全 文 ： 中国农业科学 2004，37（2）：274-279
Scientia Agricultura Sinica
水分胁迫诱导平邑甜茶叶片衰老期间内肽酶
与活性氧累积的关系
曹 慧1,2， 王孝威2， 韩振海1， 许雪峰1， 王永章3
（1中国农业大学园艺植物研究所，北京 100094；2潍坊学院农工系，潍坊 261061；3莱阳农学院，莱阳 265200）
摘要: 在水分胁迫下，平邑甜茶叶片3种不同底物内肽酶活性的变化可分为缓升期和速升期，分别对应于叶绿素
含量的缓降期和速降期。水分胁迫使平邑甜茶叶片SOD活性先升后降， ASA含量大幅度降低， O2-·、H2O2、1O2含量增高，
膜脂过氧化产物 MDA含量大幅度增加，且 Chl、O2-·、H2O2、1O2、MDA上升和下降的幅度与内肽酶活性的降低均呈显著
相关。表明水分胁迫下活性氧代谢失调而累积的活性氧（O2-·、H2O2、1O2）导致内肽酶活性大幅度上升。
关键词: 水分胁迫；平邑甜茶；衰老；内肽酶；活性氧
Relationship Between Changes of Endopeptidases Activity and
Active Oxygen in Malus hupehensis Leaves During Senescence
Induced by Water Stress
CAO Hui1,2, WANG Xiao-wei2, HAN Zhen-hai1, XU Xue-feng1, WANG Yong-zhang3
( 1Institute for Horticultural Plants, China Agricultural University, Beijing 100094; 2Department of Agriculture and Engineering,
Weifang University, Weifang 261061; 3 Laiyang Agricultural College, Laiyang 265200)
Abstract: The results showed that the changes of endopeptidases activities included two phases , the relatively steady
phase of low endopeptidases activity and the rapid increase phase of endopeptidases activity, which corresponding to relatively
steady phase and sharp fall phase of chlorophyll content. Under water stress, the contents of chlorophyll decreased. The activities
of SOD increased in the early period, then decreased. The contents of O
2
-· H
2
O
2
, 1O
2
, MDA increased and the content of antioxidants
ASA decreased. There are high significant correlation between endopeptidases activities and Chl, O
2
-· , H
2
O
2
, 1O
2
, MDA in M.
hupehensis pamp Reld. seedlings. The results indicated that the excessive accumulation of O
2
-· , H
2
O
2
, 1O
2
induced the increase
of endopeptidases activities with the duration of water stress.
Key words: Water stress; Malus Hupehensis; Senescence; Endopeptidases; Active oxygen
大多数高等植物在其个体发育期，常受到不同
程度的水分胁迫，从空气湿度的小波动至极端的水
分亏缺。不同程度的干旱均促使植物叶片衰老[1]。
水分胁迫可诱发植物体内水分代谢失调，引起组织
膜结构破坏，并导致蛋白质降解，加速叶片老
化。叶片老化最重要的特征是叶绿素含量迅速降
低，内肽酶活力急剧上升[2～4]。早在20世纪50年
代中期，Harman就提出了衰老的自由基假说，但
直到20世纪60年代末Mccord和70年代Fridorich
等发现SOD后，关于生物体内的自由基反应及由此
引发的脂质过氧化问题才引起人们重视。特别是活
性氧自由基的研究成为活跃的研究领域，认识到生
物体正常的物质代谢过程中，自由基产生和清除的
平衡对生物体起重要作用，这一平衡的紊乱将导致
收稿日期： 2003-03-07
基金项目：北京市果树逆境与分子生物学重点实验室和教育部优秀教师教科奖励基金资助项目
作者简介：曹 慧（1966-），女，山西太谷人，副教授，博士，主要从事果树逆境生理与分子生物学研究。E-mail：hui99016@sina.
