全 文 ：　　文章编号:1671-8151 (2002)03-0246-03
不同因子对虫胃实愈伤组织诱导及愈伤组织继代的影响
李凤霞 , 杨　鹏
(山西农业大学林学院 , 山西 太谷 030801)
摘　要:本文以虫胃实茎段 、 叶柄 、 叶片为外植体 , 将其培养于附加 BA和 NAA不同激素配比的 MS 或 B5 基本培养基
上。结果表明:在附加 BA 2 ㎎/L和 NAA 0.5 ㎎/L的 B5培养基上外植体出愈快 , 愈伤组织诱导率高。在愈伤组织
继代中 , 不同种类激素组合 、 激素浓度配比及不同琼脂浓度对愈伤组织的继代质量有不同影响:1%的琼脂浓度 、
BA 2 ㎎/ L+NAA 0.05 ㎎/ L时 , 愈伤组织生长速度适中 、 质地较致密﹑颜色翠绿 , 适合作进一步研究的材料。
关键词:虫胃实;愈伤组织;植物激素
中图分类号:Q949.781.2　　　文献标识码:A
The Effect of Different Factors on Callus Induction and Callus Subculture of Kolkwitiza.amabilis Gre-
abn
LI Feng-xia et al.
(Forestry College , Shanxi Agricultural University , Taigu Shanxi 030801 , China)
Abstract:Explants of Kolkwitiza.amabilis Greabn such as stem segment , petiole , leaf blade were cultivated in MS or B5 medium
with adding of different combination of BA and NAA to induct callus of Kolkwitiza.amabilis Greabn .The results show that on B5
medium which has BA 2 ㎎/ L and NAA 0.5 ㎎/ L , callus can be inducted faster and the rate of callus formed is higher .In callus
subculture , the study is concerned with different effect of agar concentration , hormone combination , hormone concentration and ra-
tio on callus growth.The result is as follow:1 percent agar concentration , BA as many as 40times NAA makes callus growth have
optimum rate and more compact texture , which is applicable for further study.
