全 文 ：2011年 6月 甘　肃　农　业　大　学　学　报 第 4 6 卷
第 3 期 99～ 103 JOURNAL OF GANSU AGRICULTURAL UNIVERSIT Y 双 月 刊
线叶嵩草内生细菌的鉴定及溶磷
效果的初步研究
王辰月1 ,陈秀蓉1 ,杨成德1 ,叶震1 ,李振东1 , 2
(1.甘肃农业大学草业学院 ,草业生态系统教育部重点实验室 ,中-美草地畜牧业可持续发展研究中心 ,
甘肃 兰州　730070;2.甘肃省社会科学研究院 ,甘肃 兰州　730070)
摘要:菌株 LXA 10分离于东祁连山高寒草地线叶嵩草(Kobresia ca pilli f olia),经 PKO培养基培养和溶磷活性
测定.结果表明:菌株 LXA 10对无机磷的溶解能力为 28.14 mg · L -1 ,溶磷量为 5.60 mg · g -1 .不同的培养基成分
对菌株 LXA10的溶磷能力有影响 , 培养基中 Fe2+、 Mn2+ 、Mg 2+等离子可提高 LXA10的溶磷能力 ,菌株 LXA 10对培
养基 pH 没有显著影响.经 16S rDNA序列分析 ,并结合形态特征及生理生化指标 , 鉴定菌株 LXA 10为枯草芽孢杆
菌(Baci llus subti lis).
关键词:溶磷;内生溶磷细菌;线叶嵩草;枯草孢杆菌
中图分类号:Q 93-33　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1003-4315(2011)03-0099-05
作者简介:王辰月(1984-),女 ,硕士研究生 ,研究方向为草地生物多样性.E-mail:lzxgw anglu@163.com
通信作者:陈秀蓉 ,女 ,教授 ,主要从事植物病害生物防治和高寒草地微生物多样性的研究.E-mai l:chenxiu rong@g sau.edu.cn
基金项目:甘肃省自然科学基金(096RJZA003).
收稿日期:2010-10-09;修回日期:2010-12-17
Identification of an endophytic phosphate-solubilizing
bacteria isolated f rom Kobresia capi l li f olia
WANG Chen-yue1 ,CHEN Xiu-rong1 ,YANG Cheng-de1 , YE Zhen1 ,LI Zhen-dong1 , 2
(1.Co llege of P ra taculture , Gansu Ag ricultural Univ ersity , Key Labor atory of G rassland Eco sy stem Ministry of
Education , Sino-U.S.Cente r for G razing and Eco system Sustainability , Lanzhou 730070 , China;
2.Gansu Social Science Institute , Lanzhou 730070 , China)
Abstract:Strain LXA 10 was isolated f rom Kobresia capi l li f ol ia , a kind of advantageous plants in alpine
grassland in the Eastern Qilian M ountains.The PKO culture results indicated that capaci ty o f pho sphate-
solubi lizing of endophy tic bacteria LXA 10 was 28.14 mg ·L -1 , and the capacity w as obviously dif fe rent in
dif ferent culture media.Fe2+ 、Mn2+ 、Mg 2 could promo ted the LXA 10 st rain phosphate solubi lization abili-
ty .It was also found that the capacity w as no t di rect ly related to pH of media.The st rain w as identified as
Baci llus subt i lis ,based on its 16S rDNA sequence ,phy siolo gical and bio chem ical characte ristics.
