全 文 ：农业生物技术学报 J o un ra l o fA g rie u lt u ra l B iot e e h n o log y 2 00 0, 8 (2 ): 165一 16 8
· 研究报告 ·
用花粉管通道法将新疆大赖草 D N A 导入普通小麦的研究
张茂银 ’ 刘庆昌 ’ 王子段 ’ 赵明安 ’ 缪 军 ’ 海热古丽 ’ 杨克锐 ’ 杨松杰 ’ 顾爱星 ’
( l 新疆农业科学院农业部西北农作物细胞工程重点实验室 , 乌香木齐 83 0 00 ;0
2 中国农业大学植物遗传育种系 , 北京 10 0 94 ; 3 中国科学院新疆化学所 , 乌鲁木齐 830 11)
摘要 : 用花粉管通道法将新疆大赖草 D N A 导入普通春小麦花培品系 76 1 (主穗长 .9 5 c m ) , 在导入后代 D 。 代中筛选出一
个大穗 、 晚熟变异株 , 经常规选育获得大德 (平均主穗长 巧 . 2 c m , 50 个系) 、 多粒的转化后代 。 以地高辛标记的 4 个大麦高
度重复序列克隆为探针 , 对供体 、 受体和转化后代进行 os ut he m 杂交分析 。 结果表明转化后代中出现了受体没有而供体具有
的特异带 , 证 明新疆大赖草 D N A 片段已整合到受体基因组中 。 因此认为外源 D N A 直接导入技术是克服小麦与其近缘野生种
间杂交不亲和性的一条可行途径 。
关键词 : 普通小麦; 新疆大赖草 D N ;A 花粉管通道法 ; 转化后代
In t r o d u e t i o n o f L 骨 ,1 71u s ar e em o s us [(L a m
.
) T z v e l ] D N A s i n t o C o m m o n
W h e at thr o u g h P o ll e n
一
t u b e P at h w a y
z h a n g M ao y i n
,
L i u Q i n g e h an g
, 认值n g z i x i a , Z h a o M i n罗 n , M iao J u n ,
H a i r e g u li
’ 丫妞n g K e r u i , 、 妞n g S o n自ie , G u A i x i n g ,
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,
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C h in a A g ir c u ltu r a l U n iv e r s it y
.
B e ij i
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3 X inj i an g C h e m ic a 1 I n s t i tu te o f C h in e s e A e a d e m y o f S e ie n e e s
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.
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Por g e n y O f t r an s of rm e d Plan t s
,
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一
i n e o m Pa t ib il ity b e t w e e n c o m m o n
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K e y w o r d s : e o m m o n w h e a t ; 介卵 , us ar C e n 子os us D N A : po lle n 一 tu be p at hw 盯 : t arn s fo mr e d p r o只e n y
自周光宇 ( 19 7 9) 提出 DN A 片段杂交的假设 ,
并进行了实践论证 l`, ” 后 , 外源 D N A 直接导入技
术已在植物育种中广泛应用 。 现已进行了大麦 、 芦
苇 、 豌豆 、 玉米 、 高粱和长穗僵麦草等 D N A 向普
通小麦的转移 , 获得了一些变异类型和新品系 `3一 5 , 。
但因导入 的外源 D N A 是未知的 , 缺少特异性的引
物和探针进行分子验证 , 限制了其发展 。 近来用花
粉管途径把 G sU 标记基因 6` , 和大麦黄矮病毒缺失
复制酶基因 闭 导入小麦 , 分子杂交表明 目的基因已
整合到小麦中。 因此应用花粉管途径把小麦近缘野
生种的 D N A 通过片段杂交 (小麦与其近缘野生种有
部分 同源性 ) 导入小麦 (因导入片段较少 、 带入不
张茂银 : 男 , 19 6 2 年生 , 副研究员 , 在职博士生
收稿 日期 : 19 99 一 0 9 一 2 3
利性状较少 , 方便利用 ) , 可能是利用小麦近缘属种
改良小麦的一条新途径 。 198 9 年以来 , 我们以新疆
大赖草 L[ 即n , su ar c cln os su ( L a m . ) T vz le l D N A 为
供体 , 通过花粉管通道法导入普通小麦 , 获得一批
大穗转代后代 , 并用来自大麦基 因组 的探针进行了
分子杂交研究。
1 材料和方法
1
.
1 材料 供体 : 新疆大赖草 L[ 影 , n su ar c em os su
( L am .) T vz le 】。 受体 : 春小麦花培品系 7 61 。
1
.
2 方法
1
.
2
.
1 D N A 提取 采用氯仿一异戊醇法提取新疆大
赖草叶片 D N A , 对所提 D N A 进行紫外检测和琼脂
糖凝胶电泳鉴定 , 并用超声波随机打断供导入 。
农 业 生 物 技 术 学 报 200 0 年
!
