全 文 ：西北农业学报 9 19 4, 3 ( 1 ) : 9~ 1 2
A e t a A g r ie u l t u r a e B o r e a l i
一
oc e id
e n r a l is S in i e a
二棱大麦与豌豆原生质体融合的研究 ’
吴 耀 武
(西北植 物研 究所 陕西物 陵 7 1 2 1 0 0 )
摘要 对二 枝大麦 白 色胚性 无性 系细 胞 与妮豆 妹 色叶 冈细胞 原生 质体 , 在 P E G 和 C a一 的共
同作 用下 ,异源 融合研究结朱表明 : 将含有 2 0 nr n 飞0 1 C a C 12 . ZH ZO 白) 0 . 3 nr L 和 0 . Z n 飞。 ! P E G ( 2 0 0 0 )
溶液 酒入 0 . l m l 二枝大 麦与碗 豆 原生质 体 混合物 中 。 ( 原生质 休 密度 为 l 丫 1。 , /m l ) , 辞五 15 m i l、 后
得 到 37 . 45 写高频率异源原生 质体融合 。
关键词 二枝大 麦 ; 碗 豆 ; 原生 质体 ; 细胞触 合
自从 C ar ls on , P . 5 . 等首次用 N a N O 3 诱导种间烟草体细胞原生质体融 合 ,并培育出第 1 株
种间体细胞杂种植株〔 , 〕以来 .用诱导异源植物体细胞原生质体融合 ,进行远缘体细胞杂交和胞
质基因的重组培育良种 , 引起了人们的极大关注并取得很大进展 〔健〕 。 除电融合技不正在深入探
讨外 二3 , ,化学诱导融合技术仍广为选 用 〔` ’ 。 本又报道二棱大麦体细胞胚性无性系的原生质体与
豌豆叶肉原生质体超远缘异源融合的结果 。
1 材料与方法
豌豆 ( P is “ m : at l’v u ;lI ) 为栽培品种鸽子灰 , 于室内盆栽育苗 , 苗高 1 0 一 20 。 m 时琅幼嫩叶
片做试材 。大麦 (H Or d e “ m id slt’ clJ o,l , 21 ~ 24 )为农家品种二棱人麦 ,经幼胚培养沂获得的体细
胞胚性无性系 , 在分离原生质体前转在 M S 基本培养基中并附加水解酪蛋白 5 0 m ! / L 、 L 一 天
门冬酞胺 1 50 m l/ L 和 2 . 4一 D 0 . 5 m g / L 的琼脂培养基中 ,继 代培养的 二5 ,胚性无性 系 。
豌豆叶肉原生质体的制备方法和程序与参考文献 6 的万法一样 。 但酶液由 2%的纤维素
酶 ( 自制 , E A 3一 8 6 7) + 0 . 2 %果胶酶 + 1 1 . 8%葡萄糖 + 20 m m ol C a d Z · ZH ZO 组成 。 酶解时间 :
25 士 1℃ , s h 。 大麦原生质体的制备 ,用继代转移后培养 12 ~ 14 天的材料 。 原生质体的制备方
0(),一Q`O
0`
0``nq
.…0In,`月B
法和程序与参考文献 7 的方法一样 。 但酶液
由 2 %纤 维 素酶 ( 自制 , E A 3 一 8 6 7 ) + 0 . 5 %
O n o z u k a R
一
1 0 + 0
.
5%果 胶 酶 + Z o m m o l
C o C I
: ·
ZH
Z
O + 1 1
.
8肠葡萄糖组成 。 酶 解时
间 : 2 5℃ , 静置 2 1 h 。
2 种材料分别酶解后 , 经 4 0 目不锈 钢
丝网过滤收集原 生质体 , 并用含有 20 m m ol
C a 1C
2
.
ZH
Z
O 和 1 1 . 8 %的葡萄糖洗涤液洗涤
表 1 大麦与豌豆原生质体融合溶液 的组成
T a b l e l ,l
.