com。韩振海为通讯作者。Tel:010-62892467; Fax:010-62891055
2期 曹 慧等：水分胁迫诱导平邑甜茶叶片衰老期间内肽酶与活性氧累积的关系 275
生物体的衰老，甚至死亡[5]。但水分胁迫引起植
物叶片内肽酶活性变化与活性氧代谢间关系的研究
报道尚少。笔者以苹果属植物平邑甜茶水培苗为试
材，研究水分胁迫引起平邑甜茶叶片老化期间内肽
酶活性变化与活性氧代谢间的关系，以探讨水分胁
迫诱发植物衰老的机制，为植物在逆境下推迟衰老
发生或延缓衰老进程提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
选取均匀一致的平邑甜茶（Malus hupehensis
pamp Reld.）种子，经4℃层积处理发芽后，播
于蛭石盆内，在培养室内培养。待幼苗长到4片真
叶，移至营养液水培处理，营养液初始pH用KOH调
至6.0，每周换1次营养液，每天定时通气，光
照14 h，光强400μmol photons·m-2·s-1，培养室
温度为：白天/夜间为22～28℃/17～21℃。
1.2 处理
取10周龄幼苗，移入含有20%PEG6000的营养
液中进行胁迫处理，设6次重复；对照为正常的营
养液水培苗。从处理开始，每2 d取样1次，每
天早晨8：00取样，取幼苗顶端第3～5片叶进行各
项指标测定。
1.3 测定方法
1.3.1 叶绿素含量的测定 采用Arnon[6]的方法测
定。O2-·含量的测定按王爱国等[7]的方法。H2O2含
量的测定参照林植芳等[8]的方法。叶绿体的制备参
考叶济宇[9]的方法，1O2活性的测定参考蒋明义等[10]的
方法。SOD活性、MDA含量的测定参照李合生[11]的
方法。抗坏血酸（ASA）含量的测定根据邹琦[12]的方法。
1.3.2 酶液提取及其活性测定 参照Wittenbach[13]
方法。取1 g叶片置于研钵内加入25 mmol·L-1HEPES缓
冲液[含1 mmol·L-1 EDTA，2 mmol·L-1 DTT及1% PVP
(w/v)，pH 8.0]冰浴研磨成匀浆，15 000×g离心30 min
(4℃)。取1 ml上清液加入已平衡的Sephadex G-25
(1.0 cm×25 cm)层析柱，用HEPES缓冲液洗脱，
收集的洗脱液用于蛋白质含量和内肽酶活性测定。
酶反应体系含1.4 ml 200 mmol·L-1柠檬酸缓冲
液,以牛血红蛋白(Bovine hemoglobin)、酪蛋白
(Casein)为底物时pH为5.2，以核酮糖-1，5二磷
酸羧化/加氧酶（Rubisco）纯化制剂为底物时pH
为4.8，以及0.4ml酶提取液、0.2ml底物，38℃
保温1h后用12%三氯乙酸（TCA）终止反应（对照
则在反应前加TCA终止）。在4℃下放置30 min，
离心（4000×g，10min）2次后，上清液用于氨
基酸的茚三酮反应。反应结束后，用分光光度计测
定在570 nm增加的吸光率（△A570），酶活性以比
活力△A570·mg-1protein·h-1表示。可溶性蛋白质含
量测定采用Bradford[14]的方法，用牛血清蛋白
（BAS)做标准曲线。
2 结果与分析
2.1 水分胁迫下平邑甜茶叶片叶绿素含量的变化
在水分胁迫处理初期，平邑甜茶叶片叶绿素含
量下降较缓慢，从胁迫第5天开始叶绿素含量迅速
下降（图1）。胁迫第5天比对照降低了16.1%，
胁迫第11天比对照降低了76.8%。叶绿素含量的大
幅度降低，表明水分胁迫已引起叶片衰老。
2.2 水分胁迫下平邑甜茶叶片内肽酶活性的变化
由图2可以看出，水分胁迫下叶片衰老期间内
肽酶活性变化可明显区分为2个时期，低值缓升期
和速升期，可分别对应于叶绿素的缓降期和速降期。
其中在内肽酶低值缓升期，酶活性变化幅度不大，
胁迫5 d后，开始大幅度上升，以牛血红蛋白为底
物的酶活性上升最快，酪蛋白居中，Rubisco为底
物的上升幅度较缓。但3种不同底物内肽酶活性变
化均随胁迫时间的延长呈上升趋势。
2.3 水分胁迫下平邑甜茶叶片SOD活性、ASA含
量的变化
SOD是植物体内清除O2-·的关键酶，SOD受O2-·
图1 水分胁迫下平邑甜茶幼苗叶片叶绿素含量的变化
Fig.1 Changes of chlorophyll content in leaves of
