全 文 ：莲瓣兰菌根真菌的初步研究
施继惠,李 明
(大理学院,云南大理 671000)
[摘要] 对莲瓣兰的菌根结构和真菌类群进行了初步研究,以期达到保护莲瓣兰种质资源,开发和利用莲
瓣兰的目的。采用徒手切片,在光学显微镜下观察菌根的基本结构,并对莲瓣兰的菌根组织进行真菌分离。
莲瓣兰具有典型的兰科植物菌根构造,在光学显微镜下可以观察到菌根真菌从根被侵入,通过外皮层通道
细胞进入到皮层薄壁组织,在皮层薄壁细胞内形成菌丝团。通过三次分离,共得到196个菌株,这些真菌绝大
多数属于半知菌和子囊菌,共计29属,其中色串孢属(Torula)占30.10%,花顶孢属(Idriela)占11.22%,为绝
对优势菌。
[关键词] 菌根;莲瓣兰;菌根真菌
[中图分类号]Q949.71+8.43[文献标识码]A [文章编号]1672-2345(2006)10-0015-04
[基金项目] 云南省教育厅科研基金资助项目(04Z153B)
[收稿日期] 2006-09-13
[作者简介] 施继惠(1977-),女,云南鹤庆人,助教,主要从事微生物研究.
A PreliminaryStudyofMycorrhizaFungiofCymbidiumlianpanTangetWang
SHIJi-hui,LIMing
(DaliUniversity,Dali,Yunnan671000,China)
〔Abstract〕 Microstructureofmycorhizaandfungalspecieswerestudied.Observationonthemicrostructureofmycorhizaof
CymbidiumlianpanTangetWangdemonstratethatithasthetypicalmycorhizalstructureoforchids.Mycorhizalfungienter
thevelamenandexodermis, invadethecorticaltissuebytheexodermalpassagecelsandthenformpelotons.Isolationhas
beencariedoutthreetimesand196strainshavebeenisolated. ThesebelongtotheClassesFungiImperfectiand
Ascomycete,together29genus;ofthese,thesuperiorgenusareTorula,accountfor30.10% andIdriela,occupy11.22%.
〔Keywords〕mycorhiza;Cymbidium lianpanTangetWang;mycorhizalfungi
兰科植物属被子植物门中的单子叶植物纲,兰
目,兰科,多年生草本,极罕见灌木或攀援藤本,在
我国有近2000年的栽培历史,是园艺花卉中的重要
栽培植物。莲瓣兰 (Cymbidium lianpanTanget
Wang),云南白族和纳西族群众称为“小雪兰”,台
湾兰界称为“卑亚兰”。因其花萼呈三角披针形,花
瓣短而宽并向内曲,犹似荷花的花瓣形,故以花喻
花,称之为 “莲瓣兰”。莲瓣兰主要生长于海拔
1600～2000m的松、杉、栎类的次生林下,分布范围狭
窄,野生资源十分稀少〔1〕。
莲瓣兰因其适应性强,株叶清秀,迎春而开,花
似莲花,色泽秀雅,味馨幽远而驾驭着时代的春风
脱颖而出,它有春兰之香,蕙兰之秀,建兰之蓬勃,
其佳品,无论在株型、花型、花香、花色诸多方面都
可登中国兰花的“大雅之堂”。莲瓣兰因其优异品
质越来越受到国内外兰界的重视,但是,我国栽培
兰花虽有悠久的历史,却一直延续传统的家庭方式
种植,大规模进入商品化生产,比欧洲要晚近一个
世纪〔2〕。近十年来,我国兰花市场上,每隔几年就会
有一种新奇品种,价格被“炒”得扶摇直上,造成
大理学院学报
JOURNALOFDALIUNIVERSITY
第5卷 第 10期2006年10月
Vol.5 No.10 Oct.2006
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“炒兰” 是我国兰花缺乏规模化生产的集中表现。
如今,莲瓣兰实生小草已难寻其芳踪。在大理州,目
前莲瓣兰已形成主要由坝区人工栽培、山区野生资
源极少的局面。保护和开发莲瓣兰种质资源已成为
一项迫在眉睫的工作。为了促进兰花生产,保护野
生兰花资源,在采用法律手段,加强管理的同时,发
