全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(2): 207213 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA100501), 陕西省自然科学基础研究计划重点项目(2013JZ007), 中央高校基
本科研业务费(QN2011001)和西北农林科技大学唐仲英育种基金资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 赵继新, E-mail: zhjx881@163.com
第一作者联系方式: E-mail: wangxiujuanluck@163.com
Received(收稿日期): 2014-06-09; Accepted(接受日期): 2014-12-19; Published online(网络出版日期): 2014-12-29.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20141229.0956.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00207
小麦–华山新麦草异代换系 DH2322的分子细胞遗传学鉴定
王秀娟 陈新宏 庞玉辉 敬 樊 张 军 胡思远 昝 凯
武 军 杨群慧 赵继新*
西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100
摘 要: 利用分子标记、细胞学、基因组原位杂交(GISH)等技术, 结合田间农艺性状调查, 对小麦–华山新麦草七倍
体材料 H8911与硬粒小麦 D4286杂交 F4代分离群体中株系 DH2322进行了综合鉴定。华山新麦草基因组特异 SCAR
标记鉴定表明, DH2322含有华山新麦草遗传物质; 细胞遗传学观察显示, DH2322染色体构型为 2n=42=21 II; 有丝分
裂和花粉母细胞减数分裂中期 I基因组原位杂交(GISH)鉴定表明, DH2322的染色体由 40条小麦染色体和 2条华山新
麦草 Ns染色体构成, 且 2条 Ns染色体能完全配对为一个二价体; SSR和 STS分子标记分析表明, DH2322缺失小麦
D基因组的 2D染色体, 而含有华山新麦草的 2Ns染色体; 农艺性状分析结果表明, DH2322具有双亲的形态学特征,
结实性好, 穗长和穗粒数显著大于亲本。
关键词: 普通小麦; 华山新麦草; 异代换系; SCAR; 基因组原位杂交(GISH); SSR; STS
Molecular Cytogenetics Identification of a wheat Psathyrostachys huashanica
Substitution Line DH2322
WANG Xiu-Juan, CHEN Xin-Hong, PANG Yu-Hui, JING Fan, ZHANG Jun, HU Si-Yuan, ZAN Kai, WU Jun,
YANG Qun-Hui, and ZHAO Ji-Xin *
College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, China
Abstract: A wheat–P. huashanica alien substitution line DH2322 was isolated from the F4 progeny of heptaploid hybrid H8911 ×
Triticum durum cv. D4286 and identified by using SCAR markers, genomic in situ hybridization (GISH) , SSR markers, and STS
markers. The results using SCAR marker RHS141 showed that DH2322 carrys chromosome derived from P. huashanica. Cyto-
genetics observation indicated that DH2322 has a chromosome karyotype of 2n = 42 = 21 II. GISH showed that DH2322 is a line
with 40 chromosomes from wheat and two Ns chromosomes from P. huashanica, which formed a ring bivalent at metaphase I in
pollen mother cells (PMC). According to SSR and STS analysis, the wheat chromosome 2D in DH2322 was substituted by the
chromosome 2Ns from P. huashanica. Evaluation of the agronomic traits showed that DH2322 presented favorable agronomic
traits in spike length and kernels per spike. Development of this new germplasm will be useful for wheat breeding programs in the
future.
Keywords: Triticum aestivum; Psathyrostachys huashanica; Alien substitution line; SCAR; GISH; SSR; STS
华山新麦草(Psathyrostachys huashanica Keng,
2n=14, NsNs) 是 禾 本 科 (Gramineae) 、 小 麦 族
(Triticeae)、大麦亚族(Hordeinae)、新麦草属(Psath-
yrostachys)多年生异花授粉植物, 具有抗寒、抗旱、
耐瘠薄、早熟、优质、矮秆、抗病等优良特性[1], 仅
分布于我国秦岭山脉陕西华山段, 是我国特有种[2],
也是小麦(Triticum aestivum, 2n=14, AABBDD)品种
改良的优异种质资源。越来越多的研究者开始将研
究目标瞄准华山新麦草的利用并取得了一些进展。
Kang等[3-4]利用中国春 ph2b基因突变体和华山新麦
草杂交获得了含有 ph2b基因的衍生后代、并利用面
包小麦“J-11”和华山新麦草杂交获得一个八倍体属
208 作 物 学 报 第 41卷

