全 文 ：微生物学通报 MAY 20, 2010, 37(5): 677−681
Microbiology China © 2010 by Institute of Microbiology, CAS
tongbao@im.ac.cn


基金项目：国家自然科学基金项目(No. 40801099, 40901129)
* 通讯作者：Tel: 86-20-85280295; : guoyanbiao@scau.edu.cn
收稿日期：2009-11-18; 接受日期：2010-03-02
研究报告
类芦根际溶磷真菌的筛选、鉴定及其
溶磷能力分析
冯宏 1 李永涛 1 张志红 1 韦翔华 2 郭彦彪 1*
(1. 华南农业大学资源环境学院 广东 广州 510642)
(2. 广西大学农学院 广西 南宁 530005)


摘 要: 为揭示类芦(Neyraudia reynaudiana)等水土保持植物的耐低磷机制, 开发溶磷菌种质资
源, 提高赤红壤磷素利用率, 从类芦根际土壤中筛选到一株溶磷能力较强的真菌 FP1, 经形态学
和 ITS 序列分析, 鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)。3 种难溶性磷酸盐液体培养基接种菌株 FP1 后,
其 pH值和溶磷量的动态变化显示, 培养液的 pH值均呈显著下降趋势。溶磷量与培养时间有关, 除
磷酸三钙外, 菌株 FP1 对其他难溶性磷酸盐的溶磷趋势均为先上升再下降并趋于稳定。菌株 FP1
对不同磷源的最大溶磷率顺序为: 磷酸铝(92.02%) > 磷酸三钙(41.62%) > 3 种磷酸盐的混合物
(35.86%) > 磷酸铁(19.20%)。FP1 对磷酸铝和磷酸铁都具有较强的溶磷能力, 表明抗逆性强的水土
保持植物类芦根际土壤蕴藏着高效的溶磷微生物资源。
关键词: 溶磷真菌, 水土保持植物, 耐低磷, 赤红壤
Screening, Identification, and Capability Assessment
of a Phosphorus Solubilizing Fungus in
Rhizosphere of Burma Reed
FENG Hong1 LI Yong-Tao1 ZHANG Zhi-Hong1 WEI Xiang-Hua2
GUO Yan-Biao1*
(1. College of Resources and Environment, South China Agriculture University, Guangzhou,
Guangdong 510642, China)
(2. Agricultural College, Guangxi University, Nanning, Guangxi 530005, China)
Abstract: To reveal mechanism of soil and water conservation plant such as Burma Reed (Neyraudia
reynaudiana) tolerant of low phosphorus, explore germplasm of solubilizing phosphorus and improve use
efficiency of phosphorus in latosolic red soil, a solubilizing phosphate fungus FP1 was isolated from
rhizosphere soil of Burma reed and identified as Aspergillus niger according to morphological characteristics
and ITS rDNA sequences. The dynamic variation of solubilizing phosphate capability and pH of in the liquid
medium with three kinds of inorganic phosphate indicated that the pH of the liquid medium decreased sig-
DOI:10.13344/j.microbiol.china.2010.05.017
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nificantly after inoculated FP1 and the solubilizing phosphate capability was related with culturing time.
Except for Ca3(PO4)2, solubilizing phosphate capability of FP1 rose first, then fell, and became stable in the
end. The maximum phosphate solubilizing efficiencies were ordered as follows: AlPO4 (92.02%) >
Ca3(PO4)2 (41.62%) > mixture of these three insoluble phosphates (35.86%) > FePO4·4H2O (19.20%). The
fungus FP1 was high efficient on solubilizing AlPO4 and FePO4·4H2O. It is indicated that microorganisms
with high efficient solubilizing phosphorus exists in soil and water conservation plant rhizosphere.
Keywords: Solubilizing phosphorus fungus, Soil and water conservation plant, Tolerance to low phosphate,
Latosolic red soil
土壤中 95%磷为生物无效形式, 导致我国 74%的
耕地土壤缺磷。通过施肥进入土壤的磷会与 Ca2+、
Fe2+、Fe3+、Al3+结合形成难溶性磷酸盐, 使磷肥的作
物当季利用率只有 5%−25%[1]。利用微生物提高土壤
中难溶性磷的生物有效性和磷肥利用率, 对于作物增
产和环境保护具有重要意义。近年来, 从植物根际土
壤中筛选具有活化土壤难溶无机磷能力的高效溶磷
菌, 成为提高土壤磷有效性的研究热点[2−4]。研究表明,
真菌的溶磷能力普遍比细菌要高得多[5], 但其数量和
种类远少于溶磷细菌。因此, 不断挖掘高效溶磷真菌
种质资源是当前迫切需要解决的科学问题。
迄今为止发现的溶磷菌主要集中在农作物和土
壤中[6−7], 少量报道源自牧草和林地等生态系统[8−10],
类芦(Neyraudia reynaudiana)是一种耐贫瘠能力极
强的水土保持植物[11], 能够在水土流失严重、高铁
铝导致低磷有效性的南方丘陵坡地红壤中正常生
长, 表明类芦可能具有土壤溶磷特性和潜力, 但这
方面的研究未见报道。本研究通过对类芦等植物根
际溶磷菌的分离筛选, 并对筛选到的高效溶磷菌株
进行鉴定和溶磷强度的动态测定, 为深入揭示类芦
等水土保持植物的耐低磷机制, 开发植物根际溶磷
真菌资源, 提高坡地红壤等侵蚀劣地磷素的利用率
提供支持。
1 材料与方法
1.1 土壤样品
2008 年 11 月 2 日采自华南农业大学校园内类
芦、象草(Pennisetum purpureum Schumach)和大黍
(Panicum maximum Jacq.)的根际土壤。土壤类型为花
岗岩发育的赤红壤。
1.2 培养基
难溶无机磷培养基 : 葡萄糖 10 g, (NH4)2SO4
0.5 g, NaCl 0.3 g, KCl 0.3 g, MgSO4·7H2O 0.3 g,
FeSO4·7H2O 0.03 g, MnSO4·4H2O 0.03 g, 磷源 5.0 g,
加蒸馏水至 1000 mL, pH 7.0−7.5。磷源: 供试难溶
磷酸盐分别为磷酸三钙[Ca3(PO4)2]、磷酸铝(AlPO4)、
磷酸铁(FePO4·4H2O)及三者重量比例为 1∶1∶1 的
混合物(简称 Fe-Al-Ca-P) 5.0 g。液体培养时不加琼
脂, 培养温度 28°C。该培养基用于溶磷菌株筛选及
溶磷能力测定。
PDA培养基: 土豆 200 g, 蔗糖 10 g, 琼脂 18 g,
水 1000 mL。该培养基用于斜面保存菌株。
1.3 溶磷菌的筛选
称取 10 g根际土壤于 90 mL加有少许玻璃珠的
无菌水中, 置于恒温摇床以 120 r/min振荡 30 min之
后稀释, 取 10−2和 10−3稀释度的土壤悬液涂布于相
应的难溶无机磷固体平板培养基上, 置于 28°C培养
箱培养 10 d, 选择具有透明圈的菌落进行分离纯化,
转接斜面保存, 备用。
1.4 溶磷菌株的鉴定
1.4.1 菌株的形态观察: 采用载玻片培养法进行真
菌培养, 通过电子显微镜观察分生孢子形状以及着
生方式等, 依据齐祖同著《中国真菌志. 第 5 卷. 曲
霉属及其相关有性型》[12]进行菌株初步鉴定。
1.4.2 菌株的分子生物学鉴定 : 按照 SK1201-
UNIQ-10 柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂(上海生工)
方法提取 DNA 基因组。用 ITS1: 5′-TCCGT
AGGTGAACCTGCGG-3′与 ITS4: 5′-TCCTCCGCTT
ATTGATATGC-3′为引物对基因组进行 PCR 反应[13],
扩增 rDNA ITS区段。50 µL PCR反应体系: 适量模
板 DNA, 10 × PCR buffer 5.0 µL, Taq DNA 聚合酶
2.5 U, 0.2 µmol/L ITS1, 0.2 µmol/L ITS4, 0.2 mmol/L
dNTPs。PCR 扩增程序为: 95°C 5min; 95°C 35 s,
55°C 35 s, 72°C 40 s, 35个循环; 72°C 8 min。用 1.5%
琼脂糖凝胶电泳对 PCR扩增产物进行检测。基因测
序由上海生工生物工程公司完成, 获得测序结果后,
冯宏等: 类芦根际溶磷真菌的筛选、鉴定及其溶磷能力分析 679

