全 文 ：第 43 卷　第 2 期
2004年 4月
复 旦 学 报 (自然科学版)
Journal of Fudan University(Na tural Science)
Vol.43 No.2
Apr.2004
　　文章编号:0427-7104(2004)02-0260-07
濒危植物华山新麦草(Psathyrostachys huashanica)
的遗传多样性及其保护
杭　焱 , 金　燕 , 卢宝荣
(生物多样性与生态工程教育部重点实验室 ,复旦大学 生物多样性科学研究所 , 上海　200433)
摘　要:筛选的 12条 ISS R引物 ,对采集于陕西华山 3 个自然居群 、20 个亚居群的 150 个华山新麦草(Psathy-
rostachys huashanicaKeng ex Guo)个体的遗传多样性进行了分析.发现华山新麦草样本 ISSR产物的多态位点比
率(P)为 96.8%;每个位点的平均有效等位基因数(Ae)为 1.411;居群的预期杂合度(He)为 0.251 ,大于一般风
媒异交植物的平均值 0.148;居群的香农多样性指数(I)为 0.391;这些结果表明华山新麦草在居群水平上有相
对较高的遗传多样性.亚居群间的基因分化系数(GS T)为 0.304 , 表明大部分(约为 70%)的遗传变异均存在于亚
居群内.同时亚居群间具有一定频率的基因流 , 其遗传相似性也较高 , 变化范围为 0.796～ 0.974(平均为0.903).
根据上述结果推断 ,华山新麦草的濒危不是因为遗传多样性稀有 , 而是由于它对特殊生态环境的要求影响了它
的扩散而仅分布于华山这一狭小范围.因此 , 只要能够保证目前华山的生态环境不被进一步破坏 , 华山新麦草就
能得到很好的保护而不会因种内遗传多样性降低而灭绝.
关键词:小麦族;华山新麦草;居群结构;遗传多样性;I SSR;资源保护
中图分类号:S 512.024;　　　　文献标识码:A
新麦草属(Psathyrostachys Nevski)是禾本科(Poaceae)小麦族(Triticeae)野生近缘种的重要遗传资
源.该属包括 10余个多年生二倍体(2n =14)物种 ,均含 N基因组 ,被认为是小麦族中赖草属(Leymus)的
二倍体祖先种之一[ 1] .新麦草属的绝大部分物种均分布于中亚的干旱植被类型中 ,是一类抗旱能力很强
的植物[ 2] .新麦草属植物具有重要的农艺价值 , 除具有经济价值的牧草种类之外[ 1 ,3] ,脆穗新麦草(P .
f ragi lis)和栽培大麦(H .vulgare)属间杂种中的染色体削除[ 4 ,5]以及华山新麦草(P .huashanica)和普通
小麦(Triticum aest ivum)杂种中小孢子母细胞的染色质穿壁现象(chromatin transfer)[ 6] ,分别为大麦双单
倍体的培育和小麦育种特殊遗传材料的建立提供了重要基因资源.对新麦草属这样一个具有重要意义植
物类群的分类学 、细胞遗传学 、种间杂交 、系统演化以及遗传多样性和保护生物学研究 ,有利于其有效和可
持续利用[ 1～ 9] .
华山新麦草(P.huashanica Keng ex Guo)为我国特有物种 ,仅在陕西省华山有分布 ,面积约为 10 余
km2(北纬 34°25′～ 34°30′,东经 109°57′～ 110°05′).华山新麦草与该属的其他物种有较近的亲缘关系并且
含相同的基因组 ,但与其他物种形成间断地理分布 ,而且在形态及生境上也有较大的差异.华山新麦草主
要生长在华山有一定的湿度的山坡 、沟谷和路边 ,特别是向阳之处.由于华山新麦草独特的分类学地位 、特
殊的地理分布和作为小麦族的重要基因资源 ,目前该物种已被列为我国珍稀濒危植物和急需保护的农作
物近缘种[ 10] .近年由于华山兴建旅游设施 ,开发道路和游人的大量涌入 ,对华山新麦草的生存造成了严重
的威胁.据观察统计 ,在过去的数年中已有不少的华山新麦草居群遭灭绝或是居群的面积显著减小[ 11] ,必
须采取有效措施予以保护.
