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2014,43(3): 206 ~ 211.
Subtropical Plant Science
蝴蝶兰叶片蛋白质提取及双向电泳体系优化
朱小姝，叶庆生
（华南师范大学 生命科学学院，广东 广州 510631）

摘 要：通过对蛋白质提取、IPG 胶条选择、上样量、水化方式、聚焦条件等方面的优化，建立蝴蝶兰叶片蛋
白质的双向电泳体系。结果表明，采用酚抽提法提取蝴蝶兰叶片蛋白质的纯度较高，复溶较完全；双向电泳优
化体系选用 24 cm pH 3～10 NL 的 IPG 胶条，被动水化，上样量为 1.35 mg，B1 程序进行等电聚焦，12%分离
胶进行第二向电泳，考马斯亮蓝 G-250 染色。该方法获得分辨率较高、重复性较好的蝴蝶兰叶片双向电泳图谱，
蛋白数点多达 1163 个，可以满足蝴蝶兰蛋白质组学研究和分析。
关键词：蝴蝶兰；叶片；双向电泳；蛋白质
Doi: 10.3969/j.issn.1009-7791.2014.03.005
中图分类号：S682.31; Q512 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2014)03-0206-06

Optimization of Protein Extraction and Two-dimensional Electrophoresis
Conditions of the Phalaenopsis Leaves
ZHU Xiao-shu, YE Qing-sheng
(College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, Guangdong China)

Abstract: A two-dimensional electrophoresis（2-DE）system for proteomic analysis of Phalaenopsis
leaves was established by optimizing the extraction methods, parameters including the pH gradient of
IPG strips, sample loading, hydration ways and isoelectric focusing conditions. The optimized system
included the following steps: extracting the total protein from Phalaenopsis leaves by phenol method,
separating the proteins with 24 cm pH 3—10 NL IPG strips, loading protein samples of 1.35 mg by
passive hydration followed by isoelectric focusing program B1, and staining the gels by Coomassie
Brilliant Blue after SDS-PAGE (12%) electrophoresis. On the basis of optimized 2-DE system of
Phalaenopsis leaves, reproducible profiles with high resolution were obtained.
Key words: Phalaenopsis; leaves; 2-D electrophoresis; protein