Key words:Kolkwitiza.amabilis greabn;Callus;Plant hormones
　　虫胃实 (Kolkwitiza.amabilis Greabn.)属忍冬科虫胃实属单属种 , 为我国特有种 。1985年 , 虫胃实首批被
定为我国国家三级保护植物[ 1] , 并被列入 《中国珍稀濒危保护植物名录》[ 2] 《中国植物红皮书》[ 3] , 和内
蒙古[ 4] 、 山西[ 5] 、华中[ 6]等省区珍惜濒危植物保护名录。目前 , 主要分布于我国山西 、 陕西 、河南 、 湖
北 、 安徽等省。由于过度放牧 , 樵采频繁 , 植被破坏严重 , 致使虫胃实天然分布区日益缩小 、 生境恶化 ,
天然更新不良 , 植株日趋减少 。利用组织培养方法诱导不同外植体产生愈伤组织 , 不但可以进行植株再
生研究 , 为保存和抢救濒危植物提供有效方法 , 而且还可以为虫胃实生物技术保存 , 建立虫胃实种质资源保
存基因库 , 提供细胞工程方面的途径和技术 。
1　材料与方法
1.1　试验材料
　　以山西农业大学植物园虫胃实的茎 、 叶柄 、叶片为外植体材料。
1.2　试验方法
在晴朗的中午取无病虫侵染的健康枝条 , 用自来水冲洗 2 ～ 3 h , 剪下叶 、 茎段切成 2 ㎝长移到超净
台上 , 茎段先用 70%酒精浸泡30 s , 再用 0.1%升汞消毒 5 min , 无菌水冲洗 5次 , 叶片用 70%酒精浸泡
15 s后再用 0.1%升汞消毒 3 min , 无菌水冲洗5次 。将材料接种到附加不同种类和浓度的细胞分裂素和
生长素的MS或 B5 培养基上诱导愈伤组织 。以 B5 为基本培养基 , 附加不同浓度配比的 BA和 NAA , 并
在不同浓度琼脂下对愈伤组织进行继代研究 。
001694　J .Shanxi Agric.Univ.
山 西 农 业 大 学 学 报
收稿日期:2001-12-24
作者简介:李凤霞 (1976-), 女 (汉), 山西翼城人 , 硕士 , 主要从事自然资源及濒危植物保护研究。
基金项目:山西省自然科学基金资助项目 (981088)
DOI :10.13842/j.cnki.issn1671-8151.2002.03.016
2　结果与分析
2.1　不同外植体及激素配比对愈伤组织诱导影响
　　将虫胃实茎段切成 0.5 ㎝左右 、将叶子切下叶柄 、成熟及幼嫩叶片切割后分别培养在 BA 2 ㎎/L 、
NAA 0.5 ㎎/L 的培养基进行培养。接种后一周 , 叶片发生膨胀 、 皱缩 , 接着在叶脉处长出粒状愈伤组
织 , 而茎段和叶柄的愈伤组织诱导较慢 , 颜色淡黄。
表 1　不同外植体愈伤组织诱导结果　　Table 1　Difference of different explants on K .amalibis callus induction
外植体类型
Explants type
接种数
No.of explants 诱导数No.of callus induction 出愈率%Rate of callus formed 愈伤组织生长速率Speed of callus induction 愈伤组织特征Character of cal lus
茎段
Stem segment
30 23 76.7 最慢
Most slowly
淡黄瘤状
Light yellow globe-like
叶柄
Petiole
51 40 78.8 较慢
More slowly
淡黄块状
Light yellow mass
成熟叶
Grown leaf blade
35 31 91.1 较快
Faster
翠绿粒状
Green granulate
幼叶
Young leaf blade
26 26 100
最快
Fastest
翠绿粒状
Green granulate
从培养30 d的结果 (表 1)可以知:几种不同外植体均能诱导出愈伤组织但效果不同 , 其中以叶片
诱导效果好 , 尤其是幼嫩叶片 。同时在不同时期取茎段 、 叶柄 、叶片进行愈伤组织诱导比较 , 发现在生
长旺盛的五至七月叶片诱导率在 90%以上 , 茎段及叶柄也在 75%以上 , 而在生长的末期 9至 11月则叶
片愈伤组织诱导率下降至 60%。
将幼嫩叶片接种到不同浓度细胞分裂素和生长素的MS或 B5培养基上 , MS培养基较 B5 培养基褐变
严重 。在相同激素浓度配比下 , 激素种类对愈伤组织生长质量影响各不相同 , 在附加 BA和NAA的培养
基上 , 愈伤组织颜色翠绿 , 质地紧密 , 多为粒状结构 。而 BA与 IBA 、 BA与 IAA组合 , 愈伤组织均不同
程度的松软 , KT 与 NAA组合形成的愈伤组织则多为雪片状结构 , 质地松脆 , 进一步继代则形成乳白色
质地十分松软的愈伤组织 , 这种愈伤组织生长速度极快寿命很短 (不足 20 d)。
表 2　植物激素浓度及基本培养基对外植体愈伤组织诱导影响
Table 2　Effect of plant hormones and basic medium on K .amalibis callus induction
培养基 (㎎/ L)
Medium
出愈率%
Rate of Callus formed
出愈速度
Speed of callus formed
生长量
Quantity
颜色
Colors
质地
Texture
B5 92 慢 Slowly 一般 Average 绿色 Green 紧密 Compact
MS+BA2+NAA0.5 85 慢 Slowly 很少 Very little 绿色 Green 紧密 Compact
MS+BA2+IBA0.1 87 慢 Slowly 很少 Very little 浅绿 Light green 稍松散 A little loose
MS+BA2+IAA0.5 83 慢 Slowly 多 Many 乳白 Milk-white 松软 Soft
MS+KT2+NAA0.1 85 慢 Slowly 少 A litt le 淡黄 Light yellow 松脆 Loose and crisp
B5+KT2+NAA0.5 92 快 Fast 较多 More 淡绿 Light green 松脆 Loose and crisp
B5+BA2+IAA0.1 91 快 Fast 最多 Most 乳白 Milk-white 松软 Soft
B5+BA2+IBA0.5 94 快 Fast 多 Many 淡黄 Light yellow 松散 Loose
