全 文 ：第 28卷　第 4期
　2010 年 12 月　 　 　
四川农业大学学报
Journa l of Sichuan Ag ricultural Univ ersity
　 　 Vol.28　No.4
Dec.2010
　　收稿日期:2010- 11- 22
基金项目:四川省教育厅科研项目(09ZA077 and 09ZZ024)。
责任作者:颜泽洪(E-mail:zhyan104@163.com)
doi:10.3969/ j.issn.1000-2650.2010.04.001
新麦草(Psathyrostachys juncea)两个高分子量
谷蛋白亚基基因上游序列的克隆与分析
杨　帆 , 颜泽洪 , 代寿芬 , 韩　畅 , 胡喜贵
(四川农业大学小麦研究所 , 四川 温江　611130)
摘要:应用 PCR技术对新麦草 P I429801 和 P I406469 的高分子量谷蛋白基因上游序列进行了克隆 ,得到长度分别
为 998 和 1 000 bp的 HMW-N1 和 HM W-N2 序列。比较发现 ,HMW-N1 与麦类 HM W-GS 基因上游序列一致性在
85%以上 , 与滨麦(Leymus mollis)序列 DQ073542一致性最高 , 达 98%;HMW-N2与麦类 HMW-GS 基因上游序列
一致性在 81%以上 ,与二角山羊草(Aegi lops bicornis)序列 AY611726 一致性最高 , 达 98%。系统进化分析表明 ,
HMW-N1 与含 Ns染色体组的赖草属物种的同源基因序列 DQ073551 、FJ600498 和 DQ073546 亲缘关系最近 ,
HMW-N2 却与含 D染色体组节节麦和普通小麦的同源基因序列 FJ008134、AY248704和 DQ537337 以及含 S 染色
体组的山羊草物种的同源基因序列 AY611726、AY611721 和 AY611724 的亲缘关系较近。 同时 , HMW-N1 和
HMW-N2也具有 E-box 、N-box 、par tial Enhancer、complete Enhancer、TATA-box 和 Start 等高分子量谷蛋白基因启
动子区域的典型特征。本研究结果可为新麦草高分子量谷蛋白基因的克隆提供帮助 , 对从新麦草属以及其他小麦
近缘属物种中分离未知高分子量谷蛋白基因有参考价值和借鉴意义。
关键词:新麦草;高分子量谷蛋白;上游序列;序列分析
中图分类号:S54　　文献标志码:A　　文章编号:1000-2650(2010)04-0397-06
Isolation and Characterization of Upstream Sequences of Two
High-Molecular-Weight Glutenin Subunit Genes
from Psathyrostachys juncea
Y ANG F an , Y AN Ze-hong , DAI Shou-f en , HAN Chang , HU Xi-gui
(T riticeae Resea rch Institute , Sichuan Ag ricultural Univer sity , Wenjiang 611130 , Sichuan , China)
Abstract:The upstream sequences of tw o high-molecular-weight glutenin subunit genes , designat-
ed HMW-N1 and HMW-N2 , were cloned by PCR from Psathyrostachys juncea PI 429801 and PI
406469.At DNA level , HMW-N1 and HMW-N2 had 998 and 1 000 bp , respectively .Sequence a-
lig nments indicated that HMW-N1 and HMW-N2 show ed over 85% and 81%ident ity w ith those
of homo logous HMW-GS gene upstream sequences in nucleot ides in T ri ticeae species , and show ed
the highest identi ty o f 98%w ith DQ073542 of Leymus moll is and A Y611726 of Aegi lops bicornis ,
respectively.Polygenetic analy sis revealed that HMW-N1 and HMW-N2 demonst rated closer re-
lat ionship wi th homologous upst ream sequences f rom species of Leymus and Aegi lops than o ther
Trit iceae specie s.In addition , the two upst ream sequences obtained in this study had the typical
features of HMW-GS genes in promoter regions , such as E-box , N-box , partial Enhancer , com-
plete Enhancer , TATA-box and Start.The results may be helpful to cloning HMW-GS genes and give
a reference to isolate HMW glutenin gene from Ps.juncea , as well as other wheat wild relatives.