本研究旨在利用 ISSR分子标记来分析华山新麦草自然居群的遗传多样性 ,以便了解其濒危的遗传
　收稿日期:2003-07-04
基金项目:上海市教委上海市优秀学术带头人资助计划(00XD14006)
作者简介:杭　焱(1981—), 女 ,本科毕业生;通迅联系人卢宝荣教授.E-mail:brlu@fudan.edu.cn
DOI :10.15943/j.cnki.fdxb-jns.2004.02.025
学基础 ,并根据其遗传多样性和居群遗传结构特点提出该稀有物种的保护对策.锚定 ISSR(inter simple
sequence repeat)方法是用 SSR为引物来扩增重复序列之间的 DNA区域 ,在SSR的 3′端或 5′端锚定 1 ～ 4
个兼并碱基 ,基因组上只有能与锚定的核苷酸相匹配的位点才能被靶定 ,因而避免了 SSR在基因组内的
滑动 ,大大提高了 PCR扩增的专一性[ 12] .所以该方法不仅在操作上和 RAPD 一样简单 ,而且还具有较高
的稳定性和重复性 ,适用于检测物种居群水平上的遗传变异.
1　材料与方法
1.1样本采集
2001年 7月 ,作者在华山的 3个地点(居群 Pop),即后山索道站(Pop1 ,生境为山路边 、山坡和溪边乱
石中等),华山峪(Pop2 ,生境为峭壁空隙有土之处 、山坡上 、山路旁 、溪边和岩石罅隙中)和斜峪沟(Pop3 ,
生境为山坡上和岩石罅隙中等),依据海拔高度及自然生长状态选取了 20个采样点(亚居群)进行采样 ,共
采集了 150个代表单株的样本(见 2.2节表 2).在同一个亚居群内 ,每一份采集样本的植株之间至少相隔
1 m ,以尽量保证包含不同的基因型.采集植株无病斑的健康叶片数片 ,立即置于盛有硅胶的密封塑料袋
内干燥保存.
1.2　全基因组 DNA提取
采用 CTAB法对采集的干燥的叶片直接进行全基因组 DNA 的提取 , 操作流程参照 Murray 和
Thompson的描述[ 13] .
1.3　ISS R引物筛选和扩增反应
(1)ISSR引物筛选和条件优化　利用 6份华山新麦草 DNA样品进行引物筛选 ,从 100条 ISSR引物
(来自 The University of Brit ish Columbia SSR Primer(RAPD Synthesis Pro ject)Oligonucletide Set 100/9)中
筛选出 12条能扩增出条带清晰并且稳定 ,同时具有一定多态性的引物进行合成(TaKaRa).将该引物用于
所有样品的扩增.进行梯度 PCR反应并优化每条引物的反应条件 ,得到每条引物的最佳 MgCl2浓度和退
火温度(表 1).
表 1　ISSR引物及其反应条件
Tab.1　Nucleotide sequences and amplifica tion conditions fo r the 12 selected ISS R primers
编号 碱基序列 退火温度/ ℃
c(Mg2+)/
(mmol·L -1) 编号 碱基序列
退火温
度/ ℃
c(Mg2+)/
(mmol·L-1)
808 AGAGAGAGAGAGAGAGC 51.4 2.0 841 GAG AGA GAG AGA GAG 51.0 2.0
817 CACACACACACACACAA 53.6 2.0 842 GAGAGAGAGAGAGAG 52.0 2.0
823 TCTCTCTCTCTCTCTCC 52.2 2.5 845 C TCTCTCTCTCTCTCT(AG)G 51.4 2.1
826 ACACACACACACACACC 51.6 2.0 856 ACACACACACACACA 52.0 2.0
829 TGTGTGTGTGTGTGTGC 53.3 2.0 857 ACACACACACACACA 54.5 2.0
840 GAGAGAGAGAGAGAG 53.6 2.0 868 GAAGAAGAAGAAGAAGAA 52.0 2.0
(2)PCR扩增　PCR扩增在 DNA热循环仪(Eppendorf Mastercy cler Gradient)上进行 ,每个 PCR扩增
反应使用单条引物 ,反应总体积为 20 μL ,体系为:2 μL 10×buffer , 2.0 ～ 2.5 mmol/ L MgCl2(各引物的
Mg2+浓度见表 1),2 μL dN TP M ixture(各 2.5 mmol/ L), 1 μL 引物(20 μmol/L),0.5单位 ExTaq DNA
聚合酶(TaKaRa),30 ng模板 DNA ,灭菌三蒸水.反应程序为:94 ℃预变性 4 min;94 ℃变性 45 s , 52 ℃退
火 45 s(各引物退火温度见表 1),72 ℃延伸 45 s ,40个循环(引物 841反应为 35 循环);最后再在 72 ℃延
伸 7 min.
