全 文 ：第 28卷　第 2期
　2010 年 6 月　 　 　
四川农业大学学报
Journal of Sichuan Ag ricultur al Unive rsity
　 　 Vol.28　No.2
Jun.2010
　　收稿日期:2009- 12- 13
责任作者:杨春华(E-mail:ychh@sicau.edu.cn)
不同激素配比对草地早熟禾愈伤组织形成的影响
张文君 , 杨春华 , 刘　帆 , 陈灵鸷 , 刘志波
(四川农业大学 动物科技学院 , 四川 雅安　625014)
摘要:以草地早熟禾(Poa pratensis L.)品种“午夜”的成熟种子及幼叶为外植体 ,M S 为基本培养基 , 研究不同外源
植物激素对其愈伤组织形成的影响。结果表明 ,成熟种子为最佳外植体 , 由成熟种子诱导出的愈伤组织的出愈率与
质量均高于叶片;MS+2 , 4-D 5.0 mg/ L培养基为成熟种子较为适宜的诱导培养基 ,诱导率达 50%。在 MS+2 , 4-D
5.0 mg/ L 继代培养基中 ,有黄绿色 、表面干燥的颗粒状愈伤组织长出。MS +2 , 4-D 7.0 mg/ L 是叶片较为适宜的
诱导培养基 ,诱导率为 34%, 但长出的愈伤组织表面多水分。
关键词:草地早熟禾;植物激素;愈伤组织
中图分类号:S543.035.3　　文献标识码:A　　文章编号:1000-2650(2010)02-0187-04
The Effects of Different Phytohormone Combinations on
Callus Induction of Poa pratensis L.
ZHANG Wen-jun , Y ANG Chun-hua , L IU F an , CHEN L ing-zhi , L IU Zhi-bo
(Colleg e of Animal Science and Technolog y , Sichuan Agricultural Univer sity , Yaan 625014 , Sichuan , China)
Abstract:In the current study , a kind o f mature seeds of kentucky blueg rass(Poa pratensis L.)
named `Midnight was used as the explants to compare dif ferent concentrations on callus induc-
tion o f blueg rass , where the M S as the basic culture medium.The data suggest that mature seeds
is the best explants due to thei r highe r rate and quali ty of the callus compare w ith tho se f rom the
leaves;MS+2 , 4-D (2 , 4-dichlorophenoxyace tic acid), 5.0 mg/L seems to be the be st suitable
culture medium for the mature seeds as the callus induction rate w as 50%, and dry-faced g ranula-
ted callus co lored yellow g reen in the follow ing generation of culture medium.Addit ionally , MS+
2 ,4-D(2 ,4-dichlorophenoxyacetic acid), 5.0 mg/ L w as suggested to be most sui table for leaves
w i th a callus induction rate at 34%, al though there w ere some w ashy callus w as observed in here-
in study .