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用 BLAST 搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对
基因序列的同源性进行分析。
1.5 菌株溶磷能力的测定
1.5.1 菌悬液制备: 将 PDA培养基上培养 48 h的菌
刮入无菌水中, 于漩涡混合器中混合 30 s, 制备成菌
悬液, 菌数约为 1 × 109 CFU/mL。
1.5.2 菌株溶磷能力测定: 在 250 mL三角瓶中装入
50 mL 已灭菌的无机磷培养基, 难溶磷酸盐浓度为
5.0 g/L, 分别接种 1 mL菌悬液, 设不接菌对照, 每
个处理重复 3次, 在 28°C、120 r/min恒温摇床上振
荡培养 8 d。每隔 24 h用 pH计测定 1次培养液 pH
值, 同时取 1−2 mL培养液在 10000 r/min转速下离
心 5 min, 取上清液用钼锑抗比色法测定有效磷含
量, 减去对照值后即为溶磷量, 以 P2O5 mg/L计。
2 结果与分析
2.1 分离筛选
经筛选, 从供试植物根际土壤样品中分离到 10
株溶磷菌, 全部为真菌。可能是由于自然条件下, 南
方赤红壤呈酸性反应, 真菌成为类芦等植物根际溶
磷菌的优势类群。其中 1 株菌的菌落直径较大, 生
长状况良好, 使磷酸铁和磷酸铝为磷源的培养基出
现明显的透明圈。在磷酸铁固体平板上第 4 天开始
出现透明圈, 菌落 + 透明圈直径为 2.20 cm, 菌落
直径为 1.83 cm。将它指定为菌株 FP1, 并作为进一
步研究的供试菌株。
2.2 菌株鉴定
菌株 FP1在查氏琼脂培养基上培养 9 d的生长
情况和菌株分生孢子头经乳酸棉兰酚染色后的显微
照见图 1, 菌落在查氏琼脂上生长迅速, 25°C 培养