(3)电泳　扩增产物与 0.25体积的 loading buffer 混合后 ,用 15 g/ L(引物 842的扩增产物用 20 g/ L)
的水平琼脂糖胶 ,在电压为 5 V/cm 的恒压电场中电泳约 70 min ,然后以 1 μg/mL 溴化乙锭染色 ,在紫外
灯下成像 ,并拍照记录扩增结果.
1.4　数据分析
261第 2 期　　　　杭　焱等:濒危植物华山新麦草(Psathyrostachys huashanica)的遗传多样性及其保护
由于 ISSR为显性标记 ,按 PCR扩增产物条带的有无进行读取 ,分别记为“1”(代表显性基因)和“0”
(代表隐性基因),经统计而得到各亚居群和总居群由“0”和“1”数据组成的矩阵.用 POPGENE 软件(Ver-
sion 1.31)[ 14]对亚居群的遗传多样性进行分析 ,按 Nei(1972)氏方法计算各亚居群和总居群的遗传多样性
参数 ,即:多态位点比率(P)、平均每个位点的有效等位基因数(Ae)和预期杂合度(He)、香农多样性指数
(I)以及各亚居群间的遗传一致度(GI)、遗传距离(D)、基因分化系数(GST)和居群每代迁移数(Nm)[ 15] .
用 NTSYS(Version 2.0)[ 16]根据遗传一致度对各亚居群间进行 UPGMA 聚类分析.
2　结果与分析
2.1　ISSR扩增结果
用 12条 ISSR引物对 20个亚居群的 150个华山新麦草个体进行 PCR扩增 ,共得到 186 个可识别和
稳定的 、大小在 400 ～ 2 020 bp之间的 DNA片段(位点 ,见图 1),平均每条引物平均获得 15.5个 ISSR位
点 ,各引物获得的位点数变化范围在 6 ～ 25之间.
图 1　ISS R引物 840 扩增产物的电泳图谱
Fig.1　DNA fragments amplified by the ISSR primer 840
上方的数字为华山新麦草的样本编号 ,M 为分子标记
2.2　居群的遗传多样性水平
对 ISSR分析结果进行居群遗传多样性水平的分析结果显示 ,在华山新麦草各亚居群中检测到的 186
个位点中 ,有 180个多态位点.华山新麦草 20个亚居群的遗传多样性分析结果见表 2.遗传多样性各参数
在各亚居群之间有一定的变异 ,20个亚居群的总体多态位点比率(P)为 96.77%;每个位点的平均等位基
因数为 1.968±0.177 ,每个位点的平均有效等位基因数(Ae)为 1.411±0.343.分析还表明华山新麦草居
群的总体预期杂合度(He)为 0.251±0.171 ,大于 Hamrick等(1989)对 449种植物统计分析所得的所有异
交(风媒)植物居群水平的 He 平均值 0.148[ 17] ;居群的总体香农多样性指数(I)为 0.391±0.225.上述结
果表明华山新麦草的自然居群具有相对较高的遗传多样性.