蝴蝶兰Phalaenopsis因其花朵硕大、花色秀丽和观赏期长，素有“洋兰皇后”的美誉，是国际花卉
市场上“四大洋兰”之一，也是我国大规模栽培的观赏兰。关于蝴蝶兰的研究，多集中在生理生化和
分子生物学等方面[1—2]，而对蝴蝶兰蛋白组学的研究相对较少。蝴蝶兰叶片硕大肥厚，蛋白含量相对较
少，且有机酸、酚、色素等含量较多，干扰等电聚焦、二向电泳及凝胶染色，且前人对蝴蝶兰双向电
泳的优化研究主要集中在线性胶条的选择、第二向凝胶浓度和梯度以及裂解液成分等方面[3]。本文通
过对蝴蝶兰叶片总蛋白提取方法、IPG胶条选择、水化方式、上样量、IEF聚焦程序等方面进行改良，
以期建立分辨率高、重复性好的蝴蝶兰叶片双向电泳体系，为蝴蝶兰的蛋白质组学研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料及培养方法
蝴蝶兰品种为内山姑娘Dtps. Ney Shan Gu Niang，约 5 片叶，用透明塑料营养杯种植，水苔作培养
收稿日期：2014-05-04
基金项目：广东省科技计划项目(2011B020304010)
作者简介：朱小姝，硕士研究生，从事植物蛋白质组学研究。E-mail: 543828189@qq.com
注：叶庆生为通讯作者。E-mail: yelab@scnu.edu.cn
第 3 期 朱小姝,等：蝴蝶兰叶片蛋白质提取及双向电泳体系优化 ﹒207﹒
基质，栽培于华南师范大学国兰研究中心温室, 10 d施一次稀释 3000 倍“花多多 1 号”肥 200 mL·株-1。
1.2 主要仪器和试剂
IPG胶条、Ettan IPGphor 3 等电聚焦仪、Ettan DALT six SDS-PAGE分离系统、Image Scanner III
图像扫描系统（GE healthcare），PDQuest 8.0 图像分析软件（Bio-Rad）。其他药品、试剂均为分析纯。
1.3 蛋白提取
酚抽提法：根据Sarma等[4]、Carpentier等[5]的方法进行改进。液氮研磨1.5 g蝴蝶兰叶片成粉，加入
酚抽提液和Tris-饱和酚，离心（4 ℃，12 000 r·min-1，30 min），取上层酚相；下层水相加 Tris-饱和酚，
离心（同上），再取上层酚相。合并两次酚相加入预冷的0.1 mol·L-1醋酸铵/甲醇－20 ℃放置过夜。过夜
混合液离心（4 ℃，14 000 r·min-1，30 min）弃上清；沉淀加冷丙酮（含0.07% β-ME）洗涤，－20 ℃放
置30 min，离心，弃上清；沉淀加80%冷丙酮（含0.07% β-ME）洗涤，－20 ℃放置30 min，离心。沉
淀转移至 1.5 mL离心管内，用冷丙酮（含0.07% β-ME）洗涤、离心2次，真空抽滤干燥，－80 ℃保存
备用。
改良TCA/丙酮沉淀法：在Jacobs等[6]方法的基础上延长离心时间至 30 min，并增加沉淀重悬 1 次。
改良醋酸铵/甲醇沉淀法：在Dafny-Yelin等[7]的基础上增加离心转数至 14 000 r·min-1和沉淀重悬 1 次。
1.4 双向电泳
第一向等电聚焦方法参照 Bio-Rad 实验指南手册，并稍作改动。等电聚焦程序设定如表 1，步骤
S6 为保持阶段，可随时停止。
表 1 等电聚焦程序
Table 1 The different procedures of IEF
步骤 S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6
电压/V 100 1000 4000 10 000 10 000 500 程序 A1
(17 cm) 时间/h 1 1 1 5 80 000 V-h 任意时间
电压/V 100 250 1000 10 000 10 000 500 程序 A2
(17 cm) 时间/h 4 1 1 2 80 000 V-h 任意时间
电压/V 100 250 1000 10 000 10 000 500 程序 B1
(24 cm) 时间/h
水化
12 h
4 1 1 2 100 000 V-h 任意时间
聚焦完成后的IPG胶条分别放入平衡液I（6 mol·L-1尿素，50 mmol·L-1 Tris pH 8.8，30% V/V甘油，
2% W/V SDS，1% DTT现配现用）和平衡液II（6 mol·L-1尿素，50 mmol·L-1 Tris pH 8.8，30% V/V甘油，
2% W/V SDS，2.5% 碘乙酰胺现配现用）中各15 min，然后把胶条放入配好的电极缓冲液中冲洗，去
除胶条上多余的平衡液。
第二向采用分离胶浓度为12% SDS-PAGE垂直平板电泳。将已平衡IPG胶条置于第二向凝胶上方，
排除气泡，用0.5%低熔点琼脂糖凝胶封固胶条。接通电源后，以15 ℃循环水冷却（采用冷却水循环和
电泳缓冲液循环双重降温系统）。
1.5 染色和图谱分析
电泳结束后，将凝胶用固定液（40% V/V甲醇，10% V/V乙酸）固定 2 h后，ddH2O漂洗凝胶 2 次，
每次 15 min；G-250 染色液（0.12% W/V考马斯亮兰G-250，10% W/V硫酸铵，10% V/V正磷酸，20% V/V
甲醇）染色 17 h；用ddH2O漂洗至背景为无色。
待凝胶背景清晰，用 Image Scanner III 扫描仪扫描凝胶，选择透射模式，分辨率为 150 dpi，
PDQuest8.0 软件分析图像。
2 结果与讨论
2.1 蛋白样品制备的选择和优化
比较醋酸铵/甲醇沉淀法、酚抽提法和TCA/丙酮沉淀法提取蝴蝶兰叶片蛋白质的效果，用17 cm pH
3～10 NL IPG胶条（上样量为1200 μg）进行双向电泳（图1、表2）。结果表明，酚抽提法所得蛋白质纯
第 43 卷 ﹒208﹒
度高，复溶较完全，图谱上蛋白点分离效果好，背景清晰。在后续实验中均采用此方案制备样品。












图 1 3 种提取方法所获蝴蝶兰叶片总蛋白的双向电泳图谱(17 cm，pH 3～10 NL)
Fig. 1 Representative 2-DE protein maps of total Phalaenopsis leaves protein from three
extraction methods (17 cm, pH 3—10 NL IPG gel)
a. TCA/丙酮沉淀法；b. 醋酸铵/甲醇沉淀法；c. 酚抽提法。a1、b1、c1 为局部放大图。
表 2 三种提取方法比较分析
Table 2 Comparasion of 2-DE maps from three different extraction methods
项目 TCA/丙酮法 醋酸铵/甲醇沉淀法 酚抽提法
样品干粉 灰色粉末状 黄色片状 白色片状
蛋白得率 4%～5% 0.6%～0.7% 0.4%～0.5%
蛋白点质量 点少，形状不规则 有一定程度横纹 点多，圆形或椭圆
图谱背景 较深 较浅 较浅
条纹干扰 较多 略多 较少
电流 高 高 低