间杂种 PHW-SA (2n=8x=56, AABBDDNsNs)。Wang
等[5]研究发现华山新麦草 3Ns 染色体上携带抗小麦
条锈病的基因, Kang 等[6]将华山新麦草 3Ns 染色体
导入小麦, 获得了抗条锈病的小麦-华山新麦草中间
材料。另外, Liu等[7]和 Wang等[8]利用简单重复序列
标记(simple sequence repeats, SSR)技术对华山新麦
草种群基因的多样性进行了分析。
本课题组自 20 世纪 90 年代初开始进行普通小
麦品种 7182与华山新麦草的杂交研究, 选育出普通
小麦 –华山新麦草七倍体材料 H8911 (2n=49,
AABBDDNs)[1]。在此基础上, 侯文胜等[9]、傅杰等[10]、
赵继新等 [11-13]、武军等 [14]利用细胞遗传学对小麦-
华山新麦草异附加系、异代换系进行了分子细胞遗
传学方面的研究; Du等[15-20]选育出一批附加华山新
麦草 2Ns-7Ns 染色体的小麦–华山新麦草二体异附
加系 ; 王秀娟等 [21]获得一个附加两条华山新麦草
7Ns染色体的矮秆材料 12DH25。
本研究以小麦–华山新麦草七倍体材料 H8911
与硬粒小麦品种D4286杂交的 F4分离群体中筛选的
株系 DH2322为材料, 从细胞遗传学、分子标记和农
艺性状等方面对其进行研究, 以了解其遗传行为、
染色体构成、所含华山新麦草染色体的同源群归属
及形态特征等, 为小麦品种改良和染色体工程育种
提供新的种质资源。
1 材料与方法
1.1 供试材料
普通小麦品种 7182、华山新麦草 (Psathyros-
tachys huashanica)、倍半二倍体 H8911 (2n=49,
AABBDDNs) 及 其 与 硬 粒 小 麦 (Triticum durum,
2n=28, AABB)品种 D4286 杂交并回交后选育的 F4
代材料 DH2322 均来自陕西省植物遗传工程育种重
点实验室。
1.2 农艺性状调查
2012 年 10 月和 2013 年 10 月于西北农林科技
大学试验田种植供试材料, 调查田间农艺性状和室
内考种, 统计株高、旗叶面积、穗下茎节长度、穗
长、小穗数、穗粒数和结实率。用 SAS软件分析数
据和检验差异显著性。
1.3 DNA提取
采用 CTAB法[22]提取普通小麦品种 7182、华山
新麦草、硬粒小麦品种 D4286、普通小麦–华山新麦
草七倍体材料 H8911及 DH2322的基因组 DNA。
1.4 华山新麦草 Ns基因组特异 SCAR标记鉴定
为提高小麦背景中华山新麦草染色质的鉴定效
率 , 根据 Du 等 [23]开发的华山新麦草染色体特异
SCAR 标记 RHS141, 以 7182、D4286、DH2322、
H8911和华山新麦草基因组 DNA为模板进行扩增。
在 PTC-200扩增仪上进行 PCR, 20 μL总反应体系包
括 10×buffer (含 Mg2+) 2.0 μL、引物 RHS141 (2.5
μmol mL–1) 2.0 μL、模板 DNA (200 μg μL–1) 2.0 μL、
dNTP (2.5 μmol mL–1) 1.6 μL、Taq DNA聚合酶(5 U
μL–1) 0.2 μL、ddH2O 12.2 μL。PCR程序为, 94℃预
变性 3 min; 94℃变性 50 s, 60℃复性 40 s, 72℃延伸
1 min, 35个循环; 72℃最后延伸 10 min, 4℃保存。以
1%琼脂糖凝胶 135 V恒压条件下电泳 30 min, 溴化
乙锭(EB)染色, 显影后照相观察。
1.5 细胞遗传学分析
将种子于室内浸泡至露白, 转移到垫有湿润滤
纸的培养皿内发芽。当根长至 1~2 cm时, 用镊子夹
取根尖放入 0~4℃冰水中预处理 24 h, 卡诺氏 I固定
液(无水乙醇∶冰醋酸= 3 1)∶ 固定, –20℃冰箱保存。
45%醋酸洋红染色压片, 用 Olympus BX60显微镜观
察根尖细胞染色体数, 并照相。
从田间取适龄幼穗 (旗叶与倒二叶距离约为
4 cm), 用卡诺氏 II 固定液(无水乙醇∶氯仿∶冰乙
酸= 6 3 1)∶ ∶ 固定 , 45%醋酸洋红染色压片 , 用
Olympus BX60 显微镜观察花粉母细胞减数分裂中
期 I (PMC MI)的染色体构型, 并照相。
1.6 基因组原位杂交(GISH)
将 DH2322 的根尖和幼穗固定一周后用体积分
数 45%醋酸压片, 液氮揭片, 备用。
依照 Dig-Nick-Translation Mix 试剂盒(Roche,
Germany)产品说明书对华山新麦草的全基因组
DNA进行标记(4 μL Dig-Nick-Translation Mix, 1 μL
华山新麦草 DNA (1000 μg μL–1), 加 ddH2O 至
20 μL)。参照 Han 等[24]描述的方法进行原位杂交。
每张制片加 40 μL杂交液, 该液含探针DNA 100 ng、
100%去离子甲酰胺 20 μL、50% (w/v)硫酸葡聚糖
8 μL、20× SSC 4 μL、ssDNA (鲑鱼精 DNA, 5 μg μL–1)
1 μL、10% (w/v)十二烷基磺酸钠 1 μL、加 ddH2O至
40 μL。在 Hybrite原位杂交仪上进行杂交反应, 75 ℃
6 min, 然后 37 16 h℃ 以上。用荧光素(FITC)检测杂
交信号, 洗脱后用 PI复染及 H-1300 (抗退色剂)封片,
OLYMPUS BX60荧光显微镜观察检测, Pixera Pen-
guin 150CL CCD成像系统照相。
第 2期 王秀娟等: 小麦–华山新麦草异代换系 DH2322的分子细胞遗传学鉴定 209