表 2　20 个亚居群 186 个位点的遗传多样性分析结果
Tab.3　Genetic diversity of 20 Psathyrostachys huashanica sub-populations based on analysis o f 186 ISSR loci
亚居群 海拔/m 样本数 P/ % Ae He I
Pop1-1 700 15 70.97 1.368±0.353 0.222±0.188 0.338±0.265
Pop1-2 700 15 70.43 1.340±0.362 0.204±0.188 0.314±0.264
Pop2-1 400 18 65.59 1.324±0.344 0.197±0.187 0.303±0.267
Pop2-2 420 5 53.76 1.329±0.378 0.192±0.201 0.287±0.287
Pop2-3 520 7 56.45 1.333±0.372 0.195±0.199 0.293±0.285
Pop2-4 690 4 52.15 1.340±0.386 0.196±0.205 0.291±0.294
262 复 旦 学 报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　第 43 卷
续表 2
亚居群 海拔/m 样本数 P/ % Ae He I
Pop2-5 780 2 25.27 1.179±0.308 0.105±0.180 0.153±0.263
Pop2-6 860 2 22.58 1.159±0.296 0.093±0.174 0.137±0.253
Pop2-7 1 040 2 20.97 1.148±0.288 0.086±0.169 0.127±0.246
Pop2-8 1 050 4 44.09 1.272±0.364 0.159±0.195 0.238±0.282
Pop2-9 1 220 7 60.22 1.333±0.372 0.196±0.195 0.298±0.277
Pop2-10 1 320 10 69.35 1.398±0.376 0.233±0.196 0.350±0.275
Pop2-11 1 400 8 64.52 1.363±0.368 0.215±0.194 0.325±0.275
Pop2-12 1 400 2 25.27 1.179±0.308 0.105±0.180 0.153±0.263
Pop2-13 1 440 5 62.90 1.363±0.369 0.214±0.196 0.322±0.279
Pop2-14 1 480 12 69.89 1.383±0.359 0.228±0.190 0.346±0.268
Pop2-15 1 500 2 20.97 1.148±0.288 0.087±0.169 0.127±0.247
Pop3-1 450 9 61.29 1.364±0.386 0.211±0.203 0.315±0.286
Pop3-2 480 10 63.44 1.336±0.370 0.198±0.195 0.302±0.274
Pop3-3 480 11 69.35 1.368±0.355 0.221±0.189 0.336±0.268
总计 - 150 96.77 1.411±0.343 0.251±0.171 0.391±0.225
2.3　居群间遗传变异分析
华山新麦草 20个亚居群之间的遗传一致度(GI)变化范围为 0.796 ～ 0.974 ,平均为 0.903;遗传距离
(D)变化范围在 0.027 ～ 0.229 ,平均为 0.103 ,表明华山新麦草的各亚居群之间有较高的遗传亲缘关系.
以遗传一致度进行 UPGMA聚类分析 ,得到的聚类图(图 2)表明样本量在 5以上的亚居群之间 ,其相似性
系数仅在 0.937 ～ 0.974之间.样本量小于 5的居群相似性有一定偏离 ,可能与样本量较少而产生误差有关.
亚居群间基因分化系数(GST)为 0.304 ,表明华山新麦草大部分的遗传变异(约 70%)均存在于亚居
群内 ,但亚居群之间也有了明显的遗传分化.在本研究分析 ISSR分子标记的过程中 ,也发现华山新麦草
个体间等位基因频率有较大的差异.根据报道的华山新麦草繁殖对策[ 11] ,我们认为该物种亚居群内遗传
分化水平较高的原因主要是该物种异花传粉的有性繁殖方式和克隆生长相结合维持了其一定的基因杂和
度和个体间的差异.
图 2　20 个亚居群遗传一致度的 UPMGA法聚类结果
Fig.2　A dendrog ram generated by UPGMA cluster analy sis of genetic identity of the 20 sub-populations
括号内的数值为个体数
同时 ,各亚居群中每代迁移数(Nm)的检测结果为 Nm =1.144(>1).根据Wright(1931)对基因流的
研究结果[ 18] ,我们推测华山新麦草的亚居群之间有一定频率的基因流.遗传物质的交换可以降低亚居群
263第 2 期　　　　杭　焱等:濒危植物华山新麦草(Psathyrostachys huashanica)的遗传多样性及其保护
内遗传漂变(genetic drif t),且可以在一定程度上减少亚居群之间的强烈分化.