Key words:phosphate-dissolving;endophy tic bacte ria;kobreais cap il l i f ol ia;Baci l lus subt i lis
　　磷元素是植物生长不可缺少的元素之一 ,是构
成生物膜结构 、遗传信息载体 DNA 及贮存和传递
能量的物质 A TP 不可缺少的元素.我国有 74%的
耕地土壤缺磷 ,土壤中 95%以上的磷为难溶形态 ,
植物很难吸收利用.植物对施入的磷肥当季利用率
仅为 5%～ 25%,大部分与土壤中的 Ca2+ 、Fe3+ 、
Fe2+ 、Al3+结合 ,形成难溶性磷酸盐[ 1] ,不能被植物
很好地的吸收利用.因此 ,土壤缺磷是“遗传学缺磷”
而非“土壤学缺磷”[ 2] .如果将土壤中难溶性磷转变
为可溶性磷 ,提高土壤中磷元素的利用率 ,在生产中
DOI :10.13432/j.cnki.jgsau.2011.03.003
甘 肃 农 业 大 学 学 报 2011 年
具有重要的实践意义.20世纪 40 年代 ,Gerretsen[ 3]
研究了微生物对植物吸收磷的影响 ,发现生长于不
灭菌土壤中的植物比生长于灭菌土壤中的植物干物
质质量增加了 72 %～ 188 %,磷吸收量增加了79%
～ 340%,他将其归结于土壤微生物的作用.此后 ,许
多研究者[ 4-7] 也相继发现土壤中的一些微生物可促
进土壤中难溶态无机磷的溶解和有机磷的矿化.这
些能够将土壤中难溶性磷酸盐转化为植物可吸收利
用的可溶性磷的一类特殊的微生物称为溶磷微生物
(pho sphate-so lubilizing microorg anisms , PSM s),
包括溶磷细菌 、溶磷真菌和溶磷放线菌[ 8] .开发利用
溶磷微生物这个巨大的资源宝库 ,对合理施用磷肥 ,
实现农业的持续 、健康发展具有重要的现实意义.
我国草地面积广阔 ,占国土总面积的 40%.在
各类草地中 ,高寒草甸类草地面积约为 5.883×104
hm 2 ,占全国草地总面积的 17.77%左右[ 9] .线叶嵩
草(K obresia cap il l i f olia)是高寒草甸嵩草草地的
优势牧草之一.筛选线叶嵩草内生溶磷细菌 ,为开发
适用于高寒草甸类草地的生物菌肥 ,挖掘高寒草地
优势牧草的内生细菌资源 ,对提高我国草地生产力
具有重要作用.
1　材料与方法
1.1　试验材料
1.1.1　菌种　供试菌株为甘肃农业大学草地微生
物多样性实验室的保存菌种 ,分离于线叶嵩草的根
部 ,菌种编号为 LXA 10 .菌种生化测定的对照菌种为
枯草芽孢杆菌标准菌株(Baci llus subt i li s),购自中
国普通微生物菌种保藏管理中心.
1.1.2　仪器及试剂　台式高速冷冻离心机 、S2000
型分光光度计 、水平凝胶电泳装置 、凝胶成像系统
Uvitec-A 6030 、MyGenie 32 T hermal Block PCR热
循环仪 、IOC402.XXI.C 型控温振荡器 、PHS-3C 精
密数显酸度计 、各种微量移液器(Biometra公司).
Taq DNA 聚合酶 、蛋白酶 K 、溶菌酶 、dNT P 均
购自上海生工生物技术公司 , DL 2000 marker 购自
宝生物(TaKaRa)工程有限公司.用于提取 DNA 的
试剂制备参考《精编分子生物学实验指南》等[ 10] .
1.1.3　磷源　磷源包括分析纯 Ca3(PO4)2和磷矿
粉Ⅳ.磷矿粉Ⅳ化学组分见表 1.
表 1　磷矿粉Ⅳ的化学组分
Tab.1　The chemical composition o f ro ck pho sphate Ⅳ
磷矿粉Ⅳ 质量分数/ %
全磷 33.53
有效磷 6.39
CaO 50.12
MgO 1.53
Fe2O3 0.53
Al2O3 0.36
1.1.4　培养基　牛肉膏蛋白胨培养基:用于纯化和
保存菌种;PKO(Pikovaskaias)培养基:固体和液体
培养基分别用于菌株 LXA 10溶磷能力的定性和定量
测定;参考相关文献[ 11] 配制培养基 Ⅰ和培养基 Ⅱ ,
测定不同培养基成分对菌株 LXA 10溶解磷矿粉的
影响.
培养基 Ⅰ:葡萄糖 10 g , NaCl 0.3 g , KCl 0.3
g ,FeSO4 ·7H 2O 0.03 g , MnSO 4 ·4H2O 0.03 g ,
MgSO 4 ·7H 2O 0.3 g ,(NH 4)2SO 4 0.5 g ,磷矿粉
Ⅳ5 g ,蒸馏水 1 000 mL , pH 7.0 ～ 7.5 ,121 ℃下灭
菌 25 min.