M.Hupehensis seedling under water stress
276 中 国 农 业 科 学 37卷
的调节。从图3可知，在正常供水条件下，SOD
在整个处理期内变化幅度不大。在水分胁迫前期，
SOD活性均呈上升趋势，胁迫后3d升至最高，比
对照提高了39.8%，之后活性下降，到11 d比对
照降低了33.3%。
ASA可还原O2-·、清除 ·OH、淬灭1O2及歧化
H2O2。试验结果表明（图3），在水分胁迫过程
中，ASA含量持续下降，水分胁迫后第3天比对照
降低了24.6%，5 d比对照降低了35.2%，11 d比
对照降低了69.2%。
2.4水分胁迫下平邑甜茶叶片活性氧（O 2-·、
H2O2、1O2）的变化
水分胁迫下平邑甜茶幼苗叶片中几种主要活性
氧（O2-·、H2O2、1O2）出现了明显的变化。水
分胁迫下平邑甜茶O2-·产生速率呈上升趋势。胁
迫后3 d比对照提高了20.3%，5 d比对照提高了
66.2%，11 d比对照提高了120.3%。H2O2含量在
整个水分胁迫处理期内均呈上升趋势。胁迫后3 d
比对照提高了10.9%，5 d比对照提高了41.2%,
11 d比对照提高了101.8%（图4）。单线态氧
1O2是三线态叶绿素将激发能传递给O2产生的。与
对照相比，水分胁迫下平邑甜茶1O2含量明显增
加。胁迫后3 d比对照提高了15.1%，5 d比对照
提高了46.2%，11 d比对照提高了131.6%（图5）。
2.5 水分胁迫下平邑甜茶叶片MDA含量的变化
从图5可知，水分胁迫下平邑甜茶叶片内MDA
含量明显增加。胁迫后3 d比对照提高了17.1%，
5 d比对照提高了34.5%，11 d比对照提高了139.7%。
2.6 水分胁迫下平邑甜茶叶片内肽酶活性与Chl、
O2
-·、H2O2、1O2、MDA含量间相关回归分析
由表表明，水分胁迫下平邑甜茶叶片3种不同
底物内肽酶活性与Chl、O2-·、H2O2、1O2、MDA
含量变化间均呈高度相关。表明水分胁迫下平邑甜
茶内肽酶活性的降低与活性氧代谢失调所引发的活
性氧（O2-·、H2O2、1O2）的累积直接相关。
图2 水分胁迫下平邑甜茶幼苗叶片内肽酶活性的变化
Fig.2 Changes of endopentidases activity in leaves
of M.hupehensis seedling under water stress
图3 水分胁迫下平邑甜茶SOD活性和ASA含量的变化
Fig.3 Changes of SOD activity and ASA content in
leaves of M.Hupehensis seedling under water stress
图4 水分胁迫下平邑甜茶幼苗叶片O2-·和H2O2含量的变
化
Fig.4 Changes of O2-· and H2O2 contents in leaves of
M.hupehensis seedling under water stress
2期 曹 慧等：水分胁迫诱导平邑甜茶叶片衰老期间内肽酶与活性氧累积的关系 277
表 水分胁迫下平邑甜茶叶片内肽酶活性与Chl、O2-·、H2O2、1O2、MDA含量间的相关回归分析1)
Table Correlation and linear analysis between the contents of Chl、O2-· 、H2O2、1O2、MDA a d endopeptidases
activity in M. Hupehensis leaves under water stress
相关因素 Rubisco为底物的相关系数 酪蛋白为底物的相关系数 牛血红蛋白为底物的相关系数
Correlation factor Rubisco substrate Casein substrate Bovine hemoglobin substrate
correlation coefficientcorrelation coefficientcorrelation coefficient
内肽酶与Chl -0.9087* -0.9236* -0.9668**
Endopeptidases-Chl
内肽酶与O2-· 0.8972* 0.9188* 0.9446**
Endopeptidases-O2-·
内肽酶与H2O2 0.921* 0.9672** 0.9629**