展一项有效的大量繁殖技术已刻不容缓,本实验对
莲瓣兰的菌根结构和真菌类群进行了初步研究,通
过研究兰花与菌根的共生关系,探索解决莲瓣兰繁
殖的新途径,为莲瓣兰的生长提供一定的理论基础
和实践经验,最终达到保护莲瓣兰种质资源,开发
和利用莲瓣兰的目的。
1 材料与方法
1.1 材料 盆栽莲瓣兰 (Cymbidium lianpan
TangetWang)的根
1.2 方法
1.2.1 莲瓣兰菌根的基本结构观察 分别从十盆
栽培的莲瓣兰植株采取根样,每盆取三条营养根切
成1cm长的小段,将根样在流水下冲洗干净,用洁净
吸水纸吸其水分,徒手切片,用酸性品红乳酚油染
色后,光学显微镜下观察菌根的形成部位及结构特
点,并照相记录。
1.2.2 莲瓣兰菌根真菌的分离、培养和鉴定 从盆
栽的莲瓣兰植株采取根段,每盆自根尖取5cm左右
的根段3段,洗净泥沙,在流水下冲洗4小时,然后用
75%的乙醇处理20～30s,0.1%的升汞溶液中浸泡5～
10min,对材料表面进行灭菌,无菌水冲洗4～5遍,在
无菌培养皿中横切成3～5mm薄片,置于马铃薯葡萄
糖琼脂培养基中(含有100ppm氯霉素),切面朝向
培养基,每皿放3～4块组织,26.8C恒温培养。经过3～
7d,菌丝从组织块上长出,形成一定大小菌落时(以
组织块为中心向周围进行扩散生长的为分离的目
的菌种),从边缘挑取菌丝移到另一PDA平板,重复
至纯培养,转入斜面保存。(放入4C冰箱中,4～6个月
后观察产孢结构。)
在无菌培养皿中倒入一薄层PDA培养基,待其
冷却后切成1cm×1cm样方块,置于无菌玻片上,挑取
菌丝接种于右下方,盖好无菌盖玻片,26.8C微培养
观察产孢结构并对孢子大小进行测量。
2 结果与讨论
2.1 莲瓣兰菌根的基本结构 菌根和营养根在形
态上没有区别,只有松散的根外菌丝〔2〕。光学显微
镜下观察莲瓣兰根的横切片,基本结构从外至内由
根被组织、皮层组织(外皮层、中皮层和内皮层)及
中柱构成(图1)。根被组织俗称根皮,是由3～4层根
被细胞呈辐射状组成,均为厚壁死细胞(图1)。皮
层组织由多层皮层细胞构成:外皮层细胞单层,细
胞体积较根被细胞大,排列也较规则,其中大部分
细胞的壁增厚(图1),少数具有细胞核、壁薄的活
细胞则为通道细胞(图2);中皮层由5～6层活细胞
组成,壁薄;内皮层细胞单层,具有明显的凯氏带
(图3)。皮层细胞含有大量的针状结晶体,有共生
菌丝分布其中。中柱由中柱鞘和维管束组织组成
(图3)。
根被组织中有大量菌丝和菌丝片断,在通道细
胞附近菌丝聚集的更加密集(图2),而通道细胞中
定殖的菌丝进一步向皮层细胞扩散,说明通道细胞
可能是菌根真菌侵入兰根皮层细胞的通道。近年来
有研究报道,真菌菌丝之所以能够侵入兰根,可能
是通过成年兰根的外表皮的通道细胞〔3〕或是通过
破坏根被组织和外皮层细胞来实现的〔4〕。本次实验
中也观察到了菌丝侵染根被组织(图4)。皮层细胞
在兰根中占最大的比例,细胞内有大量形状不规则
的菌丝,而在感染程度较高的根段,整个皮层薄壁
组织都布满了菌丝团或菌丝结(图3)。皮层细胞中
的菌丝团还通过菌丝穿越细胞壁而侵染另一细胞,
并再次形成菌丝结(图3)。菌根真菌通常不侵染兰
科植物的维管束中柱〔3〕。
图1 莲瓣兰菌根横切面(×40)
Fig.1Thecross-sectionofmycorhizaof
Cymbidium lianpanTangetWang
大理学院学报总第34期 自然科学
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图2 外皮层和通道细胞(×400)
Fig. 2 Exodermis and Passage cell
图3 内皮层细胞(×200)
Fig. 3 Endodermis and Vacular bundle sheath
and Pith.
图4 菌丝侵染根被组织 (×200)
Fig. 4 Velamen infected by Fungi
注:VE.根被;EX.外皮层;P.通道细胞;CO.皮层;EN.内皮
层;H.菌丝;IN.染菌皮层细胞;VS.中柱鞘;Pi.髓;
VE.Velamen, EX.Exodermis, P.Passage cell, CO.
Cortex, EN.Endodermis, H.Hyphae, IN.Cortical cells
infected by fungi,VS.Vacular bundle sheath,Pi. Pith.