1.7 SSR标记和 STS标记分析
根据 Röder等[25]和 Pestsova等[26]公布的小麦 21
条染色体特异 SSR 标记, 分别选取各条染色体长、
短臂上各 10 对引物进行扩增。从网站 http://wheat.
pw.usda.gov/SNP/new/pcr_primers.shtm上选取小麦 7
个部分同源群上的 STS 标记, 分别选取各同源群 6
对标记进行扩增。所选引物由生工生物工程(上海)
有限公司合成。PCR 扩增反应体系和步骤参照本文
SCAR标记鉴定, 退火温度依引物而定。扩增产物点样
量为 6 μL, 经 8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,
180 V恒压电泳 2~3 h。硝酸银染色, 用数码相机照相。
2 结果与分析
2.1 农艺性状表现
表型调查结果显示, DH2322 农艺性状稳定, 穗
长较小麦亲本 7182、D4286 显著增长, 穗粒数也较
D4286 和七倍体材料 H8911 显著增大, 但与小麦亲
本 7182差异不大(表 1)。整体上看, DH2322具有双
亲的形态学特征 , 结实性好 , 籽粒饱满 , 是较好的
遗传材料。

表 1 异代换系 DH2322及其亲本农艺性状
Table 1 Agronomic traits of the substitution line DH2322 and its parents
材料
Material
株高
Plant height
(cm)
单株穗数
Spike number
per plant
旗叶叶面积
Flag leaf area
(cm2)
穗下茎节长
Peduncle length
(cm)
穗长
Spike length
(cm)
小穗数
Spikelet number
per spike
穗粒数
Kernel number
per spike
结实率
Self-fertility
(%)
7182 75.2±2.4 ab 8.0±1.0 a 37.2±4.8 a 30.0±4.1 a 8.3±0.6 b 18.2±1.8 a 61.8±1.6 a 87.1±2.8 a
D4286 72.2±2.2 b 7.8±2.0 ab 33.7±6.6 a 31.4±2.2 a 7.7±0.5 b 18.2±1.1 a 58.1±1.0 b 83.4±1.6 a
DH2322 78.6±6.7 a 6.6±1.5 ab 29.6±6.5 a 31.0±2.3 a 11.2±1.2 a 16.6±0.9 ab 61.2±0.9 a 82.0±0.2 a
H8911 73.0±0.9 b 5.7±1.1 b 39.1±8.1 a 30.0±1.6 a 10.7±0.4 a 15.3±0.4 b 31.0±1.0 c 62.4±2.9 b
数据后的小写字母表示不同材料间差异达 0.05显著水平
Values followed by different letters are significantly different at P < 0.05.