Key words:P sathy rostachy s juncea;HMW glutenin;upst ream sequences;sequence analysis
　　　 四川农业大学学报 第 28卷
　　高分子量谷蛋白(high molecular w eight g lute-
nin subunits , HMW-GS)是小麦种子贮藏蛋白的重
要组成部分 ,与小麦烘烤品质较为密切[ 1-3] 。在山羊
草 、黑麦 、簇毛麦 、赖草 、冰草 、偃麦草和大麦等小麦
近缘属植物中存在着丰富的 HMW-GS 遗传变异类
型[ 4-5] 。
普通小麦的 HMW-GS 是由 1A 、1B和 1D染色
体长臂上的 Glu-1位点基因编码的 ,对应于每个染
色体上的基因座位分别为 Glu-A 1 、Glu-B 1和 Glu-
D1 ,每一个位点都包含两个紧密连锁的基因 ,分别
编码分子量较大的 x-型和较小的 y-型亚基[ 6-7] 。不同
高分子量谷蛋白亚基对小麦的品质贡献各不相同 。
在发掘和利用小麦近缘属植物 HMW-GS 基因
方面 ,刘志杰等[ 8] 对小伞山羊草(Aeg ilops umbel lu-
latum , 2n=14 , UU)的 Ux 和 Uy 进行了克隆 、测
序和分析 ,认为它们与 D基因组编码的 HMW-GS
在进化上具有较高的相似性;A.D.Busto s等[ 9-10] 对
黑麦(Secale cereale , 2n=14 , RR)Glu-R 1 位点编
码的 HMW-GS等位基因进行了分析 ,为利用黑麦
基因资源改善小麦品质提供了理论依据;李少芳
等[ 11]对二倍体 、四倍体和六倍体扁穗冰草(Agro-
py ron cristatum , 2n=14/28/42 , PP/PPPP/PPPP-
PP)研究发现 Bty1 、Bty2 、Bty3 、Bfy1 、Bsy1 和 Bsy2
是兼具有 x-和 y-型亚基特征的新类型;Li Z .X.
等[ 12]在拟鹅观草(P seudorogneria stipi f ol ia , 2n=
14 , StS t)中发现其 y-型基因具有 x-型特异的序列
LAAQ LPAMCRL;Jiang Q.T .等[ 13] 对较多的小麦
族物种的上游序列进行了研究为麦类高分子量谷蛋
白基因的起源与演化奠定了基础。
新麦草(Psathy rostachys juncea , 2n=14 , NsNs)
是新麦草属的一个多年生种 ,主要分布于欧亚地区的
草原及半荒漠以及我国的新疆和青藏高原等地区 ,它
是新麦草属中唯一具有饲用价值的草种 。由于其抗
旱 、抗寒 、耐盐碱以及广泛适应性引起了广泛关注 。
D.R.Dew ey等[ 14]确认新麦草属的染色体组为 Ns ,是
赖草属(Leymus Hochst.)Ns染色体组的二倍体供
体。上世纪 80年代我国研究者 Chen Q.等[ 15] 首次将
新麦草与普通小麦中国春杂交成功。本研究对新麦
草 HMW-GS 基因上游序列进行了研究 ,为进一步
认识和利用新麦草 HMW-GS基因奠定理论基础。
1　材料和方法
1.1　供试材料
供试材料新麦草居群 PI429801和 PI406470来
自美国国家种质基因库 。
1.2　试验方法
1.2.1　基因组 DNA 提取
每个居群剪取非同一植株的 5片幼叶 ,液氮研
磨后 ,用 2 ×CTAB 法提取基因组总 DNA [ 16] , 将
DNA 溶于适量的 1×TE(pH 8.0),于-20 ℃保存
备用。
1.2.2　PCR扩增
根据 NCBI数据库中相关 y-型序列设计了一对
引物 ,序列分别为 PPF , 5′-agg , gaa , aga , caa , tgg ,
aca , tg-3′和 PPR ,5′-tag , t t t , cct , aga , ggc , ctc , acc , t-
3′。PCR反应总体积为 25 μL , 其中含有 2×GC
buf fe rⅠ 12.5 μL ,各 200 μmol/ L 的 4 种 dN TP 4
μL ,50 μmol/ L 引物各 0.5 μL , 1.25 U ExTaq酶 ,
200 ng 基因组 DNA , 加超纯水至总体积 25 μL。
PCR反应程序为:94 ℃预变性 1 min ,然后以 94 ℃
变性 30 s ,60 ℃退火 30 s , 72 ℃延伸 2 min ,进行 30
个循环 ,最后以 72 ℃延伸 7 min。PCR扩增产物在
0.8%琼脂糖凝胶上分离 ,90 W 恒定功率下电泳。
1.2.3　PCR产物克隆 、测序及序列分析
将目的 DNA 条带回收 、纯化并连接于 pMD19-
T 载体。连接产物转化大肠杆菌 DH10B 感受态细
胞 ,在含 50 μg/μL 的氨苄培养基上进行培养。从