兰科植物菌根形成除了通过根侵入,即菌丝通
过外皮层薄壁通道细胞或破坏根被组织和外皮层
细胞侵入皮层细胞,形成内生菌根外〔5〕,还可以通
过种子侵入,即兰科植物种子发芽形成原球茎,菌
丝首先侵入原球茎柄状细胞,但不形成菌丝团,在
外皮层中形成菌丝团,后来感染到内皮层。但不论
通过何种途径,菌根形成的标志即是皮层细胞中出
现菌丝团〔3〕。通过观察,老根几乎100%被感染,而嫩
根很少被感染。根尖伸长区产生兰酚,抵制真菌的
侵入,所以这部分的菌根真菌很少〔6〕。菌丝从根的
表面侵入,进入外皮层后进一步进入皮层薄壁组
织。在寄主根系的皮层薄壁细胞内,真菌的菌丝呈
螺旋线团状或结状,真菌会进一步再感染相邻的皮
层细胞。感染程度较高的根段,整个皮层薄壁细胞
都布满菌丝团或消解的菌丝结〔7〕(图3)。
2.2孢子的直径及大小 真菌的繁殖能力一般都
很强,而且方式多样化,如菌丝碎片就能增殖。然而
在自然界,它们往往通过无性或有性的孢子来达到
繁殖的目的。真菌的孢子对其传布和繁殖固然重
要,但对于人们认识它们显得更为重要。因为不同
种类的真菌,其孢子形态或产生孢子的器官多有不
同程度的差异,所以真菌的分类,几乎大部分是根
据孢子或产生它们的器官为主要特征而进行的。本
次试验随机对木霉属(Trichoderma)的五个菌株进
行抽查测量100个孢子的大小,并对其中的LP161菌
株的产孢结构进行显微摄影(图5) ,结果发现:孢
子大小的数 值 范 围LP78菌 株 为2.4～ .0×2.0～
3.0μm;LP99菌株为2.4～5.8×1.8～4.0μm;LP134菌
株为2.0～4.2× .0～3.6μm;LP161菌株为2.0～3.6×2.0～
2.8μm;LP195菌株为2.4～ .2× .0～3.0μm。五个菌株
孢子的大小:2.0～5.8×1.8～4.0μm,与魏景超先生
《真菌鉴定手册》中的木霉属孢子大小相符。
施继惠,李 明 莲瓣兰菌根真菌的初步研究 第5卷总第34期
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图5 LP161菌株产孢结构(×400)
Fig.5ConidiaofthestrainLP161
2.3 不同根样上获得菌株的情况及真菌的鉴定
本次实验主要以菌落的形态特征、菌丝及产孢结
构、孢子大小等为主要鉴定依据对莲瓣兰菌根真菌
进行了分类鉴定。对从莲瓣兰根中分离出来的196
株真菌进行一系列的鉴定,初步得出下列结论:从
莲瓣兰根中分离到的196株真菌主要属于半知菌类
和子囊菌,共计29属。半知菌类183株,占93.37%,子
囊菌纲毛壳菌属(Chaetomium)13株,占6.63%。半
知菌(FungiImperfecti)球壳孢目(Phylostictales)
24株,其中盾壳霉属(Coniothyrium)12株,占6.12%;
革壳孢属 (Catinula)4株,占2.04%;毛茎点霉属
(Chaetophoma)3株 , 占 1.53% ; 疡 壳 孢 属
(Dothichiza)、壳多孢属(Stagonospora)、壳蛇孢属
(Phlycatena)、小星壳孢属(Asteromela)各1株,各
占0.51%;丛梗孢目(Moniliaceae)154株,其中色串
孢属(Torula)59株,占30.10%;花顶孢属(Idriela)
22株,占11.22%;头珠霉属(Oedocephalum)16株,
占8.16%;木霉属(Trichoderma)15株,占7.65%;轮
枝孢属 (Verticilium)11株,占5.61%;黑乌霉属
(Memnoniela)10株 , 占 5.10%; 孔 球 孢 属
(Gilmaniela)4株,占2.04%;青霉属(Penicilium)3
株,占1.53%;葡萄孢属 (Botrytis)、链毛孢属
(Streptothrix)、蛹孢属 (Helicoon) 各2株,各占
1.02%;林柄霉属 (Paathramela)、节丛孢属
(Arthrobotrys)、色疣节梗孢属(Gonatobotryum)、
镰孢属(Fusarium)、黑团孢属(Periconia)、冠孢属
(Stephanoma)、假丝酵母属(Candida)、刚毛菌属
(Lacelina)各一株,各占0.51%;无孢菌群共有5株,
均为丝核菌属(Rhizoctonia),占2.55%。范黎、郭顺
星1998年报道,兰科菌根菌主要是子囊菌、担子菌
和半知菌,本次实验从莲瓣兰菌根中分离到的真菌
主要为子囊菌和半知菌,其中色串孢属(Torula)和
花顶孢属(Idriela)为绝对优势种。
本次实验分离到的真菌大多只鉴定到属,而没
有鉴定到种。目前兰科菌根真菌的分类和鉴定还主
要依靠形态学的方法,而形态学的鉴定基础是有效
诱导形成产孢结构。但菌根真菌与一般腐生真菌不
同,有性态诱导在实验条件下很难完成,需要一些
特殊诱导物质才能使子实体形成,因而诱导不易成
功。本次实验也采取了几种方法进行了真菌有性态
的诱导,但结果不理想,希望在以后的实验中进行
进一步菌根真菌有性态诱导的研究,摸索出一种有
效的有性态诱导方法。并且在采用传统方法的同
时,辅以分子生物学手段,并结合计算机分析技术,
将菌株尽可能的鉴定到种。
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