全 文 ：影响蝴蝶兰愈伤组织诱导因素的探讨
范树国 1, 2 , 胡　超 1 , 邱　璐 1, 2 , 杨海艳 1 , 李国树 1, 2 , 谢美华1 ,李应安 1
(1.楚雄师范学院化学与生命科学系 ,云南楚雄 675000;2.滇中高原生物资源开发与利用研究所 ,云南楚雄 675000)
　　摘要:以蝴蝶兰杂交种组培苗(Dtps.CoralGleam×P.ZumaRose-SamsonD)×f001(1296)为试验材料 ,利用正
交设计方法 L
16
(44)探讨在 MS培养基中 NAA、6-BA、AC(活性炭)、CM(椰子汁)4种因素对根尖切段及叶片切段愈
伤组织诱导的影响 , 结果表明:(1)当 NAA2.0mg/L+6-BA0.5mg/L+AC4.0g/L+CM 100 ml/L时 , 根尖切段诱导
出的愈伤组织没有经过继代培养基的培养就直接分化形成蝴蝶兰幼苗;(2)当 NAA0.2 mg/L+6-BA1.0 mg/L+AC
2.0 g/L+CM 100 ml/L时 ,根尖切段诱导率最高 , 达 30%;(3)叶片切段不适宜诱导愈伤组织。
　　关键词:蝴蝶兰;幼苗;愈伤组织;根尖;叶片
　　中图分类号:S682.310.4+3　　文献标志码:A　　文章编号:1002-1302(2009)06-0064-03
(上接第 63页)
4　小结
本研究表明 ,适宜甜樱桃优良品种 “巨红 ”茎段组织培养
技术体系如下:适宜的外植体灭菌条件为 75%乙醇灭菌 30 s
后 ,再用 5% NaClO灭菌 10 min;适宜的初代培养基为 MS+
6-BA1.0 mg/L+IBA0.1mg/L+7 g/L琼脂 +30g/L蔗糖 ,
萌芽率最高 ,为 85%;适宜的继代培养基为 MS+6 -BA1.0
mg/L+IBA0.2 mg/L+7 g/L琼脂 +30 g/L蔗糖 ,增殖系数
最大 ,为 5;适宜的生根培养基 MS+IBA2.0 mg/L+7 g/L琼
脂 +30 g/L蔗糖 ,生根最好 ,生根率达到 100%;在驯化过程
中 ,珍珠岩和沙土均可 ,存活率均达到 100%。将 “巨红 ”组培
苗移栽在中性壤土中 ,成活率 90%。
参考文献:
[ 1]安建平,焦成谨 ,王延璞 ,等.樱桃矮化砧木———莱阳矮樱桃组培
快繁技术研究 [ J] .西北园艺 , 2002(5):9-10.
[ 2]代红艳,张志宏 ,高秀岩 ,等.甜樱桃品种微繁体系的建立及优化
[ J] .果树学报 , 2004, 21(3):216-219.
[ 3]方宏筠 ,王关林.樱桃砧木新品系快速繁殖技术研究 [ J] .中国
果树 , 1988(3):25-27.
[ 4]韩文璞 ,袁明莲.中华矮樱桃的组织培养与快速繁殖技术 [ J].
中国农学通报 , 2000, 16(6):58-59.
[ 5]伍克俊 ,苟永平 ,贾福明.大樱桃脱毒试管苗移栽条件研究 [ J].
北方园艺, 1997(3):51.
[ 6] AncoraG, BenvenutoE, RoseliG, etal.Microprapagationofchery
rootstockF12/1clonesoriginatedfromirradiation:theisolationofsol-
idmutants[ J] .RivitaDelaOrtoflorofruticolturaItaliana, 1982, 66
(3):231-238.
[ 7] BuzkanN, CetinerS, Yalcin-mendiY, etal.Clonalpropagationof
diseasefreerootstockforsourandsweetcherybymeristemculture
[J].ActaHort, 1997, 441:329-332.
[ 8] CerovecR, RuzicD.Micropropagationofsourchery(Prunuscerasus
L.)[ J] .PlantCell, TissueOrganCulture, 1987, 9(2):151-152.
