全 文 ：第 32卷 第 11期 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) Vo l. 32 No. 11
2004年 11月 Jour. o f No r th west Sci-Tech Univ . of Ag ri. and Fo r. ( Nat. Sci. Ed. ) Nov . 2004
普通小麦-华山新麦草异附加系的
分子细胞遗传学研究
赵继新1 ,陈新宏 1 ,王小利 1 ,武 军 1 ,
傅 杰1 ,何蓓如 1 ,孙志刚 2
( 1西北农林科技大学农学院 ,陕西杨凌 712100;
2陕西省种业集团有限责任公司 ,陕西西安 710016)
[摘 要 ] 利用荧光原位杂交和染色体 C-分带技术 ,对普通小麦 -华山新麦草的异附加系进行了研究。荧光原
位杂交结果显示: 异附加系 H9015-17-1-9, H9017-14-16-5都附加有 2条华山新麦草的染色体。 对这 2个材料和华
山新麦草进行染色体 C-分带带型比较 ,初步推断 , H9015-17-1-9附加的是 Nh5染色体 , H9017-14-16-5附加的是 Nh6
染色体。
[关键词 ] 普通小麦 ;华山新麦草 ;异附加系 ;荧光原位杂交 ;染色体 C-分带
[中图分类号 ] Q943; S512. 032 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 1671-9387( 2004) 11-0105-04
华山新麦草 ( Psathyrostachys huashanica, 2n=
14, NN )是禾本科小麦族大麦亚族新麦草属的一种
多年生异花授粉植物 ,是分布在秦岭山脉华山段的
一个中国特有种 ,具有抗寒、抗旱、耐瘠薄、早熟、优
质、矮杆、抗病等特点 [1 ]。 井金学等 [ 2 ]、王美南等 [3 ]、
万永芳等 [4 ]对华山新麦草进行了抗条锈病、全蚀病
和赤霉病的研究 ,结果表明华山新麦草高抗小麦条
锈病和全蚀病 ,中抗赤霉病。自 1988年开展普通小
麦与华山新麦草的杂交以来 ,先后有陈漱阳等 [1 ]、孙
根楼等 [5 ]获得了成功。 陈漱阳等 [6 ]利用华山新麦草
与普通小麦杂交和回交 ,获得了一系列异附加系 ,并
对这些异附加系进行了细胞遗传学研究。
荧光 原位杂 交 ( Fluo rescence In Si tu Hy-
bridiza tion, FISH)是根据核酸分子碱基互补配对原
则 ,将经荧光染料标记的外源核酸探针与染色体制
片上的特异染色体进行杂交 ,并对杂交信号进行放
大 ,通过荧光检测系统 (荧光显微镜 )进行检测 ,以确
定某物种的异源染色体或其片段。目前 ,荧光原位杂
交技术已广泛应用于染色体定位 ,染色体结构分析 ,
染色体物理图谱构建 ,外源染色体检测 ,物种进化及
亲缘关系鉴定等研究领域 [7～ 9 ]。染色体 C-分带 ( C-
banding )可显示组成型异染色质在染色体上的分布
和结构变异 ,能较有效的识别小麦中的异源染色体
或染色体片段 [10, 11 ]。这 2种方法结合可以准确可靠
的检测植物远缘杂种中的异源染色质。自 Jiang和
Gil l[ 12]首次用染色体分带 -分子原位杂交技术检测
小麦 -黑麦易位系中的外源染色体片段以来 ,钟少斌
等 [9 ]、刘文轩等 [13 ]和张相岐等 [ 14 ]用该方法分别鉴定
了普通小麦中的簇毛麦、大赖草和黑麦染色质。周荣
华等 [15 ]用基因组原位杂交技术 ( GISH)检测了普通
小麦中的新麦草 ( Psa. juncea )染色质。 本研究用
FISH和 C-分带技术鉴定了普通小麦中的华山新麦
草染色体。现将研究结果报道如下。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
试验材料有华山新麦草 ( Psathyrostachgs
huashanica ) ,普通小麦 ( Triticum aest ivum )品种中
国春 ,普通小麦与华山新麦草杂交、回交后选育的异
附加系 H9015-17-1-9和 H9017-14-16-5,均来自本
课题组。
1. 2 方 法
1. 2. 1 染色体制片 取发芽种子根尖 ,冰水 ( 0～ 4
℃ )预处理 20～ 24 h,卡诺固定液 ( 3份体积分数
[收稿日期 ] 2003-10-20
[基金项目 ] 国家 863计划项目 ( 2001AA241037) ;陕西省自然科学基金项目 ( 2001SM15) ;农业部农业结构调整重大技术研究专项
( 2002-02-01A)
[作者简介 ] 赵继新 ( 1971- ) ,男 ,陕西汉中人 ,助理研究员 ,硕士 ,主要从事小麦异源新种质创造和遗传育种研究。
DOI : 10. 13207 /j . cnki . jnwaf u. 2004. 11. 024
95%乙醇∶ 1份冰醋酸 )固定 2～ 3 d,质量分数 2%
纤维素酶+ 果胶酶酶解 ,体积分数 45%醋酸压片 ;
液氮冰冻揭片 ;气干后 - 20℃保存备用。
1. 2. 2 染色体 C-分带 参照 Gill等 [16 ]和 Endo[ 17]
的方法并略作修改 ,即将保存的制片干燥后依次在
45～ 50 ℃的 体积 分 数 45%醋 酸 , 50 g /L 的
Ba( O H) 2过饱和溶液以及 2× SSC溶液中分别处理