2.2 华山新麦草 Ns基因组特异 SCAR标记鉴定
用华山新麦草 Ns 基因组特异 SCAR 标记
RHS141对普通小麦品种 7182、硬粒小麦品种 D4286、
DH2322、H8911 及华山新麦草的基因组 DNA 进行
PCR 扩增表明, 华山新麦草、H8911 和 DH2322 的
DNA可以扩增出 934 bp的华山新麦草特异条带, 而
普通小麦品种 7182、硬粒小麦品种 D4286 的 DNA
不能扩增出条带, 说明 DH2322 含有华山新麦草 Ns
基因组染色体(图 1)。
2.3 细胞遗传学鉴定
DH2322 根尖细胞染色体制片观察, 发现根尖

图 1 华山新麦草基因组特异 SCAR标记分析
Fig. 1 Amplification profile of the SCAR marker specific to
P. huashanica
M: marker D2000; 1: 7182; 2: D4286; 3: DH2322; 4: H8911;
5: P. huashanica.
细胞染色体数目为 2n=42 (图 2-a); 对 52个花粉母细
胞镜检显示, 47/52 (90.4%)花粉母细胞减数分裂中
期 I染色体形成 21个二价体(图 2-b), 其中环状二价
体占有很高比例, 平均每个细胞有 20.91 个(表 2);
以华山新麦草总基因组 DNA 作为探针, 对 DH2322
根尖细胞和花粉母细胞基因组原位杂交鉴定显示 ,
其根尖细胞中有两条染色体为黄绿色(图 3-a), 花粉
母细胞减数分裂中期 I 细胞有 1 个完整的二价体显
示荧光信号, 表明 DH2322中的 2条 Ns基因组染色
体可以完全配对为 1 对染色体(图 3-b)。由此说明,
DH2322是一个遗传稳定, 包含 40条小麦染色体和 1
对华山新麦草 Ns 基因组染色体的小麦–华山新麦草
异代换系。
2.4 SSR和 STS结果分析
用小麦 21 条染色体上共 210 对 SSR 引物对
DH2322 及其亲本进行分子标记分析表明, 2D 染色
体上的 3 对引物(Xgwm249、Xgwm296、Xgwm484)
在小麦品种 7182和 H8911中扩增出 154、182、153
bp 的目标条带, 但在硬粒小麦 D4286、华山新麦草
和 DH2322中未扩增出目标条带(图 4)。推测 DH2322
缺失了小麦 2D染色体。
210 作 物 学 报 第 41卷


图 2 DH2322根尖细胞(a)和花粉母细胞(b)观察
Fig. 2 Cytogenetic observation of root-tip cell (a) and pollen mother cell (b) of DH2322

图 3 DH2322根尖细胞原位杂交(a)花粉母细胞原位杂交(b)
Fig. 3 Genomic in situ hybridization (GISH) pictures for root-tip cell (a) and pollen mother cell (b) of DH2322

图 4 SSR及 STS引物扩增图谱
Fig. 4 Amplification profile of SSR and STS markers
M: marker D2000; 1: 7182; 2: D4286; 3: DH2322; 4: H8911; 5: P. huashanica.

表 2 DH2322花粉母细胞减数分裂中期 I (PMC MI)染色体配对
Table 2 Chromosome pairing at metaphase I in pollen mother
cells of substitution line DH2322
染色体配对类型
Chromosome paring type
范围
Range
平均值
Average
I 0–2 0.18
II — 20.91
环状 Ring 18–21 18.32
棒状 Rod 0–3 2.59
观察细胞数为 52。Fifty-two cells were observed.

选取定位于小麦 7个部分同源群上的 42对 EST-
STS 标记 , 对普通小麦品种 7182、硬粒小麦品种
D4286、DH2322、H8911及华山新麦草的基因组DNA
进行 PCR检测, 结果只有定位于小麦第 2 同源群的
引物 CD453246和 BQ160526在 DH2322中扩增出华
山新麦草特异条带(图 4)。推测 DH2322可能含有华
山新麦草 2Ns染色体。
3 讨论
实现华山新麦草有益基因向小麦的转移, 研究
华山新麦草染色体的遗传效应以及获得小麦–华山
新麦草中间材料, 如双二倍体、异附加系、异代换
系是十分必要的。目前, 育种工作者已获得多个小
麦–华山新麦草杂交后代, 它们表现型上多种多样,
如小麦–华山新麦草异附加系有矮株、分蘖数增多、
抗条锈病、叶锈病等性状[15-21]; Cao等[27]鉴定出一个
抗条锈病易位系材料。小麦–华山新麦草异代换系
第 2期 王秀娟等: 小麦–华山新麦草异代换系 DH2322的分子细胞遗传学鉴定 211