培养基 Ⅱ:葡萄糖 10 g ,KCl 0.3 g ,(NH4)2SO4
0.5 g ,磷矿粉Ⅳ 5 g ,蒸馏水 1 000 mL , pH 7.0 ～
7.5 ,121 ℃下灭菌 25 min.
1.2　试验方法
1.2.1 　溶磷能力的定性及定量测定 　将菌种
LXA 10在牛肉膏蛋白胨培养基上活化 ,并划线培养
获得单菌落.在 PKO 固体培养基中点接该菌株 ,
28 ℃下培养 7 d ,分别测量溶磷圈直径(D)及菌落
直径(P),算出 D/ P的值.D/P 值越大 ,表示菌株的
溶磷能力越强.
将 LXA 10菌种配成 D600值为0.08的菌悬液 ,吸
取 100μL 接种在100 mL PKO 液体培养基中 ,重复
3次.同时 ,以接种等量无菌水的 PKO 液体培养基
作为对照 ,28 ℃下摇培 12 d(150 r · min-1),培养
液离心 10 min(4 ℃, 10 000 r ·min-1),取 5 mL 上
清液用钼锑抗比色法测定培养液 D 700值 ,同时测定
pH 值.参考文献[ 12] ,将公式修改为:
菌液的磷含量(mg ·L-1)=(ρ×V 1 ×ts)/V2
公式中:ρ表示从磷标准曲线上查得的 P 的质量浓
度(mg ·L-1);V1表示显色时的定容体积 ,此处为
100
第 3 期 王辰月等:线叶嵩草内生细菌的鉴定及溶磷效果的初步研究
50 mL ;t s 表示分取倍数 ,即离心后的上清液总体积
与显色时吸取上清液体积之比;V2表示培养液离心
后的总体积 ,此处为 100 mL.根据该公式计算出培
养液中磷的含量 ,并计算每克磷酸钙经菌株 LXA 10
作用后 ,所释放出的可溶性磷含量(mg ·g-1).
1.2.2　培养基成分对 LXA 10溶解磷矿粉的影响　
将 LXA 10菌种配成 D600值为 0.08的菌悬液 , 吸取
100 μL 分别接种在 100 mL 液体培养基 Ⅰ 、Ⅱ中 ,重
复 3次 ,28 ℃下摇培(150 r ·min-1)12 d ,培养液离
心 10 min(4 ℃,10 000 r·min-1),取 5 mL 上清液
用钼锑抗比色法测定有效磷含量 ,同时测定 pH 值.
测定结果数据用 SPSS 13.0进行差异显著性分析.
1.2.3　菌落形态观察及生理生化测定　将 LXA 10
划线接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上 ,观察菌株
LXA 10菌落形态 ,根据革兰氏染色 、芽孢染色及主要
生理生化测定结果 ,并参照相关文献[ 13-14] 进行分类
鉴定.
1.2.4　16S rDNA鉴定　将菌株 LXA 10接种于 LB
培养液中 ,28 ℃下摇培(120 r ·min-1)20 h ,待一定
数量的菌体长出后 ,用改进的 CTAB 法提取供试菌
株基因组 DNA [ 15-16] .根据细菌 16S rDNA两端的保
守序列 ,设计通用引物 ,进行 PCR扩增.引物 1:5′-
CCGGATCCAGAG TT TGATCA TGGCTCAGCA-
3′,引物 2:5′-CGGGATCCTACGGCTACCT TG T-
TACGACTT-3′,该引物由上海生工生物工程技术
服务有限公司合成.
PCR反应体系为 50 μL ,即 10×buf fer(含 20
mmo l · L-1 MgCl2)5 μL , dNTP(5 mmol · L-1)
1μL ,引物 1(10 μmol · L-1)1 μL , 引物 2(10
μmol·L-1)1 μL , Taq DNA 聚合酶(5 U ·μL-1)
0.25 μL ,模板 DNA 1 μL ,用无菌 ddH 2O 将体积补
至 50 μL.将反应体系中的模板 DNA 换为等体积的
无菌超纯水作为阴性对照.