[ 9] HammatN.Promotricbyphloroglucinolofadventitiousrootformation
inmicropropagatedshootsofadultwildchery(PrunusaviumL.)
[J].ActaHort, 1994, 2:127-132.
[ 10] FerradiniN, FamianiF, ProiettiP, etal.Influenceofgrowthregula-
torsandlightoninvitroshootregenerationinM26 applerootstock
[ J] .JofHortSci, 1996, 71:859-865.
[ 11] ValeroM, IbanezA, MorteA, etal.Efectofhighvineyardtempera-
tureonthegrapevineleafrolassociatedviruseliminationfromVitis
viniferaL.cv.Napoleontissuecultures[ J] .ScientiaHorticulturae,
2003, 97(3/4):289-296.
　　蝴蝶兰(Phalaenopsisspp.)又称蝶兰 ,为兰科蝴蝶兰属 ,
属热带或亚热带的兰科植物 ,其花形美丽 ,色彩鲜艳 ,花期长
久 ,深受人们的喜爱 [ 1 ] 。
收稿日期:2009-02-11
基金项目:云南省中青年学术技术带头人后备人才培养计划(编号:
2006PY01-61);楚雄师范学院重点学科建设项目 (编号:
05YJJSXK03);楚雄师范学院学术带头人专项资助项目(编号:
05YJDTR08)。
作者简介:范树国(1965—),男 ,河北青县人 ,博士 ,教授 ,主要从事生
物化学及分子生物学研究。 Tel:(0878)3101953;E-mail:fansg@
cxtc.edu.cn。
通讯作者:邱　璐 ,副教授 , 主要从事植物组织培养及转基因研究。
Tel:(0878)3100507;E-mail:qiulu@cxtc.edu.cn。
　　蝴蝶兰的种子非常细小 ,不含有为种子萌发提供营养的
胚乳或其他组织 ,在自然条件下很难萌发 ,靠自然分株繁殖则
增殖系数很低 。因此 ,用组培方法快繁蝴蝶兰具有重要意义 。
愈伤组织诱导是分化出再生植株的第 1步 ,研究蝴蝶兰愈伤
组织的诱导具有重要的理论价值 。
关于蝴蝶兰愈伤组织的发生 , 国外也进行了相关研
究 [ 2 -5] 。国内学者伍成厚等进行了蝴蝶兰愈伤组织诱导的研
究 ,结果表明 ,授粉 30d后的蝴蝶兰子房适宜诱导愈伤组织 ,
在 1/4MS+2 , 4-D1.0mg/L+6-BA0.1mg/L+蔗糖 3.0%
培养基上 ,蝴蝶兰子房切段愈伤组织的诱导率达到 90.0%,
其诱导率较高 ,而以叶片为外植体则诱导率较低 [ 6] 。李成慧
等研究结果表明 ,蝴蝶兰叶片诱导类原球茎的最优组合是
NAA1.0 mg/L+肌醇 100mg/L+维生素 B1 5.0mg/L+琼脂
—64— 江苏农业科学　2009年第 6期
DOI :10.15889/j.issn.1002-1302.2009.06.111
粉 8 g/L的花宝 1号培养基 [ 7] 。徐晓薇等以蝴蝶兰粉红大花
型品系 T0、T10、T5和白花大花型品系 Hi的类原球茎为外植
体 , VW液体培养基 ,植物生长调节剂组合(6-BA0.01 mg/L
+2 , 4-D0.1mg/L)和较高蔗糖浓度(6%)能有效促进 PLB
的脱分化 , 形成类愈伤组织 [ 8 ] 。张启香 [ 9 ] 、崔广荣 [ 10 ] 、张
伟 [ 11] 、张秀清 [ 12] 、刘翠兰 [ 13]等学者也对蝴蝶兰组织培养进行
了研究 。
本试验以蝴蝶兰杂交种苗(Dtps.CoralGleam×P.Zuma