3～ 5, 2～ 3和 15～ 30 min,每步用自来水冲洗染色
体制片 ,最后用 pH= 6. 8的磷酸缓冲液稀释 Giem-
sa染液后适度染色。 Olympus( BH-2)生物显微镜观
察照相后进行带型分析。
1. 2. 3 原位杂交 ( 1) DN A提取: 用 CT AB法提
取华山新麦草和普通小麦中国春基因组 DNA。
( 2)探针标记:采用缺刻平移法用 Digoxin-11-dU TP
( Sigma公司 )对华山新麦草基因组 DNA进行标
记。( 3)染色体制片处理:染色体制片依次在 60℃干
燥 3 h, 500 mg /mL RNase A溶液 37℃处理 1 h,
2× SSC室温漂洗 5 min;去离子甲酰胺 (体积分数
70% ) 70℃变性 2～ 3 min;预冷乙醇 (体积分数
70% , 85% , 100% )各脱水 5 min;最后在空气中干
燥。 ( 4)杂交:将 25μL杂交液 (去离子甲酰胺 10
μL,质量分数 50%硫酸葡聚糖 2μL, 20× SSC 2. 5
μL,鲑鱼精 DNA( 10 mg /mL) 2μL,探针 DNA( 40
mg /mL) 1. 5μL,中国春封阻 DNA( 300 mg /m L) 7
μL)沸水变性 10 min,立即置冰上 5 min后加到载
玻片上 ,盖上盖玻片 ,置于 2× SSC湿润滤纸盒 60
℃温育 10 min后转 37℃杂交过夜。 ( 5)漂洗:依次
在 2× SSC室温 7 min,去离子甲酰胺 (体积分数
35% ) 37～ 42℃ 5 min, 2× SSC室温 7 min和 1×
PBS室温 7 min。 ( 6)杂交信号放大: 经 1× PBS洗过
的染色体制片上加 0. 5～ 1 mL 1× Blocking溶液 ,
在 15～ 25℃下 30 min;去溶液后吸 50μL anti-DIG
so lution加到制片上 ,盖上盖玻片 , 37℃保湿 60
min; Washing buffer 37℃稍洗 3次 ;吸 50μL anti-
mouse-1g-DIG so lution加到制片上 ,盖上盖玻片 ,
37℃保湿 60 min;清洗同上 ;吸 50μL anti-DIG-
f luo rescein so lution加到制片上 ,盖上盖玻片 , 37℃
黑暗保湿 60 min;清洗同上 ;黑暗干燥后加 12μL
10 mg /mL PI(含抗褪色剂 )染色并封片。 ( 7)检测:
蔡氏荧光显微镜观察 , Fuji ISO 400彩色胶卷照相。
2 结果与分析
2. 1 普通小麦 -华山新麦草异附加系荧光原位杂交
分析
以 Digoxin标记的华山新麦草基因组 DNA为
探针 ,用普通小麦中国春基因组 DNA作封阻 ,与普
通小麦 -华山新麦草异附加系的根尖体细胞染色体
进行原位杂交。在荧光显微镜 450～ 490 nm波长激
发下 ,具有杂交信号的华山新麦草染色体显示黄色 ,
而不具杂交信号的小麦染色体显示红色。观察发现 ,
普通小麦 -华山新麦草异附加系 H9015-17-1-9,
H9017-14-16-5都有 2个明显的染色体杂交信号 ,
说明异附加系 H9015-17-1-9, H9017-14-16-5都附
加有 2条华山新麦草的染色体 (图版Ⅰ -1, 2)。
图版Ⅰ 普通小麦 -华山新麦草异附加系的原位杂交分析
1.异附加系 H9015-17-1-9; 2.异附加系 H9017-14-16-5
Pla teⅠ Fluor escence in situ hybridization of alien addition lines
1. Alien ad di tion line H9015-17-1-9; 2. Alien addit ion line H9017-14-16-5
106 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 32卷
2. 2 普通小麦-华山新麦草异附加系 C-分带鉴定
对华山新麦草的染色体进行了核型和带型分
析 ,发现其染色体全是中部着丝点染色体 (图版Ⅱ -
1) ; C-分带带型全是端带 ,无着丝点带和中间带 ,带
纹单一 (图版Ⅱ -2)。依据王秀娥等 [ 11 ]对华山新麦草
染色体的命名 ,并参照沈颂东等 [18 ]对华山新麦草所
作的核型分析 ,结合本研究结果 ,华山新麦草各染色
体的核型、带型特征为: Nh1 ,短臂端部有一强端带 ,
长臂端部有一弱端带 ,臂比 (长臂 /短臂 ,下同 )为
1. 29; Nh2 ,长、短臂各有一强端带 ,臂比为 1. 42; Nh3 ,
长、短臂各有一强端带 ,臂比为 1. 22; Nh4 ,短臂有弱
端带 ,长臂有强端带 ,臂比为 1. 18; Nh5 ,短臂有一强
端带 ,臂比最大 ,为 1. 54; Nh6 ,长、短臂各有一端带 ,
长臂端带比短臂端带颜色深 ,臂比为 1. 25; Nh7 ,染色
体最短 ,长、短臂各有一端带 ,臂比为 1. 20。
参照 Gill等 [ 16]的普通小麦标准带型 ,普通小麦
主要显示着丝点带、近端带、中间带 ,或端带+ 中间
带和着丝点带 ,带纹丰富 ;凡是显端带的染色体必然
同时显着丝点带、近端带或中间带。因此 ,根据普通
小麦和华山新麦草染色体的带纹特征 ,初步推断
H9015-17-1-9附加的是华山新麦草的 Nh5染色体