2.2 水化方式选择
分别用主动水化和被动水化对蝴蝶兰叶片蛋白进行 2-DE 实验。两种水化方式均能将大部分蛋白转
移至胶条当中(图 2)。根据电泳图谱效果，主动水化得到的图谱背景颜色较深，酸性端和中性端的蛋
白点分离效果较差，部分蛋
白点出现纵向及横向拖尾现
象；被动水化得到的电泳图
谱背景更清晰，蛋白点分离
效果好、形状规范，拖尾及
条纹现象较少(图 2)。
2.3 等电聚焦程序的优化
在 pH 范围和胶条长度
相同的前提下，采用不同的
IEF 程序对蝴蝶兰叶片全蛋
白进行聚焦效果不同（图 3）。
采用 IEF 程序 A1 对叶片全
蛋白聚焦时，电压很难升到
预设的目标电压，需要延长
聚焦时间来弥补，电流过大
并且出现一定程度的波动，
得到的电泳图谱酸性端蛋白
图 2 不同水化方式所获蝴蝶兰叶片总蛋白的双向电泳图谱
Fig. ins 2 Representative 2-DE protein maps of total Phalaenopsis leaves prote
from two different hydration methods
a. 主动水化；b. 被动水化。a1、b1 为局部放大图。
MW(KD)
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
pH 3 10 NL pH 3 10 NL pH 3 10 NL MW(KD)
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
MW(KD)
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4 18.4
14.4a b c
a1 b1 c1
a b
a1 b1
MW(KD)
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
pH 3 10 NL
MW(KD)
pH 3 10 NL
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
第 3 期 朱小姝,等：蝴蝶兰叶片蛋白质提取及双向电泳体系优化 ﹒209﹒
点未分开，横向条纹明显。
通过优化聚焦程序，在 IEF 程序 A2 中，降低除盐电压值，增加除盐时间，可解决升压困难的问
题，电压按照预设的流程稳定上升，聚焦电流介于每胶条 20～30 µA 之间，所得电泳图谱酸性端蛋白
点清晰、形状较规则，横向条纹减少。因此，17 cm IPG胶条采用 IEF程序A2，24 cm IPG胶条聚焦电
压为 10 000 V，聚焦时间 10 h，采用 IEF 程序 B1。
2.4 IPG 胶条的选择
采用 17 cm pH 4～7 IPG 胶条的双向电泳结果显示，蝴蝶兰叶片总蛋白质主要分布在中性至碱性
区域，酸性端分布较少，且蛋白质点聚集在一起，未能有效分离（图 4: a）；采用 17 cm pH 5～8 IPG
胶条分离所得蛋白质点在凝胶上分布较为均匀，且分离中性至碱性区域的蛋白质比用 pH 4～7 IPG 胶
图 3 两种 IEF 程序所获蝴蝶兰叶片蛋白的双向电泳图谱(17 cm，pH 3～10 NL)
Fig. 3 Representative 2-DE protein maps of total Phalaenopsis leaves proteins from two different IEF
procedures (17 cm pH 3—10 NL IPG gel)
a. IEF 程序 A1；b. IEF 程序 A2。a1、b1 分别为 a、b 局部放大图。
图 4 不同胶条所获蝴蝶兰叶片总蛋白的双向电泳图谱
Fig. 4 Representative 2-DE protein maps of total Phalaenopsis leaves proteins from four
different strips
a. 17 cm pH 4～7 胶条；b. 17 cm pH 5～8 胶条；c. 17 cm pH 3～10 NL 胶条；d. 24 cm pH 3～10 NL 胶条
MW(KD)
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
pH 3 10 NL
MW(KD)
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
pH 3 10 NL
a
a1
b1 b
a b
c
d
pH 3 10 NL pH 3 10 NL
pH 4 7 pH 5 8
MW(KD)MW(KD)
116.0116.0
66.266.2
45.045.0
35.035.0
25.025.0
18.418.4
14.414.4
MW(KD) MW(KD)
116.0 116.0
66.2 66.2
45.045.0
35.0
35.0
25.0
25.0
18.4
14.4
18.4
14.4
第 43 卷 ﹒210﹒
条效果好，但 IPG 胶条 pH 范围以外的 pH＞8 碱性端以及 pH＜5 的酸性端蛋白点重叠成两条较明显
的蛋白点带，不利于蛋白分离和软件分析（图 4: b）；采用 17 cm pH 3～10 NL IPG 胶条时，得到 2-DE
图谱蛋白质分离效果较前两种胶条好，能清晰的看到更多的蛋白质点（图 4: c）。虽然图谱中酸性端和
碱性端被分开，但大部分蛋白质集中在 pH 4～8 之间，蛋白质点相对密集；采用 24 cm pH 3～10 NL
IPG 胶条既能将酸性及中性蛋白质分离开，同时也能分离碱性蛋白质，又因增加了胶条长度保证了中
间 pH 值的蛋白均匀分布，形状规则，蛋白点数目有所增加，蝴蝶兰叶片总蛋白质得到较好的分离（图
4: d）。
2.5 上样量的优化
图 5 表明，上样量为 1.1 mg时蛋白质上样量过少，图谱上能检测出的蛋白点少，背景较浅，影响
后续实验以及软件分析；上样量为 1.6 mg 上样量过大，产生较多的纹理，有些蛋白出现共迁移现
象，即不同的蛋白质出现在胶上的相同位置
时
[8]，造成分辨率降低、蛋白点模糊、背景不干净；上样量
为 1.35 mg时，图谱背景深浅适宜，多数蛋白点呈圆形或椭圆形，边界清晰，蛋白点分离效果较好，扩
散及拖尾现象明显减少，既能检测出较多的蛋白质又避免因上样量过大而造成的蛋白质共迁移。因
此，24 cm IPG 3～10 NL胶条，上样量 1.35 mg较为合适。