转化子中挑选阳性克隆划单斑过夜培养 ,穿刺菌送
北京六合华大基因科技股份有限公司测序 ,每个片
段挑选 3 个克隆进行测序。利用 NCBI 网址中的
BLAS T 软件(ht tp://www .ncbi.nlm.nib.gov/
BLAS T/)进行核苷酸序列分析 。
1.2.4　核酸序列的系统进化分析
将获得的两个新麦草 HMW-GS基因上游序列
与一致性较高且分别代表麦类不同染色体组物种的
同源基因上游序进行一致性比较 ,并利用核苷酸序
列用 MEGA 5.0构建系统进化树 ,自展次数 1 000 ,
当序列间存在配对缺口时采用完全缺失(Comple te
Deletion)。
2　结果与分析
2.1　PCR扩增 、目的片段回收与 T-载体克隆
用特异引物 PPF 和 PPR 对 PI429801 和
PI406469基因组 DNA 进行扩增 , 均获得一条约
1.0 kb的 PCR片段(图 1),此片段大小与预期的高
分子量谷蛋白基因上游序列长度相当 ,分别对目的
片段回收纯化 、连接及转化。从转化子中筛选出阳
性克隆进行测序。
398
第 4 期 杨　帆(等):新麦草(Psathy rostachy s juncea)两个高分子量谷蛋白亚基基因上游序列的克隆与分析 　　　
　　M:分子量标准;1:新麦草 P I429801;2:新麦草
PI406469。
Lane M: DNA Marker; Lane 1: Ps.juncea
PI429801;Lane 2:Ps.j uncea PI406469
图 1　PCR 扩增新麦草高分子量谷蛋白基因上游序列
Figure 1　PCR amplif ication of HMW-GS gene
upstream regions in Ps.j uncea
2.2　新麦草高分子量谷蛋白基因上游序列分析
测序 结 果 显 示 , 从 新 麦 草 PI429801 和
PI406469中分别得到一个高分子量谷蛋白基因上
游序列 ,其核苷酸长度分别为 998 bp和 1 000 bp ,暂
定名为 HMW-N1和 HMW-N2。前者包括 859 bp
的上游序列和 139 bp的部分编码区 ,后者包括 867
bp的上游序列和 137 bp的部分编码区(图 2)。
利用上游序列所含的部分编码区的信号肽和
N-末端前 8个氨基酸在 NCBI数据库中进行搜索发
图 2　HMW-N1和 HMW-N2序列中包含的部分基因编码区
Figure 2　Structure of partial coding region
in HMW-N1 and HMW-N2
现(表 1), 与 HMW-N1 的信号肽前 8 个氨基酸
MAKQLVLF 完全一致的序列有 3 个 ,分别来自黑
麦及赖草属物种。与 HMW-N1的信号肽前 8个氨
基酸 MVKRLV LF 完全一致的序列有 4个 ,分别来
自节节麦和普通小麦。而与 HMW-N 1和 HMW-
N2的 N-末端前 8个氨基酸 EGEASRKL 完全一致
的序列则多达 45个 ,其中绝大多数来源于小麦属和
山羊草属 ,也有一些来自小麦的近缘属 ,如黑麦 、偃
麦草属 、簇毛麦属和鹅观草属等 。
两个序列均含有完整的 E-box 、N-box 、par tial
Enhancer 、complete Enhancer 、TA TA-box 和 S tart
等高分子量谷蛋白基因启动子区域的典型元件 ,二
者的典型结构 N-box 有一个碱基差异 ,同时 ,在其
他部位也有碱基替换 、插入或缺失(图 3)。
2.3　新麦草 HMW-GS 基因上游序列与已知麦类
同源基因上游序列的比较
序列比对表明:HMW-N1和 HMW-N2分别与
表 1　与新麦草 HMW-GS基因信号肽和 N-末端部分氨基酸序列完全一致的同源基因
Table 1　Homologous genes with the same partial sequences with HMW-GS of Ps.juncea
in signal peptide and N-terminal , respectively
氨基酸 Amino acids 物种及氨基酸序列号 Species and amino acid sequences
与 HMW-N1 信号肽前 8个氨基酸
M AKQLVLF 完全一致的序列
S.cereale(ADC79689 , CAC40674 , CAC40680 , CAC40670)
L.racemosus(AAZ29571)
L.mollis(AAZ29568)
与 HMW-N2 信号肽前 8个氨基酸
M VKRLVLF 完全一致的序列
Ae.tauschii (ACM41582 , AAR04373 , ABB45396)
T.aestivum(CAE00556)
与 HMW-N1 和 HMW-N2 N-末端