反应程序为:94 ℃5 min ,94 ℃50 s ,48 ℃50 s ,
72 ℃1 min ,循环 32次;72 ℃10 min.取 5μL 反应
液进行 1%琼脂糖电泳检测 ,将 PCR扩增产物送到
上海生工测序.将测定所获得的 DNA 序列 ,输入
GenBank ,并用 Blast程序与数据库中的相关序列进
行比较分析.
2　结果与分析
2.1　菌株 LXA10溶磷能力的定性及定量测定
根据溶磷圈法 ,测得菌株 LXA 10的溶磷圈直径
与菌落直径(D/P)的比值为 1.93(图 1).表明该菌
株有较强的溶解无机磷的能力.
根据 1.2.1的修正公式 ,得出菌株 LXA 10对无
机磷的溶解能力为 28.14 mg · L-1 , 即溶磷量为
5.60 mg · g-1 ,说明菌株 LXA10具有较好的溶解无机
磷的能力.
图 1　LXA10在 PKO固体培养基上形成的溶磷圈
Fig.1　Halo of phospha te-solubilization microo rg anism
LXA 10 on P ikov skaoa so lid medium
2.2　培养基成分对 LXA10溶解磷矿粉的影响
培养基 Ⅰ与培养基 Ⅱ在成分上相比 ,培养基 Ⅱ
缺少了 Fe2+ 、Mn2+ 、Mg2+ 、 Na+ .测定结果显示 ,
菌株 LXA 10溶解磷矿粉Ⅳ的能力在两种培养基中具
有极显著差异(表 2),在培养基 Ⅰ中菌株 LXA 10溶
解磷矿粉Ⅳ的能力显著高于在培养基 Ⅱ中的溶解能
力 ,但培养液的 pH 值变化并无显著性差异.同时发
现培养基中 Fe2+ 、Mn2+ 、Mg2+ 、Na+的存在 ,提高了
菌株 LXA10溶解磷矿粉的能力 ,说明 Fe2+ 、Mn2+ 、
Mg2+等离子对菌株的溶磷活性具有促进作用.
表 2　无机盐对 LXA10溶解磷矿粉的影响
Tab.2　Effects of different miner al salt on rock pho sphate solubilization by LXA 10 str ain
培养基 培养液含磷量/(mg· L-1) 始 pH 终 pH
培养基Ⅰ 7.549±0.04Aa 7.50±0.18a 7.11±0.25a
培养基Ⅱ 5.311±0.08Bb 7.47±0.56a 6.54±0.44a
　　注:培养液含磷量以 P2O 5 计.大写字母表示 0.01水平的差异极显著性;小写字母表示 0.05水平的差异显著性.
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甘 肃 农 业 大 学 学 报 2011 年
2.3　形态特征观察及生理生化特征
由图 2可见 , LXA 10菌落呈不规则圆形 ,边缘不
整齐 ,菌落为乳白色 ,不透明 ,菌落表面无光泽 ,且表
面较粗糙.菌体为杆状 ,两端钝圆 ,大小为(0.58 ～
1.20)μm×(1.20 ～ 3.91)μm ,革兰氏阳性细菌(图
3),芽孢中生(图 4).菌株 LXA 10的生理生化指标测
定结果见表 3.菌株 LXA 10部分生理生化测定结果
与标准菌株枯草芽孢杆菌完全一致 ,与枯草芽孢杆
图 2　菌株 LXA10菌落形态
Fig.2　The shape of LXA 10 strain colony
图 3　菌株 LXA10的革兰氏染色
F ig.3　The G ram staining of LXA 10 str ains
图 4　菌株 LXA10的芽孢染色
Fig.4　Bacillus staining of LXA 10 strains
表 3　菌株 LXA10生理生化特征
Tab.3　Physiolo gica l and bio chemical char acte ristics
of LXA 10 strain
测定项目 测定菌株
LXA10 枯草芽孢杆菌
葡萄糖利用 + +
接触酶 + +
吲哚试验 - -
淀粉水解 + +
硝酸盐还原 + +
马尿酸盐水解 - -
　　注:“ +”表示阳性 , “ -”表示阴性.
