全 文 ：蝴蝶兰转基因研究进展
肖文芳， 李 佐， 尤 毅， 陈和明， 吕复兵
（广东省农科院花卉研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室，广东 广州 510640）
摘 要：从遗传转化体系的建立及转化载体的构建方面系统地介绍了目前国内外蝴蝶兰转基因研究的概况及进展，着重阐述
了蝴蝶兰应用前景较好的花色﹑花香及衰老相关基因的国内外转基因研究状况，讨论了在转化体系构建过程中启动子选择的重要
性，为蝴蝶兰遗传转化体系的建立及蝴蝶兰的分子育种提供参考。
关键词：蝴蝶兰； 转基因； 研究进展
中图分类号：Q943.2 文献标识码：A 文章编号：1004－874X（2012）24-0168-03
Advances of Phalaenopsis transgenic research
XIAO Wen-fang, LI Zuo, YOU Yi, CHEN He-ming, LV Fu-bing
(Floricultural Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Key Lab of
Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization, Guangzhou 510640, China)
Abstract： This article introduced overview and progress about the establishment of genetic transformation system and the
construction of the transformation vector of Phalaenopsis at home and abroad, focusing on transgenic research of colors, floral and aging-
related genes. The paper also discussed the importance of the selected promoter, and provided a reference for the establishment of genetic
transformation system and the molecular breeding of Phalaenopsis.
Key words： Phalaenopsis; transgenic; research advances
蝴蝶兰（Phalaenopsis）是我国乃至世界产业化程度最
高的兰科观赏植物，是一类深受广大消费者喜爱的花卉。
蝴蝶兰的规模化生产主要通过种子无菌播种生产实生苗
和通过花梗腋芽组织培养生产分生苗两条途径。 商业栽
培的蝴蝶兰品种多由人工杂交育成， 但随着蝴蝶兰产业
的迅速发展，对品种的新、奇、特等观赏性状和抗病、抗逆
等农艺性状的要求越来越高， 传统的育种手段受种源限
制存在不可突破的瓶颈，因此分子育种技术越来越重要。
近年来，兰科植物的离体培养 [1]和遗传转化均取得较大进
展，虽然国外的研究发现已开始偏向于基因功能分析，但
多数研究仍集中于遗传转化体系的建立上 [2-4]。 转基因技
术是目前应用前景最广阔的定向作物改良技术， 但是在
蝴蝶兰及其他兰花的应用上尚属探索阶段。 本文对蝴蝶
兰转基因技术的研究进展进行综述， 以期为蝴蝶兰遗传
转化体系的建立及蝴蝶兰的分子育种提供参考。
1 遗传转化体系
蝴蝶兰的组织培养始于 1949 年 [5]，随着生物技术的
不断发展，蝴蝶兰的分子育种越来越受到重视，遗传转化
体系逐渐完善。 由于原球茎和类原球茎 （protocorm-like
bodies，PLBs）容易诱导，转化后也容易再生成苗，是目前
蝴蝶兰转基因的主要受体材料。 但原球茎和类原球茎的
幼胚经转化后容易产生嵌合体， 不利于后续的鉴定筛选
等。 胚性愈伤是较好的转基因受体材料，通过筛选可以有
效地去除非转化细胞，但蝴蝶兰愈伤组织的诱导存在品种
特异性，且诱导时间长、生长缓慢、继代培养困难，因此实
际应用不多。Mishiba 等[6]研究发现，未成熟的原球茎（播种
21 d后）也可用于农杆菌介导的蝴蝶兰转化。
兰花转基因方法中以基因枪法成功转化的报道最多。