Rose-SamsonD)×f001(1296)为材料 ,研究了 MS培养基中
不同激素和添加物的种类和浓度对其愈伤组织诱导的影响。
1　材料与方法
1.1　材料
试验材料为蝴蝶兰杂交品种 (Phalaenopsishybrid)组培
苗(Dtps.CoralGleam×P.ZumaRose-SamsonD)×f001
(1296)。
1.2　方法
1.2.1　试验因素与试验水平设计　试验选用正交表 4因素
4水平 L16 (44)的设计 ,按照表 1的设计在 MS培养基中添加
不同浓度的 NAA(萘乙酸)、6-BA(细胞分裂素)、AC(活性
炭)、CM(椰子汁)。
表 1　试验因素及水平
因子水平 A:NAA(mg/L)
B:6-BA
(mg/L)
C:AC
(g/L)
D:CM
(ml/L)
1 0.2 0.5 1.0 50
2 0.5 1.0 2.0 100
3 1.0 3.0 3.0 150
4 2.0 5.0 4.0 200
1.2.2　运用正交试验设计操作　试验按照正交试验设计方
法对蝴蝶兰的根尖切段和叶片切段 2种外植体进行了 16种
试验设计组合(表 2)。共接种 80瓶蝴蝶兰根尖切段(每瓶 4
个根尖切段)和 80瓶蝴蝶兰叶片切段(每瓶 4个叶片切段)。
1.2.3　培养条件　接种好的培养瓶遮光暗培养 7 d,之后光
照培养 ,光照度为 1 500 ～ 2 000 lx,光照周期为 16 h/d,培养
温度为(26.0±1.0)℃,相对湿度为 14%。
1.2.4　诱导率的确定　接种 45 d后统计愈伤组织诱导率 。
愈伤组织诱导率 =(产生愈伤组织的外植体数 /外植体总
数)×100%。诱导率的确定以愈伤组织大于 1 mm×1 mm的
进行统计 ,不足 1 mm×1 mm的则不计 。
2　结果与分析
在培养过程中培养组织的表面形成一个个淡绿色的瘤状
突起 ,即为愈伤组织 。试验比较了根尖切段和叶片切段 2种
外植体对蝴蝶兰愈伤组织诱导的影响 ,由试验观察可知 ,从根
尖切段和叶片切段均可诱导出愈伤组织 。根尖切段最易形成
愈伤组织 ,接种 45d后 ,从切口处长出淡绿色及白色颗粒状
的愈伤组织;45 ～ 60 d,整个愈伤组织向上突起 ,形成淡绿色
瘤状的愈伤组织 。而叶片切段诱导愈伤组织则较困难 ,培养
45 d后 ,接种的 80瓶叶片切段只有 1个培养瓶中的 1个外植
体形成愈伤组织 。
　　试验结果 (表 3 、表 4)表明 :(1)当 NAA2.0 mg/L+
表 2　试验设计
处理 因子及水平
A B C D
1 1 1 1 1
2 1 2 2 2
3 1 3 3 3
4 1 4 4 4
5 2 1 2 3
6 2 2 1 4
7 2 3 4 1
8 2 4 3 2
9 3 1 3 4
10 3 2 4 3
11 3 3 1 2
12 3 4 2 1
13 4 1 4 2
14 4 2 3 1
15 4 3 2 4
16 4 4 1 3
表 3　正交表 L16(44)的设计和试验结果(根尖切段)
处理 因子及水平
A B C D
外植体
数量
(个)
愈伤组
织数量
(个)
愈伤
诱导率
(%)
愈伤组
织质地
1 1 1 1 1 20 2 10 淡绿色颗粒状
2 1 2 2 2 20 6 30 绿色瘤状　　
3 1 3 3 3 20 1 5 淡绿色瘤状　
4 1 4 4 4 20 1 5 淡绿色颗粒状
5 2 1 2 3 20 1 5 淡绿色瘤状　
6 2 2 1 4 20 1 5 淡绿色瘤状　
7 2 3 4 1 20 2 10 白色颗粒状　
8 2 4 3 2 20 1 5 淡绿色颗粒状
9 3 1 3 4 20 1 5 淡绿色颗粒状
10 3 2 4 3 20 5 25 淡绿色瘤状　
11 3 3 1 2 20 4 20 淡绿色瘤状　
12 3 4 2 1 20 2 10 淡绿色瘤状　
13 4 1 4 2 20 4 20 淡绿色瘤状　