图 1 菌株 FP1 在查氏琼脂培养基上(9 d)的菌落形态(A)
和分生孢子头形态特征(B)(× 400)
Fig. 1 The colony on czapeks medium (9 d, A) and conid-
ial head (B) of FP1 (× 400)

图 2 菌株 FP1 细胞总 DNA 电泳图(A)及 PCR 产物电泳
图(B)
Fig. 2 Electrophoresis of total DNA (A) and PCR product
of ITS rDNA of FP1 (B)

9 d直径为 60 mm, 中心稍凸起, 有规则的辐射状沟
纹, 质地丝绒状, 表面呈暗褐黑色, 有少量渗出液,
具有轻微霉味, 菌落反面呈黄色。顶囊球形, 直径
50 µm−80 µm, 产孢结构双层, 表面全面可育, 分生
孢子球形, 直径 3.0 µm−4.8 µm, 壁稍粗糙。
菌株 FP1细胞总 DNA及 PCR产物电泳图见图
2。利用 ITS1 和 ITS4 为引物对菌株 FP1 的 ITS 区
进行 PCR 扩增和正反向测序, 得到的序列长度为
599 bp。通过 BLAST将该序列与 GenBank数据库中
序列进行比对, 结果表明菌株 FP1 与黑曲霉的同源
性为 100%, 支持了形态鉴定的结果。该序列已经递
交 GenBank, 登录号为 GU216310。
2.3 菌株 FP1 对难溶性磷酸盐的溶解能力
2.3.1 菌株对培养液 pH 值的影响: 菌株 FP1在不同
磷源的液体培养基中培养 8 d, 其液体培养基的 pH
值变化过程见图 3。从图中可以看出, 以难溶性磷
酸盐作为唯一磷源的培养基在配制完成后 , 经过
1 × 105 Pa、20 min的高压蒸汽灭菌后, 培养基的
pH 值发生变化, 其原因可能是由于培养基中磷酸
盐在高温条件下的部分溶解或各化学成分发生反
应。接菌后 Fe-P和 Al-P的培养液呈酸性, 而 Ca-P
和 Fe-Al-Ca-P 的培养液呈碱性, pH 值大小顺序为:
Fe-P < Al-P < Fe-Al-Ca-P < Ca-P。随着培养时间的
延续, 4种磷源液体培养基 pH值变化明显呈现两种
趋势, 一是以 Fe-P和 Al-P为磷源的培养基其 pH值
在培养初期 1−4 d内下降速度较快, 4 d后逐渐趋于
平稳; 二是 Ca-P培养基和 Fe-P、Al-P和 Ca-P三者
混合物培养基在培养前 2 d, pH值缓慢降低, 2 d后
pH值快速降低, 然后又逐渐趋于稳定。分析两种变
A B
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化趋势 , 发现呈现第 2 种变化趋势的培养基均有
Ca-P, 这可能是由于在培养初期, 培养液中 Ca-P 的
存在对 pH 值变化有缓冲作用, 但随着培养时间的
延长, 这种缓冲作用逐渐消失所致。
无论接菌前培养液呈酸性还是碱性, 1−8 d培养
期间, 各处理培养基 pH值总的变化趋势一致, 均为
持续下降, 除 Ca-P培养液下降到 2.34外, 其他培养
液的 pH 值都下降到 2.00 以下, 表明菌株 FP1 在偏
酸或偏碱的环境中均可生长, 而且可能是该菌株不
断向周围环境分泌酸性物质, 致使培养液 pH 值不
断下降。


图 3 菌株 FP1 在不同磷源培养液 pH 的动态变化
Fig. 3 Dynamic variation of pH during culture period