1996年 Anzai等[7]首次通过基因枪轰炸由叶片诱导产生的
类原球茎，获得 1株含 GUS和 bar基因的再生植株。 但基
因枪法转化得到稳定遗传的植株几率太低， 且成本较高，
不适于培育新品种。 而农杆菌介导的转化效率较高、操作
简单、成本低，并且由于农杆菌质粒载体本身的特性，外源
基因能够整合到受体染色体上，形成可稳定遗传的转基因
植株的几率较高，因而越来越受到重视。 Chai 等 [8]以花梗
芽诱导产生的 PLBs 为受体材料，首次通过农杆菌介导蝴
蝶兰 PLBs 转化成功。 目前，石斛兰 [9-10]、蕙兰 [11]、风兰 [12-13]、
文心兰[14]和卡特兰[15]等都已有转化外源基因成功的报道。
2 转化载体构建
2.1 转化基因
2.1.1 花色相关基因 花的颜色主要由类黄酮、类胡萝卜素
及甜菜色素决定[16]，还受到色素细胞的 pH值[17]、金属离子、辅
助色素[18-19]及花瓣表皮细胞形态等因素的影响。 蝴蝶兰花色
丰富，是研究花着色机制的理想材料。 目前蝴蝶兰花色基因
研究主要集中于花色素苷合成途径中的关键酶的分离与鉴
定方面，这些基因也将是蝴蝶兰转基因研究方面的重点。
类黄酮 3, 5-羟化酶（Flavonoid 3, 5-hydroxylase, F
35H）是细胞色素 P450 家族成员之一，是合成 3,5 -羟
化花色素苷的关键酶， 是植物形成蓝色和紫色花所必需
收稿日期：2012-10-12
基金项目：广东省农业攻关项目（2011A020102007）；广州市农
业科技项目（GZCQC1002FG08015-01）
作者简介：肖文芳（1985-），女，硕士，研究实习员，E-mail: smile.
high@yahoo.com.cn
通讯作者：吕复兵（1971-），男，研究员，E-mail: lvfub@yahoo.com.
cn
广东农业科学 2012 年第 24 期168
C M Y K
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2012.24.060
的[20]。 对蝴蝶兰的研究发现，F35H基因的表达与花发育
时期及花色密切相关[21]。 Su等[22]从蝴蝶兰中克隆到F35H
基因的 cDNA全长，利用基因枪法在蝴蝶兰的花瓣中瞬时
表达，花瓣在 48 h内从粉红色变成品红色。
查尔酮合酶（Chalcone synthase，CHS）是类黄酮合成的
限速酶，除可控制花色素形成外，将 CHS 基因导入植物还
可提高植物的抗逆性。 Han等[23]利用反式和巢式 PCR获得
了 pchs-1全长基因，将基因转化到烟草中发现花的颜色变
红以及花粉管异常，从而进一步证明了 Pchs基因的功能。
查尔酮异构酶（Chalcone isomerase，CHI）表达量的多
少会直接影响花色素的合成， 同时也会影响到黄酮类代
谢产物的量。 直接应用 CHI基因改变花色的研究较少，导
入其中一种基因或两种基因（CHS，CHI）同时导入，通过两
者的相互作用使花色变化， 可有效解决目前花卉市场花
色单调的难题。
二氢黄酮醇 4-还原酶 （Dihydroflavonol 4-reductase,
DFR）对底物具有选择性，兰属植物的 DFR 不能有效还原
二氢堪非醇(dihydrokaempferol，DHK)产生天竺葵素 [24]而使
其缺乏橙色，只能还原二氢杨梅黄酮产生翠雀素，这可能
是由于 DFR 和类黄酮-3-羟化酶 (F3′H) 竞争相同底物
DHK的结果[25]。通过超表达 DFR或抑制 F3′H的表达有可
能获得橙色的蝴蝶兰。
类黄酮 3-O-糖基转移酶（flavonoid 3-O-glucosyltran-
sferase，UFGT）是形成稳定花色素苷所必需的。 Chen 等 [26]
研究发现，在红色和白色蝴蝶兰品种中，CHS、CHI 和 ANS
（花青素合成酶）基因的表达水平没有太大差别，但在红花
中 UFGT 基因大量表达 ， 表达量显著高于白花 ，而
PeUFGT3-RNAi植株则表现出不同程度的褪色，且花青素
含量明显降低，说明 UFGT基因与花的形成高度相关。
花青素苷生物合成途径中结构基因的时空表达由 3
种转录因子及其相互作用而决定，分别是 R2R3-Myb、Myc
基因家族的 bHLH (basic helix-loop-helix)和 WD40 型转