14 4 2 3 1 20 2 10 淡绿色颗粒状
15 4 3 2 4 20 3 15 淡绿色颗粒状
16 4 4 1 3 20 2 10 淡绿色颗粒状
—65—范树国等:影响蝴蝶兰愈伤组织诱导因素的探讨
6-BA0.5mg/L+AC4.0g/L+CM100ml/L时 ,蝴蝶兰根尖
切段诱导出的愈伤组织没有经过继代培养基的分化就直接形
成蝴蝶兰幼苗;(2)在第 2组试验设计 ,浓度配比组合为 NAA
0.2 mg/L+6-BA1.0mg/L+AC2.0g/L+CM100 ml/L时 ,
有 5个培养瓶长出愈伤组织 ,诱导率最高 ,达 30%,此浓度配
比组合为蝴蝶兰杂交种诱导根尖切段愈伤组织的最佳组合;
(3)蝴蝶兰杂交种叶片切段不适宜诱导愈伤组织 。
表 4　正交表 L16(44)的设计和试验结果(叶片切段)
处理 因子及水平
A B C D
外植体
数量
(个)
愈伤组
织数量
(个)
愈伤
诱导率
(%)
愈伤组
织质地
1 1 1 1 1 20 0 0 —
2 1 2 2 2 20 1 5 淡绿色瘤状
3 1 3 3 3 20 0 0 —
4 1 4 4 4 20 0 0 —
5 2 1 2 3 20 0 0 —
6 2 2 1 4 20 0 0 —
7 2 3 4 1 20 0 0 —
8 2 4 3 2 20 0 0 —
9 3 1 3 4 20 0 0 —
10 3 2 4 3 20 0 0 —
11 3 3 1 2 20 0 0 —
12 3 4 2 1 20 0 0 —
13 4 1 4 2 20 0 0 —
14 4 2 3 1 20 0 0 —
15 4 3 2 4 20 0 0 —
16 4 4 1 3 20 0 0 —
　　运用 SPSS软件 ,对 NAA、6-BA、AC、CM4个因素的效
应进行方差分析 ,由表 5可知不同处理之间所得蝴蝶兰根尖
切段愈伤组织诱导率差异不显著 。对 NAA来说 , 4个水平浓
度都可以选用;对 6-BA来说 ,由于 1水平 、3水平 、4水平显
著高于 2水平 ,所以 1水平 、3水平 、4水平均可选用;对 AC
来说 , 4个水平浓度都可以选用;对 CM来说 ,由于 2水平显著
高于 1水平 、3水平 、4水平 ,所以选用 2水平 。
表 5　正交试验结果的方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F 方差
模式 887.500 12 73.958 3.944 0.143
处理间 2 256.250 1 2 256.250 120.333 0.002
NAA 181.250 3 60.417 3.222 0.181
6-BA 218.750 3 72.917 3.889 0.147
AC 206.250 3 68.750 3.667 0.157
CM 281.250 3 93.750 5.000 0.110
误差 56.250 3 18.750
总变异 943.750 15
3　讨论
本研究所进行的 4因素 4水平试验 ,如全面实施 ,要配制
4
4(256)种培养基 ,而利用正交设计 ,只用了 16种组合就达到
了目的 ,大大简化了研究方案 ,加快了研究进程 。但正交设计
是一种均一性设计 ,不可能含所有组合 ,所得到的最佳组合在
实际中的表现并不一定是最好的 。
当 NAA2.0 mg/L+6-BA0.5mg/L+AC4.0g/L+CM
100ml/L时 ,蝴蝶兰根尖切段在 MS培养基中诱导出的愈伤
组织没有经过分化培养基的培养就直接分化形成蝴蝶兰幼
苗 ,这属于 “一步成苗 ”现象 。该现象仅见于半夏、魔芋 、丹
参 、辣椒 、藠头 、小麦杂种 、云南疣粒野生稻 、栀子的组织培养
研究中 ,尚未发现有关于蝴蝶兰组织培养中出现一步成苗现
象的报道 。因此 ,下一步工作拟运用该培养基配方对蝴蝶兰