Key words:kentucky blueg rass (Poa pratensis L.);phy tohormone;callus
　　草地早熟禾(Poa pratensis L .)属禾本科早熟
禾属植物 ,具草质柔软 ,颜色光亮鲜绿 ,绿期长等优
点 ,适宜于公园 、医院 、学校等公共场所作观赏草坪 ,
也大量使用在高尔夫球场和运动场草坪 ,是世界上
使用广泛的冷季型草坪草之一[ 1] 。但草地早熟抗旱
性不强 ,遇旱地上部分容易变褐色 。同时草地早熟
禾具有兼性无融合生殖的特性 ,给常规育种带来很
大的困难 ,利用现代生物育种技术 ,将目标基因导入
愈伤组织 ,可定向改良 ,缩短育种年限 ,提高育种效
率[ 2] 。对草地早熟禾组织培养研究最早起源于上个
世纪的 80年代 ,Mc Donnell和 Conger 以草地早熟
禾成熟胚为外植体 ,对它的组织培养特性进行了初
步研究[ 3-4] 。我国关于草地早熟禾再生体系的建立
和转基因方面的研究起步较晚。皮伟 、丁路民 、刘庆
昌 、高丽美等人选取不同的培养基 、不同的外源激素
和不同外植体对此做过相关报道[ 5-9] 。本实验除采
用常规外植体草地早熟禾成熟种子为外植体外 ,还
采用取材方便的幼叶为外植体材料 ,研究不同的外
　　　 四川农业大学学报 第 28卷
源激素和外植体对其愈伤组织形成的影响 ,进而为
草地早熟禾的基因育种工程奠定基础。
1　材料和方法
1.1　材　料
1.1.1　植物材料
草地早熟禾品种“午夜”的成熟种子 ,由百绿集
团提供 ,发芽率 60%。
1.1.2　植物激素
激素:2 ,4-D(2 , 4-二氯苯氧乙酸), NAA(萘乙
酸), 6-BA(6-苄基氨基嘌呤)。
2 ,4-D和 NAA 用少量无水乙醇溶解后 , 加蒸
馏水配成 1 mg/mL 的母液 ,于 4 ℃下保存。6-BA
用少量 10%的氢氧化钠溶解后 ,加蒸馏水配成 1
mg/mL 的母液 ,于 4 ℃下保存 。
1.2　方　法
1.2.1　培养基
基本培养基由 MS 大量元素 、MS 微量元素 、
MS 铁盐 、B5有机元素 ,附加 30.0 g/ L蔗糖 、5.8 g/
L 琼脂粉。培养基在高压灭菌前调整 pH 至 5.8。
1.2.2　种子培养
将草地早熟禾种子置于 75%的酒精中灭菌 10
s ,取出用无菌水冲洗 3次 ,再将种子浸于 0.1%的
升汞中灭菌约 10 min ,最后用无菌水冲洗 4 ～ 6次 ,
在超净工作台上 ,用枪状镊接种到不同配方培养基
中(表 1),在(25±2)℃的条件下 ,黑暗培养 ,每隔 3
d观察并记录愈伤组织诱导情况 。
表 1　不同培养基激素配方
Table 1　Different hormone formulations medium
/(mg· L-1)　
处理 T reatment 2 , 4-D 6-BA NAA
1 1.0 0 0
2 3.0 0 0
3 5.0 0 0
4 7.0 0 0
5 0 2.0 1.0
6 0 4.0 0.5
7 0 2.0 0.5
8 0 4.0 1.0
1.2.2　继代培养基筛选
上述各处理培养基在(25±2)℃黑暗条件下培
养60 d ,统计出愈率 ,选出愈率最高的培养基为愈伤
组织的继代培养基。
1.2.3　叶片培养
将消毒灭菌的草地早熟禾种子接种于 MS 培养
基上 ,(25±2)℃黑暗培养 1 周后在 16 h光照 8 h
暗照 ,光照度 2 000 lx 条件下继续培养 , 待苗长至
3.0 ～ 4.0 cm 的时候将叶片切取下来 ,分成约为 0.5
cm的小段分别接种在表 1所示的处理 1 ～ 4诱导培
养基上 ,在(25±2)℃的条件下黑暗培养 。每隔 3 d
观察并记录愈伤组织诱导情况。
2　结果与分析
2.1　不同激素配比对愈伤组织的形成的影响
2.1.1　不同激素配比对草地早熟禾种子愈伤组织
诱导频率的影响
草地早熟禾种子在诱导培养基上黑暗培养 30 d
左右 ,陆续产生了一些淡黄色 、表面湿润的愈伤组织
(图 1)。继续黑暗培养 ,愈伤组织面积逐渐扩大 ,此
时的愈伤组织是质地疏松 、表面平滑 、透明状的非胚
性愈伤组织 。继续培养满 60 d后 ,统计出愈率于表
2。
表 2　不同激素配比对草地早熟禾
种子愈伤组织诱导率的影响
Table 2　Ef fect of different phytohormone
combinations on callus induction frequency
from seeds of Poa pratensis L.