录因子[27]。 蝴蝶兰白色花瓣中同时表达玉米的 Myc Lc 和
Myb C1转录因子可激活花青素苷的合成， 而单独表达其
中任何一个则不能激活， 说明其花青素苷的生物合成需
要上述两种转录因子 [28]。 白花蝴蝶兰中 DFR 基因的表达
水平很低，而紫花蝴蝶兰 DFR 表达水平很高，二者均表达
Myc 和 Wd 基因，但 Myb 基因只在后者中有表达，说明缺
乏 Myb 基因使白花蝴蝶兰丧失 DFR 活性，致使不能合成
花青素苷 [29]。 在对文心兰萳西品种的花色研究中发现，
OgMYB1直接调节 OgCHI和 OgDFR的激活， 将 OgMYB1
连接 CHRC 启动子后用基因枪转化黄色唇瓣会产生和串
联转化 OgCHI和 OgDFR两个基因一样的红色斑点[30]。
2.1.2 衰老相关基因 乙烯是植物激素之一 , 其主要生
理作用是催熟、促衰老和促脱落。 乙烯在植物体内的合成
途径为 Met(蛋氨酸)－SAM( S-腺苷蛋氨酸)－ACC(1-amino
ring propane carboxylic acid, 1－氨基环丙烷羧酸)－乙烯。其
中乙烯直接前体 ACC的合成及氧化为生成乙烯的限速环
节[31]。 蝴蝶兰属于乙烯致衰植物，授粉后与乙烯合成相关
的基因很快就开始表达， 一般情况下蝴蝶兰授粉后十几
个小时后花瓣就开始枯萎。 通过抑制 ACC 合成酶的活性
来抑制蝴蝶兰中乙烯的合成，有可能减缓蝴蝶兰的衰老，
延长其花期。 但是，乙烯不仅仅在衰老方面起作用，还参
与蝴蝶兰的许多生理生化反应， 因此在开花后若要抑制
乙烯的促衰老和促脱落作用，还必须找到时间（开花后）
和空间（花）特异表达启动子。
2.1.3 香味相关基因 蝴蝶兰品种的香味成分是由甘油醛
三磷酸合成的类单萜类，主要为沉香醇和香叶醇，而香叶
基二磷酸合成酶（geranyl diphosphate synthase，GDPS）是此
合成途径的关键酶。 Lücker等[32]将仙女扇的 S-沉香醇合成
酶基因转入到矮牵牛中，结果转基因矮牵牛组织中并没有
出现自由的沉香醇分子，而是大量积累了不挥发的 S-沉香
基-β-D-吡喃葡萄糖苷 （S-linalyl-β-D-glucopyranoside），
这是植物内源葡萄糖转移酶作用的结果。 Lavy等[33]将沉香
醇合成酶基因 LIS 转入康乃馨中， 大部分合成的沉香醇进
一步转化成了顺式或反式的沉香醇氧化物。
2.2 启动子
外源基因在转入植株以后，能否实现以特殊需求为目
的的不同基因的有效表达，能否在植物细胞中稳定遗传，
是基因工程实现生产价值的关键。 外源基因连接组成型
启动子转化植物后会在受体植物中非特异性的持续、高
效表达，不仅造成浪费，甚至可能大量积累中间产物或者
衍生物，对植株产生毒害作用，而在需要该外源基因大量
表达的时间或特定组织部位则因表达量过低又达不到预
期效果。 选择诱导型或特异性表达启动子则可大大缓解
这一难题。 目前， 兰花等园艺花卉的遗传转化主要使用
35S启动子，但真正取得改良效果的试验依然采用特异性
的启动子，如 1992年成功培育的转基因蓝色矮牵牛，其启
动子为花瓣特异地表达的 CHI 和 CHS 基因中的启动子。
Chiou 等 [34]在文心兰中找到一个成色素细胞特异的启动
子， 为以后的蝴蝶兰花色改良试验提供了一个非常好的
工具-Chrc 启动子（成色素细胞特异的类胡萝卜素相关基
因启动子）。 此启动子在花器官近轴面的长乳突状细胞中
特异表达， 且在单子叶植物中的表达活性比在双子叶植
物中高。Chiou等[35]将 Chrc启动子串联文心兰的 OgCHI和
OgDFR 基因，用基因枪将其转化文心兰黄色唇瓣，使其产
生了红色的斑点。
3 结语
蝴蝶兰遗传转化体系的建立需要综合考虑多方面的
影响因素，受体材料﹑转化方法﹑载体构建等都会影响最终
的转化结果。另外，蝴蝶兰的遗传转化还存在品种特异性，
不同品种的再生体系不同， 对遗传转化过程的后期筛选
也会存在影响。 因此，蝴蝶兰的遗传转化体系应该是建立
在品种上的特异转化体系。
参考文献：
[1] Chugh S, Guha S, Rao I U. Micropropagation of orchids: A
review on the potential of different explants [J].Scientia
Horticulturae,2009,122(4):507-520.