DH2322 作为小麦与华山新麦草远缘杂交的新类型,
其穗长与穗粒数较亲本小麦品种显著增加, 是创制
小麦–华山新麦草易位系的重要桥梁。华山新麦草染
色体导入的同时, 必然与小麦遗传背景发生相互作
用, 而导致穗长与穗粒数显著增大的原因, 尚需进
一步研究。
外源基因的有效转移很大程度上依赖于对导入
小麦背景中的外源染色体或染色体片段的快速准确
鉴定[28]。GISH可以直观地检测外源染色体或染色体
片段在小麦遗传背景中的分布, 在鉴定远缘杂种染
色体构型和结构变异方面有重要作用, 但其技术难
度大、费时且成本较高, 在初步鉴定大量遗传材料
时有一定的局限性。SCAR 标记技术的发展为小大
麦远缘杂交研究提供了极大方便。RHS141 是 Du
等 [23]用 RAPD 技术筛选的华山新麦草基因组特异
DNA 片段, 在小麦族其他物种和华山新麦草及全套
小麦–华山新麦草二体异附加系中验证发现 , 仅含
华山新麦草染色质的物种能扩增出长为 938 bp的片
段。RHS141可用于含华山新麦草特异染色质材料的
检测。本研究中 RHS141 的应用为快速初步判定
12DH22中含有华山新麦草遗传物质提供了方便。
SSR 分子标记在近几年的小麦遗传作图、基因
定位、系谱或亲缘关系分析、标记辅助选择等研究
中得到广泛应用[29]。Röder 等[25]建立了小麦的第一
张微卫星遗传图谱, 将 230 对引物扩增的 279 个位
点整合到国际小麦簇作图计划(ITIM)的 Opata85 ×
W7984 作图群体遗传框架图上; Pestsova 等[26]对从
粗山羊草分离的Ｄ基因组专化性微卫星标记(GDM)
在小麦上进行了作图。国际小麦微卫星协会(Wheat
Microsatellite Consortium, WMC)也将开发的 66 个
WMC 标记整合到已有的小麦遗传框架图上[30]。本
研究利用七倍体 H8911与硬粒小麦 D4286杂交选育
DH2322 的过程中, 由于来自 H8911 的 A 和 B 基因
组与来自硬粒小麦的 A 和 B基因组, 理论上可以很
好地配对而得以完整遗传, 因此推测, 二体异代换
系 DH2322最大可能是由华山新麦草的 1对 Ns基因
组染色体替换了 1对小麦 D基因组染色体。为了确
定 DH2322 所缺失的小麦染色体 , 本研究采用
Pestsova 等[26]开发的来自粗山羊草专化性微卫星标
记对小麦–华山新麦草异代换系 DH2322 进行分析,
结果显示, D基因组的 2D染色体上的 3对引物, 在
DH2322 中没有扩增出预期的目标条带, 而其他基
因组染色体上的引物, 在 DH2322 中扩增出预期的
目标条带。由此推断, DH2322缺失了小麦 D基因组
的 2D染色体。
STS (Sequence-tagged site)即序列标签位点, 是
基因组上定位明确, 作为界标并能通过 PCR 扩增被
唯一操作的短的单拷贝 DNA 序列[31], 由于可直接
在 DNA 分子水平上指出小麦中外源染色体片段的
组成和位置, 在外源染色体鉴定方面应用广泛。前
人利用 STS 标记已成功鉴定出小麦背景中的簇毛
麦、黑麦等小麦近缘种的染色体片段[32-34]。Du等[15]
利用 12对 STS标记鉴定出 3-6-4-1附加两条华山新
麦草 2Ns 染色体, 其中的 2 对标记在华山新麦草和
DH2322 中扩增出与华山新麦草一致的特异条带 ,
说明 DH2322含有华山新麦草 Ns基因组的 2Ns染色
体。CD453246 扩增出的 H8911 的条带本应与华山
新麦草特异条带高度一致, 但 H8911 的条带却普遍
高于后代 DH2322 的扩增条带 , 原因尚不清楚。
3-6-4-1 和 DH2322 穗长较亲本 7182 都显著增长
3~4 cm, 是否与 2Ns 染色体上携带的基因有关尚需
进一步研究。
4 结论
DH2322 是一个稳定的小麦–华山新麦草 2D(2Ns)
二体异代换系材料, 结实性好, 穗长和穗粒数等农
艺性状上得到改善, 对进一步研究华山新麦草染色
体的形态结构特征及遗传机制、挖掘利用华山新麦
草优异基因、丰富小麦遗传种质资源具有重要价值。
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