h e f u s一o n 、 。 一u t孟0 0 c o 且甲 。 `一 e 班一 5 o f P 一劝丈。 -
p l a s t ,’ r o 一n 户I o r汀 e` m d i s . i c n o’ l u Jl o l , 15“ i ,l ` u ` i一 u m
融合剂 P E G C a C I: · Z H ZO D 一甘露搪醇
F u s io n ( 2 0 0 0 ) D
一入l a n r zt o l
50 l u r
一o n ( m o l ) ( m u l ) ( m o l )
并浓缩至原生质体密度为 l x l丁 / m L 。 然后将 2 种原生质体等量混合成悬浮液进行融合研究 。
按试验设计在原生质体混合悬浮液中加入融合剂后在显微镜下镜检 。 异源原生质体的融 合是
9 2 年 自然科学羞金项 目 ,本所 付杰 先生未 加邵 分工 作
1 9 9 3一 0 8一 0 5
l9期省日西稿陕收
·1 0
· 西 北 农 业 学 报3 卷
以白色 (大麦 )和绿色 (豌豆 ) 2种原生质体紧密粘连呈卵形或球形为准 .统计异源原生质体融
合率 .原生质体的洗涤液与悬浮液组成为0 .m 2ol的 Ca C I: · ZH ZO+1 1 .8% 葡萄糖 , p H S . 7 。
2 结果与分析
2
.
1 原生质体的制备与异源融合
大麦原生质体是用转移再培养 12 ~ 14 夭的胚性无性系的组织 ( 图版 I , 1 ) ,经酶解后用洗
涤液洗涤除去酶液再经浓缩制取的 。 所获得的原生质体为球形 , 白色 ,质浓 ,质丝清晰 (图版 l ,
2 )
, 显示旺盛活力 。豌豆原生质体的分离制备 :将幼嫩叶片撕去下表皮 , 叶肉组织于酶液中酶解
除去细胞壁 , 分离的原生质体经洗涤浓缩后为球形 , 鲜绿色 . 叶绿体分布于球体周边 ,显示旺盛
活力 (图版 I , 3 ) 。 2 种原生质分别浓缩至 I X 1 0 , /m L , 再等量混合成混 合悬浮体 ,在显微镜下
从色泽即可分辨 出每个原生质体是来源于大麦还是豌豆 。
在室温条件下 , 将 2 种原生质体混合悬浮液滴加于凹型载玻片上 , 并滴加 3 倍混合悬浮液
量的融合剂 B Z ,在显微镜下发现原生质体聚合并粘连呈哑铃形 。 从 2 种色泽即可分辨出是异
源原生质体粘连还是同源原生质体粘连 。 随着观察时间的延长 ,异源原生质体的粘连体逐渐加
深 (图版 I , 4) 并变成卵形 (图版 I , 5 , 6) ,进而内含物开始混合 , 2 原生质体的界面消失 , 呈现
球形 。 但从内含物的色泽仍可清楚地确定是已完全融合的异源原生质体 (图版 I , 7 ) . 此时滴
加洗涤液不但不能使紧密粘连的异源原生质体分开 , 而且加速卵形向球形的转化 。统计紧密粘
连 ( 图 I , 4) ~ 完全球形的异源融合体 (图版 I , 7) 数占大麦原生质体总数的百分率约为 15 %
左右 ,其中完全呈球形者为 5 % .
2
.
2 影响异源原生质体融合的几种因素
2
.
2
.
1 不 同融合剂的 效 果 取大麦和豌豆原生质体混合悬浮液 0 . 1 m l 滴于凹型载玻片上 ,
加入融合剂 B , .0 1 m l ,镜检发现 , 有大麦与大麦 、 豌豆与豌豆的同源融合 , 也有异源融合 ,但统
计结果 , 其异源融合率不足 1% , 而加入 B Z 的为 5 . 6% ; 加入 B 3 的为 3 . 5% ; 加入 B ; 的为
4
.
8 %
。 表明 B Z 较适宜 , 对原生质体的损伤小 ,异源融合率高 .
2
.
2
.
2 融合剂滴加童的效 果 取 3 张凹型载玻片 , 每张滴大麦 、 豌豆原生质体悬浮液 0 . l m l ,
然后分别滴加 0 . 1 、 0 . 2 和 0 . 3 m l B Z 融合剂 , 镜检结果 , 异源原生质体的融合率分别为 5 . 3% 、
7
.
8%和 8 . 5% 。 可见原生质体混合悬浮液与 B : 的滴加量按 1 : 3 较为适宜 。 P E G 总浓度为
0
.
15 m ol 对原生质体损伤较小 , 异源融合率较高 。
2
.
2
.
3 原生质体的静笠沉降对异源融合率的影响 取 2 张载玻片 ,按前法滴原生质体混合悬
浮液 0 . 1 m l 于载玻片上 , 室温静置 3 m in ,待大部分原生质体开始下沉时 , 再分别滴 。 . 3 ml B Z
和 B ; , 镜检结果 , B Z 诱导的融合率为 23 . 8 % , B ; 为 17 . 7 % . 可见原生质体静置沉降不仅选择了
优质的原生质体 , 而且大大提高了异源诱导融合率 。
2
.