[2] Zhang L, Chin D P, Fukami M, et al. Agrobacterium-mediated
169
C M Y K
genetic transformation of Cattleya with an Odontoglossum
ringspot virus replicase gene sequence [J].Plant Biotechnology,
2010,27(5):421-426.
[3] Shrestha B R, Poh Chin D P, Tokuhara K, et al. Efficient
production of transgenic plantls of Vanda through sonication -
assisted Agrobacterium -mediated transformation of protocorm -
like bodies[J].Plant Biotechnology, 2007,24:429-434.
[4] Sjahail R, Mitt M. High -efficiency Agrobacterium -mediated
transformation of Phalaenopsis using meropenem, a novel
antibiotic to elimianate Agrobacterium [J].Journal of Horticultural
Science &Biotechnology,2006, 81(3):458-464.
[5] Potor G, Sagawa Y. A method of vegetative propagation of
Phalaenopsis stem cuttings [J].Amer Orchid Soc Bull,1949,18(2):
739-742.
[6] Mishiba K I, Chin D P, Mii M. Agrobacterium -mediated
transformation of Phalaenopsis by targeting protocorms at early
stage after germination[J].Plant Cell Rep,2005,24:297-303.
[7] Anzai H, Ishii Y, Shichinohe M, et al. Transformation of
phalaenopsis byparticle bombardment [J].Plant Tissue Culture
Letters,1996,13(3):265-272.
[8] Chai M L, Xu C J, Belarmino M M, et al. Stable
transformation of protocorm-like bodies in Phalaenopsis orchid
mediated by Agrobacterium tumefaciens[J].Scientia Horticulturae,
1996, 14:213-224.
[9] Nan G L, Tang C S. Dendrobium orchids contain an inducer of
Agrobacterium virulence genes [J]. Physiological and Molecular
Plant Pathology,1997,51:391-399.
[10] Yu Z H, Yang S H, Goh C J. Agrobacterium -mediated
transformation of Dendrobium orchid with the 1 knox gene
Doh1[J].Plant cell reports,2001,20:301-305.
[11] Chen L, Hatano T, Niimi Y. High efficiency of Agrobacterium-
mediated rhizome transformation in cymbidium (orchidaceae
maxillarieae)[J].Lindleyana,2002,17(3):130-134.
[12] Niimi Y. Microprogation and gene transformation by using
Agrobacterium in some orchidaceous plant [J].Proceedings of the
international orchid wave in Shimanami,1999,27:29-42.
[13] Niimi Y, Hatano T, Chen L. Gene transformation by using
Agrobacterium in some orchidaceous plants [M]. Nagoya:
Proceedings of APOC7 Nagoya Japan,2001:117-122.
[14] Liau C H, You S J, Prasad V, et al. Agrobacterium
tumefaciens-mediated transformation of an Oncidium orchid [J].
Plant Cell Reports,2003,21:993-998.
[15] Zhang L, Chin D P, Mii M. Agrobacterium -mediated
transformation of protocom- like bodies in Cattleya[J].Plant Cell
Tiss Organ Cult,2010,103:41-47.
[16] Foekmann G. Flavonoids as flower pigments: the formation of
the natural spectrum and its extension by genetic engineering[J].
Plant Breed,1991,106:1-26.
[17] Verweij W, Spelt C, Sansebastaino G D, et al. An H +P -
ATPase on the tonoplast determines vacuolar pH and flower
colour[J]. Nature Cell Biology,2008,10:1456-1462.