处理
T reatment
种子数
No.o f
primary
seeds /粒
发芽数
No.of
shoots/粒
愈伤组织数
No.of callus
tissue/块
诱导频率
Induction
f requency/ %
1 50 32 9 28.12Aa
2 50 29 14 48.27Bb
3 50 32 16 50.00Bc
4 50 31 10 32.26Cd
5 50 27 9 33.33Cd
6 50 25 8 32.00Cd
7 50 31 11 35.48De
8 50 26 9 36.61De
　　注:1.愈伤组织诱导频率为“愈伤组织数/发芽数” ;2.
同列数据后所标字母不同表示差异达显著水平(P <0.05 ,
小写字母)或极显著水平(P<0.01 , 大写字母)。
No te:1.The induction fr equency o f ca llus calculated by
No.of callus/ No.of shoots;2.Different letter s showed sig-
nificntly difference (capital letter s means P >0.01 , small
letters means P<0.05).
由上表可知 ,在不同浓度的 2 , 4-D的处理下 ,实
验结果差异显著 ,处理 MS+2 ,4-D , 3 mg/L 和处理
MS+2 ,4-D , 5 mg/L 愈伤组织的诱导频率最高 ,分
别达到 48.27%和 50%。不同浓度配比的 6-BA 和
NAA 诱导结果差异见表 2 ,处理 5和处理 6差异不
显著 ,处理 7和处理 8差异不显著。实验表明 ,2 , 4-
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第 2 期 张文君(等):不同激素配比对草地早熟禾愈伤组织形成的影响 　　　
D的浓度在 3 和 5 mg/L 时 ,有利于愈伤组织的形
成 ,选用处理 2和处理 3为愈伤组织的继代培养基 。
图 1　种子诱导产生的愈伤组织
Figure 1　Callus induced from mature seeds bluegrass
2.1.2　继代愈伤组织生长情况
将长势良好的愈伤组织转接入筛选出的愈伤组
织的继代培养基中(处理 2和处理 3)。在继代培养
基中培养 15 d后 ,部分愈伤组织表面长出比较致
密 、干燥的黄绿色胚性愈伤组织(图 2),而没长出胚
性愈伤组织的那部分 ,则呈不透明的黄褐色块状 ,还
有一部分发生褐变(图 3)。实验结果表明 ,在 2 ,4-
D ,5.0 mg/ L 培养基中 ,愈伤组织的生长情况较好 ,
出愈率达到 30%。
表 3　继代愈伤组织生长情况
Table 3　The follow callus growth state
处理
T reatments
接种数
No.of
nocula tion
/块
出愈数
No.o f
callus
inducing/块
出愈率
No.o f
callus
inducing
ratio / %
生长状况
Grow th
state
2 50 7 17
黄白色 , 表面湿润 , 呈光滑的块状
3 50 15 30
黄绿色 , 表面较干燥 , 呈瘤状突起
　　注:出愈率为“出愈数/接种数” 。
No te:The inducing ratio o f callus calculated by No.of
callus inducing/ No.o f inoculation.