3　讨　论
华山新麦草是我国特有的禾草植物 ,仅生长在陕西华山 ,与同属的其他物种有较大的形态差异和形成
间断地理分布.由于其独特的分类地位 、狭窄的地理分布和作为小麦族遗传资源的重要经济价值而被列为
我国珍希濒危物种[ 10] .对于该物种进行有效保护非常重要 ,这样才能保证其长期存在以及在小麦育种中
的可持续利用.而对华山新麦草遗传多样性的研究则有利于该物种保护对策的确定.华山新麦草为典型的
风媒异花传粉的多年生植物[ 2] ,并可通过分蘖和地下茎进行克隆生长[ 11] .笔者曾对华山新麦草进行过栽
培实验 ,发现在套袋自花授粉时该物种完全不结实(卢宝荣 ,未发表资料).根据这一生殖特点而推断 ,该物
种的自然居群可能具有一定程度的遗传多样性.
本研究利用 ISSR分子标记对华山新麦草遗传变异检测分析的结果表明 ,该物种的各亚居群均有较
高水平的预期杂合度(He),变化在 0.086 ～ 0.233之间 ,除去样本个体数小于 5的亚居群(即 pop2-3 ,pop2-
4 ,pop2-5 , pop2-6 , pop2-7 , pop2-8 , pop2-12 , pop2-15),各亚居群的预期杂合度值分布在 0.195 ～ 0.233 之
间 ,均都大于 Hamrick等人统计的所有风媒异交植物居群水平的预期杂合度[ 20] .同时 ,各样本量大于或等
于 5的亚居群 ,其香农多样性指数变化在 0.287 ～ 0.350之间 ,表明在检测的华山新麦草样本中包含了较
高水平的遗传多样性.同时研究结果还表明华山新麦草遗传多样性的高低与各居群分布的海拔高度没有
明显相关关系 ,这可能与该物种的风媒传粉有关.我们认为以高度自交不亲合的异花传粉有性生殖方式结
合营养繁殖(主要为分蘖)的克隆生长可能是华山新麦草形成并维持居群内一定杂合度和较高水平遗传多
样性的原因之一.华山新麦草的有性繁殖分配相当低[ 11] ,但是这有限的有性繁殖为居群带来了一定频率
的杂合个体 ,通过杂合个体的无性繁殖将这些杂合基因位点固定了下来 ,并形成了携带不同杂合基因型个
体的克隆斑块.我们采样的个体之间空间距离均相隔1 m以上 ,很少发现来自同一克隆而基因型一致的样
本 ,这表明华山新麦草的克隆斑块较小 ,而且斑块之间有一定的遗传分化 ,这就形成了亚居群内的遗传异
质性.
通过上述研究分析 ,我们认为华山新麦草的自然居群有相对较高的遗传多样性 ,而且大部分遗传多样
性均存在于亚居群内 ,占总体遗传多样性的将近 70%.各亚居群之间也因为具有一定的基因交流而保持
了居群之间的联系 ,使居群之间的遗传分化不十分显著.因此该物种的濒危不应该是因遗传多样性低所
致 ,而是由于华山新麦草要求特殊生态环境而限制了其进一步发展和扩散 ,使其形成目前狭窄的分布格
局 ,对其“濒危”地位还有待于进一步的确认.华山新麦草为狭域分布的特有种 ,其自然居群一般处于比较
严酷的生长环境中 ,在岩石罅隙的残土壤中和山路旁有较多分布 ,但零散不连续 ,在溪边也可见少量生长.