[18] Colangelo E P, Guerinot M L. Put the metal to the petal:
metal uptake and transport throughout plants [J]. Curr Opin
Plant Biol,2006,9:322-330.
[19] Shoji K, Mnmonoi K, Tosiaki T. Alternative expression of
vacuolar iron transporter and ferritin genes leads to blue/purple
coloration of flowers in tulip cv. Murasakizuisho [J].Plant Cell
Physiol,2010,51:215-224.
[20] Su V, Hsu B. Cloning and expression of a putative cytochrome
P450 gene that influence the colour of Phalaenopsis flowers[J].
Biothechnology Lett,2003,25:1933-1939.
[21] Wang J, Ming F, Han Y, and Shen D. Flavonoid -3,5’ -
hydroxylase from Phalaenopsis: A novel member of cytochrome
P450s, its cDNA cloning, endogenous expression and molecular
modeling[J].Biotechnology Letters,2006,28(5):327-334.
[22] Su V, Hsu B D. Cloning and expression of a putative
cytochrome P450 gene that influences the color of Phalaenopsis
flowers[J].Biotechnol Lett,2003,25(22):1933-1939.
[23] Han Y Y, Ming F, Wang J W, et al. A novel chalcone
synthase gene from Phalaenopsis Orchid that Alters floral
morphology in transgenic tobacco plants [J].Plant Molecular
Biology Reporter,2005.23:193-193.
[24] Eric T J, Yi H, Shin B, et al. Cymbidium hybrida
dihydroflavonol 4 -reductase does not efficiently reduce
dihydrokaempferol to produce orange pelargonidin -type
anthocyanins[J]. The Plant Journal,1999,19(1):81-85.
[25] Rasika M G, Champagne M M, Hieber A D, et al. Cloning
and characterization of two anthocyanin biosynthetic genes from
Dendrobium orchid [J]. Journal of American Society for
Horticultural Science,2005, 130:611-618.
[26] Chen W H, Hsu C Y, Cheng H Y, et al. Downregulation of
putative UDP-glucose: Flavonoid 3-O- glucosyltransferase gene
alters flower coloring in Phalaenopsis [J].Plant Cell Reports,
2011, 30(6):1007- 1017.
[27] Tanaka Y, Sasaki N, Ohmiya A. Biosynthesis of plant pigments:
anthocyanins, betalains and carotenoids [J]. The Plant Journal,
2008,54(4):733-749.
[28] Griesbach R J, Klein T M. In situ genetic complementation of
a flower color mutant in Doritis pulcherrima (Orchidaceael)[J].
Lindleyana,1993,8:223-226.
[29] Ma H, Pooler M. Anthocyanin regulatory/structural gene
expression in Phalaenopsis [J].J Amer Soc Hort Sri,2009,134(l):
88-96.
[30] Chiou C Y, Yeh K W. Differential expression of MYB gene
(OgMYB1) determines color patterning in floral tissue of
Oncidium Gower Ramsey[J].Plant Mol Biol,2008,66(4):379-388.
[31] Savin K W, Baudinette S C, Graham M W, et al. Antisense
ACC oxidase RNA delays carnation petal senescene[J].Hort Sci,
1995,30(5):970-972.
[32] Lücker, J Harro J B, Wilfried S, et al. Expression of Clarkia
S-linalool synthase in transgenic petunia plants results in the
accumulation of S-linalyl-β-D- glucopyranoside [J].The Plant
Journal,2001,27(4):315-324.
[33] Lavy M, Zuker A, Lewinsohn E, et al. Linalool and linalool
oxide production in transgenic carnation flowers expressing the
Clarkia breweri linalool synthase gene [J].Molecular Breeding,
2002,9(2):103-111.
[34] Chiou C Y, Wu K, Yeh K W. Characterization and promoter
activity of chromoplast specific carotenoid associated gene
(CHRC) from Oncidium Gower Ramsey [J].Biotechnol Lett,2008,
30:1861-1866.
[35] Chiou C Y, Yeh K W. Differential expression of MYB gene
(OgMYB1) determines color patterning in floral tissue of Oncidium
Gower Ramsey[J].Plant Mol Biol,2008,66:379-388.
170
C M Y K