.
. 2 2 D A N导入 采用花粉管通道法 , 选取受体正
要开花的穗子去雄套袋 , 3 d 后人工授入受体 自身花
粉并套袋 , 1一3 h 用刀片切去柱头 , 滴加浓度为 3 . 5
林留林L 的 DN A 溶液 6 林L , 套袋自然结实 。 收获当代
种子 (D , 代 ) 。
1
.
.2 3 转化后代田 间种植和观察 D 。、 代种子单粒点
播 , D : 、 D Z 、 D 〕 代…种子均单粒点播为株行 , 按常
规育种程序进行 田间种植 、 管理 、 选择和鉴定 。
1
.
.2 4 分子杂交 以来 自大麦基 因组的 4 个高度重复
序列克隆: pH v 7 16 1、 pH v 7 17 9 、 pH v 7 19 1和 pH v 7 2 9 3
(引 自瑞典 ) ’ 8一 101 经地高辛标记后为探针 , 对供体 、 受
体和 D : 代转化后代大穗株系进行分子杂交 。 受体和
大穗株系取三叶期幼苗 , 供体取幼叶提取 O N A 。 地
高辛标记及杂交参照 B o e 一 h i n g e r M a n n h e im 试剂盒手
册和 S a m b or o k ’川 的方法并略做修改。
结果和分析
供体 D N A 的检测 供体 D N A 经紫外测定 ,
定遗传和正常结实 , 年度间变异也较小 , 在不同世
代和年份都表现大穗 、 多粒等特性 。 同时对转化后
代大穗株系和受体的 5 个穗部性状进行了差异显著
性检验 , 表明两者间有显著差异 (表 2) 。 表明转化
后代大穗等性状变异不是环境因素引起 , 而是由遗
传因素造成 。
.2 3 转化后代的分子验证 4 个大麦基 因组重复
例 A 序列克隆经转化大肠杆菌 、 筛选 、 培养扩增提取质粒 , 酶切电泳回收插入片段 的电泳图谱如图 l
所示 。 质粒 D N A 经地高辛标记后作探针进行 R F L P
分析 。 在多种酶切和探针组合中, 转化后代与受体
之 间有不少相同的带 , 同时也存在显著差异 。 并且
以 p H v 7 一6 1和 p H v 7 17 9 探针杂交多态性较好 。 在
A 、妞 n 一 p H v7 1 61 组合中, 转化后代与受体之 间存在
6 条相同的杂交带 , 但转化后代和供体比受体多一
条 7 0 0 bP 的杂交带 (图 2 ): 在 A v a l 一 PH v 7 17 9 组合
中, 转化后代和供体与受体之 间同样存在这条 70 0
b p 差异带 (图 4 ) ; 在 aB m H l 一 p H v 7 16 1组合中, 转
化后代和供体都有两条杂交带 (2 . 5 k b 和 1 . 4 k b) , 而
受体 7 61 则没有这 2 条杂交特异带 (图 2) ; 在 B am
H 工一 p H v7 】79 组合中, 转化后代与受体同样存在 .2 5
kb 和 1 . 4 k b 带的差异 (图 3 , 4) 。 可见 , 转化后代与
受体 76 1 之间确实存在差异 , 并可被高重序列所探
查 。 因此认为供体 D N A 的高度重复序列片段 已整合
到受体基 因组上 , 其转化后代的株高 、 穗长等性状
变异与上述 3 个特异性杂交带的片段有关 。 但是否
性状变异 由这些片段直接决定 , 尚需进一步研 究。
心`且
,ù,白
具典型核酸吸收峰 , A Z韶A Z。 =l . 87 、 A 26口A Z叫 = 2 . 30 ,
经 电泳检查为一条带 , 无拖尾现象 , 分子量大于 50
kb
, 符合外源 D N A 导入的实验要求。
.2 2 转化后代变异类型 的选育鉴定 19 92 年在 D 3
代 8 9 0 0 株中发现 1株巨大形态变异株 , 表现大穗 、
多粒 、 茎粗 、 叶宽大等特征 , 编号为 92 D 3 一 1。 】9 3
年 D ; 代单粒点播获 2 65 个单株 , 后按常规育种程序
连续种植 , 选育出 1 10 个大穗株系 , 在 0 , 代已基本
稳定 。 并对 5 0 个株系连续 5 年考种 (表 1) , 可见转
化后代大穗株系穗部产量性状有明显变化 , 且 能稳
表 l 新疆大赖草 D N A 转化普通小麦后代和受体花培品系 761 的性状表现
aT b le 1 A g r o n o m ic a l e h a r a e t e
r s o f a e c e P t o r Po l le
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世代
G e n e r a t一o n
株系数
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小穗数
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x : 为 D J 至 D : 的总平均值 ; x · 。 l : 为 76 1 的 5 年平均值: 戈 : vA e r a g e o f n 小 t o . o , : x , 6 . : F i v e y e a r’ 5 a v e r a g e o f 7 6 I
第 2期 张茂银等: 用花粉管通道法将新疆大赖草N A D 导入普通小麦的研究
表 2转化后代和受体农艺性状之间的差异
T al be 2D ie fr e
ne c se b tw e e ne ae c P to
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Poll e nl ie n 6 1 7a n d t he tr a n so fr me P do rg e ny ia ng
ro o n m ie al e hr a
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受体Ae e ep to r 转化后代p rog e ny
性状
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平均数
A 、er ag e
方 差
、乞l r e a ne
样本数
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平均数
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方差
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小穗数
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主穗粒重 /g
K er nel w e ig h灯mal n sP ike
10 3
8 1
.