菌的特征相符.
2.4　菌株 LXA10的 16S rDNA 鉴定及系统发育学
分析
利用细菌 16S rDNA的通用引物(引物 1 、引物
2)进行扩增 ,得到长度约为 1 448 bp 的PCR扩增产
物(图 5).菌株 LXA 10已在 GenBank 中登录 ,登录
号为 GQ 861459.用 Blast 软件将获得的基因序列
在 GenBank中进行核苷酸同源性比对分析 ,该菌株
与已报道的枯草芽孢杆菌(Baci llus subt i lis ,编号为
AB018484.1)相似性为 99%,选取部分相似性高的
基因序列进行多重比较分析 ,再用 Mega 4软件绘
制菌株 LXA 10的系统发育树(图 6),结合部分生理
生化测定结果 , 鉴定菌株 LXA 10为枯草芽孢杆菌
(Baci llus subti l is(Ehrenberg)Cohn).
图 5　LXA10 16S rDNA PCR电泳图
F ig.5　16S rDNA PCR electr opho resis map of LXA 10 str ain
图 6　菌株 LXA10的系统发育树
Fig.6　16S rDNA phy logenetic tr ee o f LXA10 strain
102
第 3 期 王辰月等:线叶嵩草内生细菌的鉴定及溶磷效果的初步研究
3　讨论与结论
据不完全统计 ,目前已报道有 30属 89种溶磷
微生物 ,其中真菌 27个种 ,细菌 58 个种 ,放线菌 4
个种[ 17-21] .研究较多的有芽孢杆菌属(Baci l lus)、假
单胞杆菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(E rwin-
ia)、肠细菌属(Enterbacter)、埃希氏菌属(Esche-
richia)等.经鉴定本试验采用的溶磷菌株 LXA 10为
枯草芽孢杆菌 ,其溶磷能力与相关文献报道的枯草
芽孢杆菌基本一致[ 22-24] .
溶磷微生物的溶磷机制一般认为是由于微生物
分泌有机酸 ,这些酸既能降低 pH 值 ,又可与铁 、铝 、
钙等离子螯合 ,从而使难溶性磷转化为有效磷[ 25] .
也有研究证明 ,一些溶磷菌导致培养介质酸度的降
低与产生的有机酸无关 ,不产有机酸的微生物也具
有溶磷作用[ 26] .赵小蓉[ 27] 研究发现 ,介质 pH 值的
下降 ,并不是溶磷的必要条件 ,同时发现溶磷细菌可
明显分为 2个类群 ,其中一个类群可提高培养液的
酸度 ,当培养液的 pH 降低到 4.5以下时 ,溶磷量大
幅度增加;另外一个类群不提高培养液的酸度 ,而菌
株的溶磷活性仍很高[ 28] .测定菌株 LXA 10溶磷能力
时发现 ,培养液的终 pH 与最初的培养基 pH 值相
比并无显著差异 ,但仍具有良好的溶磷能力 ,可推测
产生有机酸并不是菌株 LXA1 0溶磷的主要方式 ,也
验证了不产有机酸的微生物也具有溶磷作用的结
论.同时 ,培养基中铁 、镁 、锰等离子的减少并未提高
菌株的溶磷能力 ,这与林启美[ 11] 的结论不同.微生
物的生长需要适量的生长因子 ,这些微量元素的存
在在一定程度上促进了菌株 LXA 10的生长 ,提高了
菌株体内部分与溶磷相关的酶的活性.过多的有机
酸会改变培养液的渗透势 ,对菌株 LXA 10的生长不
利 ,也会对其体内的酶活力产生抑制作用 ,从而影响
菌株 LXA 10溶解磷矿粉的能力.试验中采用磷酸钙
和磷矿粉Ⅳ做磷源时 ,菌株 LXA 10的溶磷能力并无
显著差异 , 当采用其他磷矿粉作为磷源时 , 菌株
LXA 10对其溶解能力是否有差异 ,仍需进一步研究.
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(责任编辑　胡文忠)
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