2.2　不同外植体对愈伤组织形成的影响
相同 2 ,4-D浓度下 ,成熟种子和叶片的愈伤出
愈率差异明显 ,但二者都随 2 ,4-D浓度升高诱导率
升高 ,当 2 ,4-D浓度为 5 mg/L 时 ,种子的诱导率不
再升高 ,叶片的诱导率在 2 , 4-D 达到 7 mg/L 时仍
无下降趋势(表 2 、4)。在相同条件下 ,用种子诱导
出的愈伤组织生长情况要好于由叶片诱导出的愈伤
组织 ,叶片长出的愈伤组织表面多水渍。叶片的诱
导速度快于种子 ,通常在接种 10 d 后 ,切口端开始
膨大 ,且有淡黄色块状的愈伤组织逐渐长出(图 4),
而种子在接种 30 d左右才有愈伤组织出现。
图 2　胚性愈伤组织
Figure 2　Embry calluses of bluegrass
图 3　褐变的愈伤组织
Figure 3　Brown stain callus
图 4　叶诱导产生的愈伤组织
Figure 4　Callus induced from of leafs
3　讨　论
3.1　激素对不同外植体愈伤组织形成的影响
愈伤组织诱导实验中外植体的选择上一直是研
究的重点 , 1995 年 V an der Valk P 等人[ 10] 在相同
的培养条件下采用幼穗和成熟种子为外植体 ,幼穗
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　　　 四川农业大学学报 第 28卷
表 4　不同浓度的 2 , 4-D对草地早熟禾
叶片诱导愈伤组织形成的比较
Table 4　Different densitys 2 , 4-D injuries the comparison
which to the lawn precocious standing grain seed and
the leaf blade induction the organization forms
处理
T reatment
接种数
No.o f
inoculation/块
愈伤组织数
No.o f ca llus
tissue/块
诱导频率
Induction
f requency/ %
1 50 2 4.00Aa
2 50 8 16.00Bb
3 50 12 24.00Cc
4 50 17 34.00Dd
　　注:同列数据后所标字母相同表示差异不显著(P >
0.05);字母不同表示差异达显著水平(P<0.05 , 小写字母)
或极显著水平(P <0.01 , 大写字母)。
No te:Values with the diffe rent letter s in the same row
mean significant diffe rence be tw een the trea tments at 5%
(small le tte r)o r 1%(capital letter)leve l.How ever , value s
with the same letter in the same row mean no significant
diffe rence between the treatments(P>0.05).
的分化率为 79%,而成熟种子的分化率只有 3%,但
是以幼穗为外植体受季节性影响较大 ,如果错过 ,就
会影响整个实验进程 。2006年 ,段碧华等人[ 11]以幼
穗 、成熟种子和胚轴为外植体来诱导愈伤组织 ,实验
结果表明胚轴和成熟种子的出愈率相近 ,但是胚轴
诱导步骤比较复杂 ,且不易选取正确部位。2007
年 ,陈智勇等[ 12] 以草地早熟禾的叶为外植体 ,发现
叶的出愈率为 0%。本次实验除采用成熟种子为外
植体外 ,还采用幼叶为外植体 ,实验结果表明 ,成熟
种子的出愈率为最高可达 50%;叶片是可以长出愈
伤组织的 ,出愈率最高达 34%,但由叶片长出的愈
伤组织表面水分多 ,质量明显不如由成熟种子诱导
出的愈伤组织 ,而愈伤组织生长质量的好坏 ,直接影
响到以后的分化实验 。综合以上各方面因素 ,选用
成熟种子为诱导愈伤组织的外植体是最适宜的。
3.2　不同激素对草地早熟禾愈伤组织形成的影响
植物激素是组织培养中除了遗传因素以外的一
个非常重要的因素 ,并且难以掌握 。通常高浓度的
生长素和低浓度的激动素有利于愈伤组织的诱导和
增值[ 13] 。2 , 4-D 是草地早熟禾组织培养中起决定
性作用的植物激素 ,在本次实验发现 ,随着 2 ,4-D浓
度的不断升高 ,愈伤组织的诱导率也不断升高 ,但是
当 2 , 4-D浓度升高到 5.0 mg/L 的时候种子的诱导
率就不在升高 。这个结论与段碧华等人[ 11] 的实验
结论不符 ,这可能是由于选用不同的草地早熟禾品
种原因造成的。
6-BA 和 NAA 也是组织培养中常用的植物激
素 ,在本次实验中 ,在不同的浓度的配比下 ,草地早
熟禾的愈伤组织出愈率在 33.33%至 36.61%间变
化 ,较单独使用 2 , 4-D的出愈率低。这主要是由于
NAA 的主要作用是诱导丛生芽上具有良好的效
果 ,对愈伤组织的诱导效果不明显。
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(本文审稿:文　涛;责任编辑:秦碧雯;英文编辑:刘益平)
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