6
648 9
0
.
14
64
.
9* 16 3
.
93 6 58
2
.
5* 0
.
76 6 58
* 表示受体与转化后代在P 0 。 , 水平达到显著性差异
* 5 l gn i if e a n t d一fe er n e e b ewt e e n th e a e e e P t o r a n d th e tar n s fo mr
e d Por g e n y a t八 。 le v e l
3 讨论
3
. 】 用花粉 管途径 向 小麦导入 其近缘野 生种
D N A 改良小麦的可 行性 大量 实验表 明 , 借助
花粉管通道将外源 O N A 片段 引入胚囊进入合子 ,
从而 直接得到转化种子是完全 可行 的 〕`一 7 , ” ,。 对
于远缘杂交而言 , 亲缘关系愈远 , 同 之『 配对重组
愈难 , 因而 小麦与其多数野生 、 ’ 种难 以有性
杂交 , 既使通过胚拯救等方法 . 手杂种 , 其后代
因含有外源染色体带有有利性状的同时 , 也携入
较多不利性状 , 致使很难利用 。 而小麦近缘野生
种 D N A 片段与小麦 (受体 ) 基 因组部分片段存
在 同源性 , 更易发生杂交重组 ” ’ 。 通过花粉管途
径引入小麦近缘野 生种基 因 , 因携带的不利性状
少 ( D N A 片段小 ) 、 稳定快和 周期短 , 因而将成
为继远缘杂交之 后一条利用小麦近缘野生种的新
途径 。 我们首次用探针杂交的方法 , 证 明该技术
的可行性 。
3
.
2 小麦近缘野生种 D N A 转化小麦后代的变异
特点 1 9 89 年我们把新疆大赖草总 D N A 导入春
麦 7 6 1 , 在 D (, 、 D l 、 D Z 代未出现变异 , 在 D 3 代
发现 1 大穗变异株 。 1 9 9 4 又用 同一方法 重复导
入 , 也在 D 〕 代出现大穗变异株 。 1 9 95 年再次用
同一程序导入 , 又在 D 3 代 出现 5 个大穗变异株
(未发表 ) 。 为什么只在 D 3 代出现大穗转化后代 ,
是否是 D N A 片段在受体中进一步切割酶解直至整
合到同源性较高的区域 , 尚需进一步研 究 。 根据
ve
r s h i n i n 的工作 18一 ’ 。 , , 探针 p H v 7 1 6 1 的序列已清
楚 , 它上面含有 R N A 聚合酶 n 的 5 个盒子和 RN A
聚合酶m 的一个盒子 , 一个带 AT G 密码的 24 bP
长或 21 O b p 长的开放读码框架 , 多聚腺普化位点
( A AAT A
A )
, 类增强子结构 , 反 向重复的两侧有
正 向重复和 回文结构等 , 后面这 些特点又有转座
子的特征 。 D a v id s o n 和 B r i t t e r ( 1 9 6 0 ) 提出重复
序列参与基 因表达调控的假定虽没有明确的证 明 ,
但人 们已接受高重序列在基 因调节中的作用 。 导
入小麦的新疆大赖草 D N A 片段能证 明属 高重序
列 , 而转化后代的大穗是调控作用引起 , 还是同
源 重组造成仍值得探讨 。 但由于转移过程中属 间
高重序列的同源性强 , 产生片段交换重组 的可 能
性大 。
3
.