(短臂有一强端带 ,染色体臂比最大 ,为 1. 54,图版
Ⅱ -3) ,而 H9017-14-16-5附加的是华山新麦草的
N
h
6染色体 (长、短臂各有一端带 ,长臂端带比短臂端
带颜色深 ,臂比为 1. 25,图版Ⅱ -4)。
图版Ⅱ 普通小麦-华山新麦草异附加系染色体 C-分带
1.华山新麦草染色体核型 ; 2.华山新麦草染色体 C-带带型 ;
3.异附加系 H9015-17-1-9, 2n= 44; 4.异附加系 H9017-14-16-5, 2n= 44; N 1～ N 7分别与 Nh1～ Nh7对应
Pla teⅡ The ro o t tip ch romosomes o f the alien addition lines and P . huashanica
1. Karyotype of P. huashanica; 2. C-banding of P. huashanica ;
3. Alien addi tion line H9015-17-1-9, 2n= 44; 4. Alien addit ion line H9017-14-16-5, 2n= 44;
N1- N7 indicate th e N
h
1 - N
h
7 ch romosome of P .huachan ica
3 讨 论
原位杂交技术目前已成为植物远缘杂交中检测
与跟踪外源染色质的重要手段之一 ,在小麦-亲缘物
种异源新种质的筛选与鉴定方面 ,以基因组 DNA
为探针的原位杂交技术发挥了很大作用 ,目前得到
的许多异源新种质材料中绝大多数是利用基因组原
位杂交 ,并结合染色体 C-分带等技术鉴定出来
107第 11期 赵继新等: 普通小麦 -华山新麦草异附加系的分子细胞遗传学研究
的 [12, 13, 19 ] ,尤其是采用原位杂交-分带序续技术 [19 ] ,
将原位杂交和分带在一个实验一张制片上进行 ,进
一步提高了外源染色体鉴定的准确性和精确性。本
研究先对异附加系材料进行原位杂交鉴定 ,确定其
含有华山新麦草染色体 ,然后再对其进行染色体 C-
分带鉴定 ,虽然不及原位杂交 -分带序续技术准确性
高 ,但由于华山新麦草染色体具有明显区别于普通
小麦带型的端带特征 ,因此 ,本研究用这 2种方法能
比较准确地鉴定出普通小麦中的华山新麦草染色
体。
原位杂交过程中 ,适当的探针 DNA与封阻
DNA比例对杂交信号的显示有重要影响。 一般而
言 ,普通小麦与其近缘野生植物的亲缘关系越远 ,所
需普通小麦封阻 DNA的量越少 ;相反 ,亲缘关系越
近 ,封阻 DNA的量则越多。但封阻 DNA的量太大 ,
会遮盖部分杂交信号 ;封阻的量太小 ,又会出现较多
的假杂交信号 [10, 20 ]。在本研究中 ,探针 (华山新麦草
DNA)与封阻 (中国春 DNA)的质量比在 1∶ 30～
40,可以得到较好的杂交信号。 另外 ,试验中要获得
理想杂交信号 ,还与洗脱强度有很大关系。洗脱强度
太大 ,会使部分杂交信号丢失 ,导致有杂交信号的染
色体显示不完全 ;洗脱强度太小 ,又会使信号杂乱 ,
导致背景信号增多 [10, 20 ]。 本研究通过比较认为 ,用
体积分数 35%的去离子甲酰胺溶液在 37～ 42℃洗
脱 5 min可以获得较好的杂交信号。此外 ,良好的染
色体制片、有较多的中期分裂相是试验成功的又一
关键因素。
根据王美南等 [3 ]的研究 ,异附加系 H9015-17-1-
9和 H9017-14-16-5是 2个中抗小麦全蚀病的材
料 ,其外源亲本华山新麦草高抗小麦全蚀病 ,普通小
麦亲本 7182不抗该病 ,经本研究证实这 2个材料已
含有华山新麦草的染色体。由此可初步推断 ,这 2个
材料的抗全蚀病基因来自于华山新麦草 ,说明华山
新麦草的抗小麦全蚀病基因随着其染色体的导入已
转进普通小麦 ,但这 2个材料对小麦全蚀病的抗性
不强 ,可能是由于华山新麦草的 Nh5 , Nh6染色体上只
含有一个中等抗病基因 ,或者华山新麦草的抗全蚀
病基因在小麦遗传背景下没有得到完全表达。 这 2
个材料的育成对扩大小麦抗病基因库、培育抗小麦
全蚀病新品系 (种 )具有重要作用。
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(下转第 113页 )
108 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 32卷
Effect o f po tassium and manganese fertilizer cooperating
application on nutrient content in plant and yield
and quality of winter wh eat in dryland
ZHANG Hui-min1 , LIU Hong-xia1 , WANG Liu-hao2 , PEI Rui- jie3 ,
WANG Hao1 , ZHOU Wen-li1 ,GUO Da-yong1 ,GUO Yong-xin1
( 1 College of Agronomy , Henan University of Science and Technology , Luoyang, Henan 471003,China;
2College of Forestry Vocation, Henan Uni versity of Science and Technology , Luoyang, Henan 471002,China;