前 8 个氨基酸 EGEAS RK L完全一
致的序列
Ae.kotschy i (ACN88680)
Ae.longissima (ACV04768)
Ae.markgra f ii (ACV04770)
Ae.tauschii (ADI72732 , ACM41582 , ACT32451 , AC T32450 , ACT32449 ,
ACR82495 , ABZ10969 , AAV52920)
T.aestivum (CAE00553 , ACD37913 , ACD44935 , ACL82342 , ABX39536 ,
BAF96643 , ABX89296 , ABX64443 , ABQ14771 , ABO86195 ,
ABN71647 , ABN71646)
T.monococcum (ACH 81935 , ACH 81934 , ACH 81933)
T.timopheevii (ADJ67682 , ACC44144 , ACC44143)
T.turgi dum (ACH81936 , ABR04074)
T.urartu(ACJ35481 , ACH 81932 , ACH 81931)
Th.intermedium(ABO33337 , ABO33340 , ABO33336)
Th.ponticum (ACV95615 , ACV95617 , ACV95618 , ACV95619)
S.cereale(ADC79690)
E.ciliaris(ACM63363)
Ha.vi llosum (ACM63351 , ACM63352)
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　　　 四川农业大学学报 第 28卷
图 3　HMW-N1 和 HMW-N2 上游序列主要结构区
Figure 3　Schematic structure of upstream sequences of HMW-N1 and HMW-N2
麦类高分子量谷蛋白基因上游序列的核苷酸一致性
在 81%～ 98%不等 。其中 , HMW-N1 与滨麦(L .
mollis , 2n=4x=28 , N sNsXmXm)HMW-GS 基因
上游序列 DQ073542 的一致性最高 ,为 98%, 与多
枝 赖 草 (L .multicaulis , 2n = 4x = 28 ,
NsNsXmXm)和大赖草(L.racemosus , 2n=4x =
28 , NsN sXmXm)HMW-GS 基 因 上 游 序 列
DQ073546和 DQ073551的一致性也达到了 97%。
而 HMW-N2与二角山羊草(Aegi lops bicornis , 2n
=14 , SS)AY611726 、节节麦(Ae.tauschii , 2n=2x
=14 , DD)FJ008134 和 、AY248704 以及普通小麦
(T.aestivum , 2n =6x =42 , AABBDD)DQ537337
等 HMW-GS 基因上游序列的一致性最高 , 均为
98%。两者均与百萨偃麦草(Th.bessarabica , 2n=
14 , EE)的高 分子 量谷蛋 白基 因上 游序 列
EU074257的一致性最低 ,分别为 85%和 81%(表
2)。
2.4　新麦草 HMW-GS基因上游序列与麦类同源
基因上游序列的系统进化关系
进化分析表明 , HMW-N1和 HMW-N2与百萨
偃麦草的 HMW-GS 基因上游序列处于不同的分
支 ,二者间又处于不同的亚分支(图 4)。与 HMW-
N1处于同一分支的序列 DQ073551 、DQ073546 、
FJ600498和 DQ073542均来自含 Ns基因组的赖草
属物种。与 HMW-N2处于同一分支的序列来自含
D和 S 基因组的山羊草属物种 ,它们与来自普通小
麦 、黑麦 、偃麦草 、带芒草以及大麦等属物种的一些
HMW-GS基因上游序列形成平行的分支 。据此认
为 ,新麦草 PI429801的 HMW-GS 基因上游序列可
能与含 N s基因组的赖草属物种的谷蛋白基因亲缘
关系较近 ,而 PI406469的 HMW-GS基因上游序列
可能与山羊草属含 D 和 S 基因组物种的谷蛋白基
因亲缘关系较近。由于在包含两者的分支上均同时
有 x-和 y-型基因序列 ,因此 ,目前尚不清楚得到的
上游序列是来自 x-还是 y-型基因。
3　讨论
利用 PCR方法进行 HMW-GS 基因克隆 ,测序
并进行序列比较是目前研究谷蛋白基因的常用方法
之一。在利用 PCR法进行同源基因克隆的过程中 ,
引物设计十分重要 。本研究表明 ,两个新麦草高分
子量谷蛋白基因上游序列所包含的信号肽序列均存
在差异 ,其中 HMW-N2 所包含的基因信号肽序列
