许多颗粒状淡黄色突起 , 这些突起进一步 长大 , 形成球形 的
组织 , 这便是香荚兰的原球茎 (见图 2) , 它与某些兰花的原球茎极相似 [“ 〕 。
B A 的浓度对原球茎的形成有很大的影 响 , 其中以 B凡 一 3为最好 , 原球茎的形成率高且
每块愈伤组织形成的原球茎个数为最多 (见表 1 ) 。
热 带 作 物 学 报 6 1卷48
参 考 文 献
林进威 . 名贵香料植物— 香英兰 . 亚热带 植物通讯 . 9 18 1( 1) : 59 一6 1张开 明 , 等 . 海南省香草 兰病害调查初 报 . 热带作物科技 , 19 9 3 ( 3 ) : 17 一 l q
黄光甫 , 等 . 香英兰的组织培养 . 云南热作科技 , 1 9 8 6 ( 3 ) : 28 一 3 0
崔元芳 , 等 . 应 用组 织培荞技术快速繁殖香英兰 . 热带作物学 报 , 19 8 8 , 9 (2 ) : 5。一 63
兰芹英 . 等 . 香英兰 的快速萦殖 . 亚热 带植物通讯 , 19 9 4 ( 1 ) : 52 一5
C K G eo r g e
.
v a n il la p l
a n i f o l i a A n d
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.
1 9 8 4
.
19 ( l )
张 树珍 , 等 . 大 花葱 兰的组织培 养 . 热带作物研究 . 1 9 9 5 ( 4 ) : 26 一28
陈章 良 . 植物基 因工 程的现状 、 前 景及问题 . 生物工程 进展 , 19 89 , 9 ( 3 ) : 20 一29
P L A N T R E G E N E R A T I O N F R O M S O M A T I C C E L L S
V A N I L L A P L A N I F O L I A
Z h a n g S h u z h e n Z e n g X i a n s o n g Z h e n g X u e q in C h e n H u i y i n Z
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,
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A b s t r a C t
Y o u n g s t e m s o f V a n i ll a p l a n i f o l ia w e r e e u l t u r e d o n M S m e d i u m e o n t a i n i n g l
,
O 拼g / m L B A
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.
0 拌g / m I J N A A , a n d w h i t e e a ll i o e e u r r e d i n 4 0 d a y s . S u e h e a l l i e o u l d b e s u b e u l t u r e d m a n y
t im e s fo r p r o p a g a t i o n
.
T h e e a l l i w e r e t r o n s f e
r r e d o n t o M S m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h Z 一 3 拼g /
m L B A a n d 0
.
5 科g / m I J N AA , a n d a la r g e n u m b e r o f p r o to e o r m s w e r e i n d u e e d i n 3 0 d a y s . T h e
p r o t co o r nr s s u b e u l t u r e d o n h a lf s t r e n g t h M S m e d i u m e o n t a i n i n g 1
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0 科g / m I J B A a n d 0
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I B A P r o d u e e d m a n y P la n t l e t s i n 30 d a y s
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p l a n t l e t s
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0 拜g / m l一 I A A a n d a 1 0 0 % s u e e e s s w a s a t t a i n e d i n f i e l d e s t a b li s h m e n t
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