B5+BA2+NAA0.1 90 快 Fast 多 Many 绿色 Green 紧密 Compact
从表 2可知 , 愈伤组织质地与激素浓度也有关 , 附加 BA 2 ㎎/L 和NAA 0.5 ㎎/L的愈伤组织粒小 ,
进一步继代时愈伤组织生长质量也好。因此虫胃实愈伤组织诱导培养基以 B5+BA 2 ㎎/L+NAA 0.5 ㎎/L
为好 。此外 , 在培养过程中还发现当培养温度超过 28℃时 , 愈伤组织褐变严重 。
2.2　不同培养因子对虫胃实愈伤组织继代的影响
将愈伤组织继代于附加不同浓度 BA和NAA的 B5 培养基上 , 结果表明继代培养愈伤组织的生长质
量与 BA/NAA的倍率相关性很大 , 而与它们实际浓度的大小关系不大 。从表 34周后的结果可知 , 在相
同倍率 (50倍)下 , 无论激素水平是 5 ㎎/L 还是 0.5 ㎎/L 愈伤组织均质较松脆 、 粒大色浅黄。BA/
NAA为 40时增殖的愈伤组织大部分质地较紧实。将几种质地不同的愈伤组织分别接种于 B5 +BA
2 ㎎/L+NAA 0.1 ㎎/L上 , 结果表明不同质地的愈伤组织接种到相同的培养基上 , 反应也有所不同。其
中 , 颜色翠绿 , 在愈伤组织上有深绿色斑块的愈伤组织在生长前期能增生出质地较紧实 、颜色翠绿 、 粒
状或非粒状的愈伤组织。而质地松软 、 颜色淡黄或乳白的愈伤组织则很快就增生出质地基本相同 、颜色
2472002　　　　　　　　　　李凤霞等:不同因子对 实愈伤组织诱导及愈伤组织继代的影响
相同的愈伤组织 , 而且 , 这两种愈伤组织无论在何中激素水平的培养基上表现都基本相同。淡绿色 、 雪
片状质地松脆的愈伤组织是介于质地紧实和松软之间的一种愈伤组织 , 将其继代增殖的愈伤组织多为淡
黄色 , 质地松软 。可见 , 愈伤组织的生长状况受其来源影响很大。此外 , 将质地一致的愈伤组织继代于
不同琼脂浓度的培养基上 , 结果发现 , 低浓度的琼脂愈伤组织生长速度快质地疏松 , 较高浓度的琼脂下
愈伤组织生长速度适中。因此虫胃实愈伤组织继代时 , 以 1%浓度 , BA/NAA不超过40为好 。
表 3　激素浓度配比对愈伤组织继代生长的影响
Table 3　Effect of the rate between BA and NAA on K .amalibis callus subculture
培养基 (㎎/ L)Medium 倍率 (倍)Times 愈伤组织生长情况　Status growth of callus
B5+BA0.5+NAA0.01 50 淡黄色　团块状松软　部分为雪片状松脆Light yellow masssoft (most), snow-like loose and crisp (some)
B5+BA0.2+NAA0.01 20 淡黄色　块状　质地稍松脆 Light yellow mass a little loose and crisp
B5+BA1+NAA0.05 20 淡绿色　粒状 (2-3 mm)　质地一般 Light green granulate (2-3mm)average texture
B5+BA2+NAA0.05 40 绿色　少量为粒状 , 大部分为紧实块状 Green granulate(some), compact mass(most)
B5+BA2+NAA0.1 20 淡绿色　粒状不明显　质地一般 Light green no evident granulate average texture
B5+BA3+NAA0.1 30 淡黄色　块状　质地稍松脆 Light yellow mass a little loose and crisp
B5+BA4+NAA0.1 40
大部分为绿色粒小 (1-2mm)质地较紧实 , 少数浅黄色粒大 (2-3mm)
Green granulate (1-2mm), more compact (most)light yellow big granulate (2-3mm)av-
erage texture (some)
B5+BA5+NAA0.1 50 浅黄色　块状　松软 Light yellow mass soft
3　讨　　论
　　虫胃实愈伤组织诱导受外植体 、 培养基及激素浓度的影响。不同外植体接种在相同的培养基上 , 愈伤
组织诱导有差异 。幼叶易产生愈伤组织 , 生长量较大。在试验的 MS 和 B5 基本培养基上 , 以 B5 为好 。
这其中与N元素的提供形式有关 , MS和 B5 培养基中N元素的总浓度基本相同 , 但 B5培养基中硝态氮
与铵态氮之比为 12∶1而 MS 培养基为2∶1。De Block (1990)认为在组织培养中 , NH+4 会富集在叶或茎
段内 , 不利于愈伤组织诱导。
自从 Skoog和崔徵 、 Skoog 和Miller提出植物激素控制植物组织分化理论以来 , 生长素与细胞分裂素
配比成为诱导组织脱分化和再分化的主要因素。一般认为 , 高浓度激素下生长的愈伤组织质地疏松 , 但
在本试验虫胃实愈伤组织继代中却发现 , 细胞分裂素与生长素比例的高低对继代愈伤组织的质地起直接作
用 , 而激素浓度大小对其影响则不大。
琼脂一直被认为是培养基固化剂 , 起支持培养物的作用。近几年来 , 人们对琼脂在组织培养中的作
用有了进一步的认识和发现 , 较高浓度的琼脂可降低试管苗的玻璃化[ 7] , 提高水稻胚性愈伤组织的分化
率[ 8] 。本试验中 ,琼脂浓度与继代的愈伤组织质量也有关系:在低浓度琼脂的培养基上 ,愈伤组织生长速
度较快 ,质地疏松 ,寿命较短 ,而较高浓度的琼脂则能平衡愈伤组织的生长速度 ,改善愈伤组织的质地。
愈伤组织本身的质地对其继代生长也有影响 。在虫胃实愈伤组织诱导和继代中 , 多次出现粒状愈伤组
织 , 这种愈伤组织在大蒜营养叶愈伤组织诱导中也出现。Harraek 等认为:这种粒状体是具分生能力 、
有结构的组织 , 但它们不会产生任何茎和根的原基 , 最后停止发育 。而在大蒜储藏叶外植体试验中却发
现 , 器官分化都是从这种粒状体中分化出来的 , 至于虫胃实的粒状愈伤组织是否具分化能力有待进一步研
究。
参　考　文　献
[ 1] 国家环境保护局自然保护司保护区与物种管理处.珍惜濒危植物保护与研究 [M] .北京:中国环境科学出版社 , 1991.
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