3 外源 O N A 导入和重复序列的相关性 沈建
华等 ’ 3jJ 对高粱稻 (转化后代 ) 、 高梁 (供体 ) 、 水
稻 (受体 ) 进行重复序列 D N A 复性动力学分析 ,
发现高梁稻基 因组在中度重复序列部分和水稻 (受
体 ) 相比发生了变化 , 翁坚等 ` 2 , 用 M p 7 质粒与受
体重复序列重组导入棉胚 , 以 M P 7 为探针 , 导入
后成熟种子 D N A 经 S o u t h e r n b l o t 杂交证 明 M P 7
整合进入棉花基 因组 中。 中国科学院生化所和 中
国农科院作物所 ” 4] 应用带有卡那霉素抗性基 因 、
在植物中能表达的质粒 PN E 01 5 0 与受体的共同顺
序 (重复序列) 导入棉花和水稻 , 并在转 、 一 代中
测出强的卡那霉素磷酸转移酶活力和抗性 、 _ , 契
交带。 我们的研究也表明 , 重复序列易与受 阵 _
合 ( 已进行 3 次重复实验 ) , 且导入 重复序列片段
小 , 易导入受体 。 在基 因转移中, 有 目地 导入 重
复序列创造农作物新种质 , 可能比导入 目的基 因
更能获得变异后代 。 但重复序列在 D N A 片段杂交
和整合中有什么功能值得探讨 。
16 8 农 业 生 物 技 术 学 报 2000 年
参 考 文 献
图片说明 Ex P la nt a i on oP f lt a e(见附页 )
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图 1 4 个大麦重复序列的电泳图
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6 9 5
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5 15
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3 7 7
,
2 3 7 b p ); 2 : p H v 7 16 1; 3: p H v 7 17 9 ;
4 : PH v 7 19 1: 5: PH v 7 2 9 3
图 2 转化后代大穗株系 、 受体 761 和供体新疆大赖草的
S o u t h e rn b lo t 分析
F ig
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2 S o u t h e rn b lo t an a ly s i s o f th e tran
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7
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10 : 转化后代大德株系: 2 , 5 , 8 , 1 1: 受体 7 6 1: 3 , 6 ,
9
,
12
: 供体新报大赖草 。 所用探针 : p H v 71 61 。 所用内切酶: l , 2,
3二 A姻 D几 4 , 5 , 6 : 兔夕n : 7 , 8 , 9 : 少加 d m ; 10 , 11 , 12 : 石伪功 H l
l
,
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,
7
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,
5
,
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·
7 6 1
,
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,
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12 : d o n o -r L母切us 扭cm os us
.
P r o be : 7 16 1 r e s t r ie t io n e n yZ m e s : l
,
2
,
3:
A va n ; 4
,
5
,
6: 兔户n ; 7 , 8 , 9: 月功d m 二 10 , 11 , 12 : 日月功 H l
图 3 转化后代大穗株系和受体 761 的 S o ut he m bl ot 分析
F 19
.
3 S o u th e rn b lo t a n a ly s is o f t h e t r an s fo rm e d P ro g e n y w ith
la rg e
一 s P ik e
, a e e e Pot r
一
76 1
l
,
3
,
5
,
7
,
9 : 转化后代大穗株系 : 2 , 4 , 6 , 8 , 10 : 受体 7 6 1。
所用探针 : p H v 71 7 9 。 所用内切酶 : l , :2 aS c l , 3 , :4 A 叨 n ; 5,
6注租 I n ; 7 , 8 : 月功 d l ; 9 , 10 : 2劲切 H l
l
,
3
,
5
,
7 : th e t ra n s fo rm
e d P r o g e n y 几 2 , 4 , 6 , 8 : a e e e Pt e r 一 76 1 . Pro be : 7 17 9
.
re s t r ie t io n e n yZ m e s : l
,
2: A四 n , 3 , 4 : gB l fl ; 5
,
6
. 为价Jd l 几 7 , 8 : 石肠用
H I
图 4 转化后代大穗株系 、 受体 761 和供体新疆大赖草的
S o u th e rn b lo t 分析
F 19
.
4 S o u t h e rn b l o t a n a ly s i s o f th e t r a n s fo rm e d P ro g e n y
w i th Ia rg e
一s Pik e
.
ac e e P t o r
一
7 6 1
,
d o n o r
一
L e y m u s rac e m o s u s
l
,
4
,
7
,
10 为转化后代大穗株系; 2 , 5 , 8 , 1 1 为受体 7 6 1: 3 , 6 ,
9
,
12 为供体新疆大赖草 。 所用探针 : p H v 71 79 。 所用内切酶 : I , 2,
3: A阳 1 : 4 , 5 , 6 : 地了n : 7 , 8 , 9 月动 d l ; 10 , 1 1 , 12 : aB m H I
l
,
4
,
7
,
10 : th e ar n s fo rm
e d P ro g e n y 二 2 , 5 , 8 , 1 1二 a e e e Pt o -r 7 6 1; 3 ,6 , 9 , 12
d o n o r
一
L e y m u s ra e e m o s u s
.
Pro be : 7 17 9 re s t r ie t io n e n 即m e s : l , 2 , 3
A va l ; 4
,
5
,
6 : 兔产n ; 7 , 8 , 9 : 扫价Jd m 10 , 1 1 , 12 : sB m H I