华山新麦草生性通常喜光 ,在林荫下没有或少有分布.但它具有较强的抗逆性 ,能够生长在较恶劣的环境
中 ,居群一旦形成 ,周围一般很少有其他物种而成为稳定的单优种.可是 ,一旦其生态环境遭到破坏 ,其他
植物种类侵入 ,华山新麦草便失去竞争能力.所以我们认为 ,只要能够保证目前华山的生态环境不被进一
步破坏或有一定程度的修复 ,华山新麦草的生存就能维持下去.现在 ,随着旅游业的发展 ,人为破坏华山新
麦草自然生境的现象不容忽视.因此 ,建议有关部门对华山新麦草的保护采取积极措施 ,应尽量减少因旅
游产业开发对华山新麦草自然生境的侵占和破坏 ,并对已遭到破坏的华山生态环境进行维护和适当的修
复 ,使之有利于华山新麦草这一重要基因资源的可持续原生境保护.
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Genetic Diversity of the Endangered Species Psathyrostachys
huashanica in China and Its Strategic Conservation
HANG Yan, JINYan , LU Bao-rong
(Ministry of Education Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering , Institute of
Biodiversity Science , Fudan University , Shanghai 200433 , China)
Abstract:In order to estima te genetic diversity of Chinese endangered grass species Psathyrostachys huashanicaKeng ex
Guo , 12 selected ISSR primers w ere used to analyze genetic variation of 150 individuals from 20 sub-populations col-
lected in Huashan Mountain in Shaanxi Province.The results indicated that percentage of po lymorphic lo ci(P)was
96.8%, and the average effective number of alleles(Ae)was 1.411 per locus.The mean expected hetero zygosity
(He)of the to tal population was 0.251 , w hich w as greater than the average value(0.148)of the wind-pollinated and
outcrossing plant species.Shannon index of the to tal population was 0.391 , suggesting relatively high genetic diversity
in P.huashanica.The genetic differentiation coefficient(GST)was 0.304 , proposing that most(ca.70%)of the ge-
265第 2 期　　　　杭　焱等:濒危植物华山新麦草(Psathyrostachys huashanica)的遗传多样性及其保护
netic v ariation occurred within sub-populations with a certain frequency of gene flow .The sub-populations demonstrat-
ed relatively high genetic identity with similarity coefficient v ary ing be tw een 0.796-0.974(0.903 on average).I t is
concluded based on the study tha t the main threat to the existence of P.huashanica is ont associated with the low level
of genetic diversity , instead , the survival of this species is significantly related to its unique environmental require-
ments.The authors suggest that the continued availability of P.huashanica could be preserved if its original ecological
habitats could be maintained and restored.
Keywords　Triticeae;Psathyrostachys huashanica;population genetic structure;genetic diversity;inter-simple se-
quence repeat(ISS R);genetic conserv ation
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Ginkgolic Acids from Ginkgo Exocarp and Their Toxicity to the
Diamondback Moth , Plutella xylostella
GUO Chun-xia , FUDa-xu , ZHOU Tong-shui , LI Bo , DONGHui-qin
(Ministry of Education Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering , Institute of
Biodiversity Science , School of L ife Sciences , Fudan University , S hanghai 200433 , China)
Abstract:Diamondback moth(Plutella xylostella)is an impo rtant vegetable pest , w hose insecticide resistance attracts
much attention of scientists.For this reason , more and mo re attempts are made to develop biopesticides targeting a t the
pest.The to xic effects of g inkgolic acids ex tracted from ginkgo exocarp on P.xy lostella were examined.The results
show that ginkgolic acids had strong to xicity to 1st-3rd larvae of the diamondback moth.When 6.25 mg/ L of acid was
applied , non-selective antifeedant of the 3rd instar larvae w as 77.8% after 24 h , and 94.7% after 48 h.At 48 h ,
LC50 for of 1st and 2nd instar larvae w as 1.31 mg/ L , and that for the 3rd instar larvae was 6.07 mg/ L.On the basis
of the above results , it is concluded that the ginkgo exocarps can be used for ex tracting ginkgolic acids that can be po-
tentially used to develop new biopesticides.
Keywords:ginkgo exocarp;ginkgolic acids;Plutella xylostella L.feeding deter rent;to xicity
266 复 旦 学 报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　第 43 卷