前 8个氨基酸只存在于普通小麦和节节麦的同源基
因中 ,而 HMW-N1基因的信号肽序列前 8个氨基
酸存在于黑麦和赖草属物种的同源基因中。可见 ,
不同新麦草居群的 HMW-GS 基因信号肽序列差异
较大。但二者的 N 端前 8个氨基酸序列则存在于
大量的小麦和山羊草物种的同源基因中 ,因此 ,在进
行新麦草HMW-GS基因克隆时 ,可以将其中一个
400
第 4 期 杨　帆(等):新麦草(Psathy rostachy s juncea)两个高分子量谷蛋白亚基基因上游序列的克隆与分析 　　　
表 2　GenBank中与新麦草 HMW-GS基因上游相似的核苷酸序列
Table 2　Similar HMW-GS upstream DNA sequences derived from GenBank database
物种
Species
基因组
Genome
序列类型
Sequences type
序列一致性
Sequence Identities/ %
与 HMW-N1 与 HMW-N2
T.aestivum AABBDD DQ537337 (x-或 y-型) 88 98
T.tur gidum AABB AY848709(x-型) 88 86
Ae.tauschii DD FJ008134(x-或 y-型)
AY248704(y-型)
88
87
98
98
Th.elongatum EE AY280615(y-型) 88 87
Th.bessarabica EE EU074257 (y-型) 85 81
Er.bonaepartis FF EU074240 (y-型) 90 87
H.pili f erum QQ EU074239 (y-型) 90 86
Ps.huashanica NsNs EU074234 (y-型) 86 84
L.mollis NsNsXmXm
FJ600498(x-或 y-型)
DQ073542 (x-型)
DQ073540 (x-型)
97
98
91
88
86
87
L.multicaulis NsNsXmXm DQ073546 (y-型) 97 88
L.racemosus NsNsXmXm DQ073551 (y-型) 97 87
A.cristatum PP EU074238 (y-型) 88 85
S.cereale RR GU373813(x-型)
GU373814(y-型) 8988 8792
Ae.bicornis SS AY611725(x-型)
AY611726(y-型)
88
88
84
98
Ae.searsii SS AY611721(x-型)
AY611724(y-型)
87
87
96
96
E.ciliaris StStYY FJ713596(y-型) 91 86
Ta.caput TaTa EU074256 (y-型) 89 92
Ae.kotschy i UUSS FJ713599(x-或 y-型) 87 85
Ha.v illosum VV FJ600489(x-或 y-型) 89 85
图 4　HMW-N1 和 HMW-N2与麦类同源性核酸上游序列的系统进化分析
Figure 4　Phylogenetic relationships of HMW-N1 and HMW-N2 with homologous
sequences of Triticeae species based on DNA sequences
401
　　　 四川农业大学学报 第 28卷
引物设计在 N 端区 ,而不是信号肽区域。事实上 ,
我们利用以前克隆麦类高分子量谷蛋白基因编码区
的引物进行扩增 、克隆和测序[ 16] 均没有得到其高分
子量谷蛋白基因编码区序列 ,这就暗示了新麦草谷
蛋白基因在碱基组成上较为特殊 ,本研究获得的部
分编码区序列证实了这一点。因此 ,为了更准确克
隆新麦草属物种的高分子量谷蛋白基因 ,还需要对
其 C端区序列的组成和变异情况进行研究 ,以便设
计引物对其基因进行 PCR扩增 。
根据高分子量谷蛋白基本结构特征的差异 ,可
将其分为 x-和 y-型两种类型 。x-型亚基重复区内存
在重复三肽(GQQ),N-端保守区一般有 3个半胱氨
酸 ,而 y-型亚基重复区内没有重复三肽 , N-端保守
区一般有 5个半胱氨酸 。比对分析表明 ,与 HMW-
N1和HMW-N2一致性在81%以上的核酸序列中 ,
多数为 y-型 ,少数为 x-型。因此 ,无法确定 HMW-
N1和 HMW-N2序列所对应的亚基类型 。
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(本文审稿:高世斌;责任编辑:巩艳红;英文编辑:李清源)
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