2
.
4 p H 值对异源融合的影响 按前法分别取 0 . l ml 原生质体混合悬浮液滴于载玻 片上 ,
静置 3 m i n ,再分别滴加 o . 3 m l p l王各为 3 . 5 、 5 . 8 和 7 . 0 的 B : 和 B ; , 室温静置融合 1 5 m in , 镜
检结果 (表 2 ) , 融 合剂 中的 p H 值 对 原生 质体 的融合具 有 明 显 作用 , 异 源融 合率达
3 5
.
6 5 %一 3 7 . 4 5 % 。
1期 吴耀武 二棱大麦与豌豆原生质体融合的研究
表 2融合剂的 l Pl 值对融合频率的影响
Tal beZ E f fe eto f fs uin o s ol ution
l sl l Pn r o ato e f fus in o
B ZB
.
p H— — 3 .5 5 . 7 7.0 3 .5 5 . 7 7.0融合数 /原生质体数 No . fus io / No . Pr or o Pl s at融合率 (环 ) Rat eo f fs uion 20 /25 0 94 /25 1 3 4 /268 3 2 /2 42 9 9/5 2 85 6 /2 763 7. 45 12. 68 1 2.5 85 3 .5 6 20 . 28综上各单项试验结果我们认为 :将 l x l 。 , 个原生质体 / m L 密度的大麦与豌豆原生质体混合悬浮液滴于载玻片上 ,静置 3 m in ,再滴入 3 倍量的 B : ,室温静置 巧 m in , 是获得大麦与豌豆原生质体异源融合的最佳 条件和技术程序 。
3 讨论
为了有效地大量培养融合后的异核体 ,必须提高一对一的诱导融合率 。 本研究结果表明 ,
融合率除与原生质体质量密切有关外 ,其数量和 密度也十分重要 。 在原生质体混合悬浮液 中 ,
原生质体总数 < l x l os 个 / m L 的融合率极低 (不足 1% ) , 1 又 10 . 个 / m L 则往往形成多个原生
质体融合 , 只有 l x l丁 个 / m L 得到良好的结果 。
选择较佳的融合剂及加入量是实现异源 融合和提高融合率的关键 。 K ao , K . N . 等川用
5 0% P E G 诱导异源原生质体聚合 , 再用 p H 9 . 5 的钙离子溶液洗涤实现融合的方法 目前使用
较多 。 为了减少 P E G 和高 p H 对原生质体的损伤 ,笔者对以 P E G 为主的融合剂组成 、 p H 用量
和其它影响条件的研究结果表明 , 以 P E G ( 2 0 0 0 ) 0 . 2 m o l与 2 0 m m o l C a C 12 · ZH ZO 为融合剂 ,
p H 5
.
7
,处理二棱大麦与豌豆原生质体混合悬浮液 ,使 P E G 最终浓度为 0 . 15 m ol , 加入融 合剂
1 5 m in
, 一对一的异源原生质体的融合率达 37 . 45 % 。
参 考 文 献
C a
r
lso n P S 以 al . P a r a se x u a l i n t e r s伴 e i fi e p l a n t 卜y b r id iaz t i o n . P r oc . N a t l . A c a d . cS i . U S A 1 9 7 2 , ( 6 9 ) : 2 2 9 2
孙勇如 . 植物体 细胞 杂交的进展 . 生物 工 程学报 , 19 89 . 5( 3) : 19 1 ~ 19 4
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K a o K N et 以 . P la n t p r o t o p la s red f u s i o n a n d g or w t卜 o f i n t e r g e n e r i e }一y b石d c e l l s . P la n t , 1 9 7 4 , ( 1 2 0 ) : 2 15
1 2西 北 农 业 学 报 3卷
THE S TU D YO N THE R PO TO P A LSF TU SIO NOF H口 R DU E M
刀绍 TIC H口 N, Z n = 2 4 A N D P IS U M S A T I V U M
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A il S T R A C T
I n r h is p a p e r
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图 版 说 明
1 二棱大麦胚 性无 性系愈伤 组 织
2 来源于大麦胚性无 性系的原生质体样
3 豌 豆叶 肉原生质 体群
4 紧密粘连的异源原生质体
5一 7 大 麦与豌互 异源原 生质 体的融 合
E x P l a n a t io n o f P l a t e
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4 A d去l e s一v e a l lo g e 一、 o L一s p r o 丫o p la s t
5一 7 F u s , 。 n o f a l lo g e n o u s p r o r o p la s r s o f 厅.o d ` u用 汀 152“ 六。 ” a n d P i s u,n s以万u u功