杂交种进行重复验证试验 ,如果这个试验能成功 ,就能实现该
蝴蝶兰杂交种组培苗根尖切段组织培养一步成苗 。
当 NAA0.2 mg/L+6-BA1.0mg/L+AC4.0g/L+CM
150ml/L时 ,蝴蝶兰根尖切段诱导率最高 ,达 30%。 NAA用
量和 6 -BA用量在所取的 4个水平中分别以 0.2 mg/L和
1.0mg/L为佳 。在诱导蝴蝶兰愈伤组织时 NAA常与 6 -BA
结合使用 ,具有促进细胞生长和分裂 、诱导愈伤组织、促进根
分化的作用 。由于 NAA和 6-BA剂量对根尖切段诱导愈伤
组织的影响较大 ,因此还有必要对于更低浓度水平的 NAA和
6-BA剂量作进一步的研究 。虽然 AC的作用不显著 ,但是 AC
加入培养基中主要是利用其吸附能力减少一些有害物质的影
响 ,如防止酚类物质污染而引起组织褐化死亡 ,这在兰花组织
培养中效果明显。另外 , AC对形态发生和器官形成有良好效
应 ,实际使用时 AC以 2.0 ～ 4.0g/L较为合适 。 CM也是使用
最多 、效果最明显的一种天然复合物 ,使用效果与其果实成熟
度及产地的关系也很大 ,一般使用浓度在 10% ～ 20%。
　　本试验所用蝴蝶兰杂交种组培苗叶片切段诱导愈伤组织
比较困难 ,是否是因为气候 、海拔等因素的影响 ,还有待继续
研究 。
参考文献:
[ 1]陈菁瑛 ,蓝贺盛 ,陈雄鹰.兰花组织培养与快速繁殖技术 [ M].
北京:中国农业出版社 , 2004:58-81.
[ 2] RotorG.MethodofvegetativepropagationofPhalaenopsisstemcut-
tings[ J] .AmerOrchidSocBul, 1949, 18:739-742.
[ 3] IntuwongO, SagawaY.ClonalpropagationofPhalaenopsisbyshoot-
tipculture[ J] .AmerOrchidSocBul, 1975, 93:893-895.
[ 4] IshiY, TakamuraT, GoiM, etal.Calusinductionandsomaticem-
bryogenesisofPhalaenopsis[ J] .PlantCelRep, 1998, 17:446.
[ 5]苏家乐 ,陈尚平 ,何小弟 ,等.蝴蝶兰类原球茎增殖影响因子初探
[ J] .江苏农业学报 , 2008, 24(6):979-982.
[ 6]伍成厚 ,叶秀粦 ,梁承邺.蝴蝶兰愈伤组织诱导研究 [ J].亚热带
植物科学, 2004, 33(4):29-31.
[ 7]李成慧 ,蔡　斌 ,单丽丽 ,等.应用正交设计法探讨蝴蝶兰叶片类
原球茎的诱导 [ J] .扬州大学学报:农业与生命科学版 , 2004, 12
(2):10-12.
[ 8]徐晓薇 ,林绍生 ,姚丽娟.蝴蝶兰类原球茎增殖和脱分化的研究
[ J] .浙江农业学报 , 2006, 16(4):12-13.
[ 9]张启香 ,方炎明 ,张晓平.蝴蝶兰的组织培养和快速繁殖 [ J] .植
物资源与环境学报 , 2004, 13(3):38-40.
[ 10]崔广荣 ,侯喜林 ,张子学 ,等.蝴蝶兰叶片离体培养胚状体的发
生及组织学观察 [ J] .园艺学报 , 2007, 34(2):431-436.
[ 11]张　伟 ,曾伏虎 ,张苏锋.蝴蝶兰的组织培养与快速繁殖 [ J].
信阳师范学院学报:自然科学版 , 2004, 17(3):335-337.
[ 12]张秀清 ,王志武 ,刘玉敬 ,等.蝴蝶兰实生苗不同器官的离体培
养[ J] .植物学通报, 1996, 13(1):50-53.
[ 13]刘翠兰 ,王小芳 , 李双云 ,等.蝴蝶兰花梗芽的组织培养 [ J] .山
东林业科技 , 2004(4):37.
—66— 江苏农业科学　2009年第 6期