MW(KD)
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
pH 3 10 NL
MW(KD)
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
pH 3 10 NL
MW(KD)
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
pH 3 10 NL
a1
a b c
b1 c1

图 5 不同上样量所获蝴蝶兰叶片总蛋白的双向电泳图谱(24 cm pH 3～10 NL)
Fig. 5 Representative 2-DE protein maps of total Phalaenopsis leaves proteins from
three different loaded proteins (24 cm pH 3—10 NL)
a. 上样量为 1.1mg；b. 上样量为 1.35 mg；c. 上样量为 1.6 mg。 a1、b1、c1 为局部放大图




2.6 蝴蝶兰叶片双向电泳重复性分析
蛋白斑点匹配率是 2-DE结果重复性的衡量指标之一，匹配率越高，重复性越好。对蝴蝶兰叶片
总蛋白质的两次平行实验用PDQuest软件进行蛋白质点检测及匹配分析（图 6: a、b），分别检测到 1163
和 1060 个点，匹配的蛋白点为 919 个，匹配率达到 87%。利用PDQuest软件进行重叠分析（图 6: c），
大部分点重叠呈现黄色，表明实验重复性较好。未能很好匹配的蛋白主要表现为低表达量蛋白，由于
这些蛋白含量低，用 2-DE检测较困难，这也正是双向电泳系统的局限性所在[9]。



﹒211﹒第 3 期 朱小姝,等：蝴蝶兰叶片蛋白质提取及双向电泳体系优化

MW(KD)
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
MW(KD)
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
MW(KD)
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.4
pH 3 10 NL pH 3 10 NL pH 3 10 NL
cba

图 6 蝴蝶兰叶片两次 2-DE 平行实验的重复性分析
Fig. 6 Comparing analysis of two 2-DE experimental maps of the Phalaenopsis leaves proteins
注：a 和 b 分别为两次平行实验的 2-DE 图谱；c 为利用 PDQuest 软件对图 a、b 图谱以不同荧光（红色，绿色）显示并进行重叠。
3 结论
根据以上实验结果，蝴蝶兰叶片蛋白组学研究的优化系统为：24 cm IPG pH 3～10 NL胶条，按照
1∶50 加入水化液，被动水化，IEF程序B1，1.35 mg 上样量；第二向电泳采用 12%凝胶分离蛋白，电
泳过程中保持恒功率（1 W·gel-1 30 min，15 W·gel-1 7 h）和恒温 15 ℃；考马斯亮蓝G-250 染色。按此
优化条件的蝴蝶兰叶片双向电泳图背景清晰、蛋白点形状规范且拖尾较少。与陈移亮[3]用TCA丙酮法
提取蝴蝶兰叶片蛋白质相比，酚抽提法效果更好，且24 cm IPG pH 3～10 NL胶条更能将蝴蝶兰叶片蛋
白点分开，利于后续的软件分析。
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