3 N anyang Agricultural College of Henan Province ,Nanyang, Henan 473000,China)
Abstract: The ef fect o f po tassium and manganese fer tili zer coopera ting application on nutrient content
in plant and yield and quality o f w inter w hea t in dry land w as studied. The results showed that the ni t ro gen
and phosphorus content in plant of w inter wheat at di fferent stag es under po tassium and manganese ferti l-
izer cooperating treatments decreased compared to no fertili zer t reatment , w hi le the potassium content in-
creased. With po tassium and manganese fertilizer co operating application, there wa s a signi ficant effect of
yield-increasing on winter wheat rang ing f rom 12. 0% to 25. 5% . Cooperating applica tion of potassium and
manganese fertili zer could increase sedimentation value, the content of w et gluten and pro tein, and prolong
the dough stable time. The effect of po tassium fertilizer on quali ty of winter w hea t w as mo re significant
than that o f manganese fertilizer. Only the content o f w et g luten and pro tein was effected by manganese
fertili zer.
Key words: potassium and manganese fer tili zer co opera ting application; winter wheat; rational ferti li za-
tion; nut rient content in plant; dryland
(上接第 108页 )
Molecular cy togenetic s tudy on the alien addition
lines of Triticum-Psathyrostachys
ZHAO Ji-xin
1
, CHEN Xin-hong
1
, WANG Xiao-li
1
,WU Jun
1
, FU Jie
1
,HE Bei-ru
1
, SUN Zhi-gang
2
( 1 College of Agronomy ,North west A& F Universit y , Yangling, Shaanx i 712100,China;
2 Shaanx i Prov ince Seed Industry Group Co. Ltd. ,X ian , Shaanxi 710016,China)
Abstract: The alien addi tion lines of Triticum-Psathy rostachys were detected by f luorescent in situ hy-
bridiza tion ( FISH) and chromosomes C-banding. FISH show s the alien addi tion line H9015-17-1-9 and
H9017-14-16-5 are all added wi th the tw o chromosomes of Psathyrostachys huashanica. The analysis using
the ch romosomes C-banding indicates that H9015-17-1-9 might be an alien addi tion line o f N
h
5 and H9017-
14-16-5 migh t be an alien addi tion line of N
h
6 .
Key words: Tritcium aestivum ; Psathyrostachys huashanica; alien addi tion line; f luo rescent in situ hy-
bridiza tion; chromosomes C-banding
113第 11期 张会民等:钾锰配施对旱地冬小麦植株养分含量及产量和品质的影响