2.3.2 菌株 FP1 对难溶磷酸盐的溶磷能力: 多数学
者在研究溶磷菌的溶磷效果时, 将溶磷菌接种在液
体培养基中, 振荡培养 7−10 d, 培养结束后 1次测定
溶磷量[5,14−15], 而康贻军等[16]建议对不同培养时期的
溶磷量进行测定, 才能更准确地说明溶磷菌的溶磷
能力。培养期间菌株 FP1 对不同磷源的溶磷量动态
变化见图 4。从图中可以看出, 菌株 FP1对不同磷酸
盐的溶解量在 8 d 培养过程中表现出不同的变化过
程。在培养初期, FP1对各类型磷的溶磷量均随着培
养时间的延长而增加, 培养后期除 Ca-P 外, 其他类
型磷的溶解量均出现降低后趋于平稳的趋势, 这一
变化趋势与康贻军等[16]的研究结果一致。从图中可以
看出, 在 3 d内, 菌株 FP1对 Al-P的溶磷量随着培养
时间的延长而增加, 从第 2天开始, 培养液已变澄清,
FP1形成菌丝球(图 5), 5 d以后趋于稳定; 在前 7 d内,
Fe-P的溶磷量随时间逐渐增加, 之后趋于稳定, 培养
液也逐渐变澄清, 颜色呈微黄色, 可能与溶磷的同时
伴随着 Fe3+的释放有关(图 6); Ca-P 在培养期间溶磷
量一直在增加; 南方的铁铝土中, 难溶性磷酸盐总是
铁磷、铝磷和钙磷共存, 从菌株 FP1对 3种难溶性磷
酸盐混合物的溶磷量动态变化看, 在前 6 d内一直增
加, 6 d后显著下降并趋于稳定。菌株 FP1对不同难
溶性磷酸盐的溶磷量的动态变化较为复杂, 如结合
菌株在不同生长时期培养液的 pH、有机酸的浓度和
种类、有机磷与无机磷含量等的动态变化来探索溶
磷机理, 则有望在揭示微生物的溶磷机理方面取得
新进展。


图 4 菌株 FP1 在不同磷源培养液溶磷量的动态变化
Fig. 4 Dynamic variation of phosphate solubilization ca-
pacity during culture period


图 5 Al-P 培养液接种菌株 FP1 2 d 后的情况
Fig. 5 Liquid medium with Al-P after cultured FP1 for
2 days


图 6 Fe-P 培养液接种菌株 FP1 8 d 后的情况
Fig. 6 Liquid medium with Fe-P after cultured FP1 for
8 days
冯宏等: 类芦根际溶磷真菌的筛选、鉴定及其溶磷能力分析 681

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有研究表明, 微生物的溶磷量与 pH 之间不存
在显著的相关性[5], 而有的研究结果则相反[16−17]。
从本研究结果看 , 无论是哪种磷源 , 菌株 FP1 的
溶磷量与培养液的 pH 值均无显著相关性。康贻军
等[16]在对两株高效解磷真菌的解磷能力研究时, 每
12 h测定溶磷量, 溶磷量分别在 4、5 d溶磷量达最
高值。本研究中菌株 FP1 对 Fe-P、Al-P、Ca-P 和
Fe-Al-Ca-P的溶磷量最大值分别出现在培养的 7、3、
8和 6 d, 可见如果选用培养 7 d以后的数据, 菌株对
难溶性磷酸盐的最大溶磷能力将难以知晓。依最大
溶磷量计算出的溶磷率顺序为 : 磷酸铝 (AlPO4)
92.02% > 磷酸三钙[Ca3(PO4)2] 41.62% > 3 种磷酸
盐 的 混 合 物 (35.86%) > 磷 酸 铁 (FePO4·4H2O)
19.20%。与前人的研究结果相比[15−17], 菌株 FP1 对
磷酸铝和磷酸铁具有较好的溶磷效果, 有待进一步
研究其接种到南方酸性赤红壤中的溶磷能力。
3 结论
(1) 从类芦根际土壤中筛选到 1 株溶磷能力较
强的真菌 FP1, 经形态学和 ITS序列分析, 鉴定为黑
曲霉(Aspergillus niger)。
(2) 不论是何种难溶性磷酸盐磷源, 培养期间,
液体培养基的 pH值均呈下降趋势, 培养第 8天磷酸
三钙培养液 pH值下降到 2.34, 其他培养液均下降到
2.00以下。
(3) 溶磷量与培养时间有关 , 除磷酸三钙外 ,
菌株 FP1 对其他难溶性磷酸盐的溶磷趋势均为先上
升再下降并趋于稳定。菌株 FP1 对不同磷源的最大
溶磷率大小顺序为: 磷酸铝(AlPO4) 92.02% > 磷酸
三钙 [Ca3(PO4)2] 41.62% > 3 种磷酸盐的混合物
35.86% > 磷酸铁(FePO4·4H2O) 19.20%。菌株 FP1
对磷酸铝和磷酸铁都具有较强的溶磷能力, 具有进
一步开发利用的潜力。
参 考 文 献
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