Endopeptidases-H2O2
内肽酶与1O2 0.9136* 0.9567** 0.9654**
Endopeptidases-1O2
内肽酶与MDA 0.952** 0.9273* 0.9137*
Endopeptidases-MDA
1)*和**分别表示差异达5%和1%显著水平
* and ** mean significance level at 5%,1%, respectively
图5 水分胁迫下平邑甜茶幼苗叶片1O2和MDA含量的变化
Fig.5 Changes of 1O2 and MDA contents in leaves of
M.Hupehensis seedling under water stress
3 讨论
叶绿素分解是衰老的原发过程及衰老的真正标
志，叶片老化最重要的特征是叶绿素含量迅速降低，
内肽酶活力急剧升高，叶绿素和蛋白质含量随衰老
进程显著下降[15,16]。Barret建议把所有分解蛋白
质肽键的酶称为蛋白水解酶，并按其作用的底物分
为内肽酶(Endopeptidases)或称蛋白酶(Pro-
teinases)和外肽酶(Exopeptidases)[17]。目前普遍
认为, 植物体蛋白质的降解先是由内肽酶将蛋白质
水解成小肽，再由外肽酶将小肽彻底水解成氨基酸，
然后这些终产物被贮存或运输。
水分胁迫可诱发植物体内水分代谢失调，引起
叶绿素含量下降、内肽酶活力提高，导致蛋白质降
解，膜组织结构破坏，从而加速叶片老化。水迫下
平邑甜茶叶片叶绿素含量的变化分为缓降期和速降
期，相对应于内肽酶缓升期和速升期活力的变
化，说明随水分胁迫时间的延长，叶绿素含量下
降，内肽酶活力增加，水分胁迫诱导和加速了叶
片的衰老。
自由基有细胞杀手之称，可通过多种渠道产
生，如果无法制止，生物将未老先衰。幸而生物
体内有许多能清除自由基的物质和过程，使自由基
不至泛滥成灾，植物正是在自由基和自由基清除剂
相互协调下才能使衰老成为“有序撤退”，但如
果两者失去平衡，清除剂来不及将自由基清除，
衰老将加速为“无序溃败”。因此，自由基清除
剂和其他防御系统削弱，预示衰老加速来临[1，5]。
试验表明，水分胁迫下平邑甜茶叶片随胁迫时
间延长，叶片内O2-·积累，诱导了SOD酶活性的
提高，胁迫第3天SOD活性升至最高，比对照提高
了39.8%。而SOD酶活性的提高又可催化O2-·歧化
反应，避免了O2-·在叶内过多积累，在胁迫前期，
O2
-·的产生与清除处于平衡状态，活性氧H2O2不发
生毒害作用，叶片生理功能保持基本正常。但胁迫
5 d后，O2-·在叶片内的积累已达到很高浓度，比
对照提高了66.2%，H2O2含量比对照提高了41.2%，
从而导致活性氧代谢失调，O2-·等自由基在叶内的
迅速积累而产生毒害作用，O2-·可使许多酶活性受
到抑制以及许多酶（蛋白质）的降解，同时还可
278 中 国 农 业 科 学 37卷
直接攻击核酸、蛋白质，使蛋白质合成受阻。一
般认为，O2-·不能直接启动膜脂过氧化，但可引发
Haber-Weiss反应（O2-·+H2O2→·OH+OH-+O2）生
成攻击力更强的 ·OH。本试验中，平邑甜茶幼苗
O2
-·在大量积累之前，已有H2O2的积累，所以这
一反应有可能发生。·OH可直接启动膜脂过氧化，
导致膜透性增大，叶片因生理功能逐渐丧失而走向
衰老死亡。
叶绿体是植物细胞中最需O2的分区，叶绿素
分子是最重要的光敏化剂分子。叶绿体类囊体膜富
含不饱和脂肪酸，因而对活性氧诱发的膜脂过氧化
特别敏感，1O2主要产生在叶绿体，1O2在光合色素
的降解过程中起着重要的作用[18]。试验结果表
明，水分胁迫下平邑甜茶幼苗叶绿体对NDA的漂白
作用增强。水分胁迫下平邑甜茶幼苗叶绿体中1O2的
主要淬灭剂Car含量也发生了很大变化。胁迫
后5 d平邑甜茶Chl含量比对照降低了16.1%，而
Car含量比对照降低了35.2%。使1O2的产生与清除
失去平衡，由此推测，水分胁迫下Car含量的大幅
度降低可能是1O2积累的原因。
MDA是膜脂过氧化降解的典型产物，它能与蛋
白质氨基酸残基或核酸反应生成Shiff碱，降低膜
的稳定性，促使膜的渗漏。液泡内蛋白水解酶和有
机酸因膜功能的丧失而释放出来，进一步加快对膜
的破坏。且3种不同底物内肽酶活性与Chl、O2-·、
H2O2、1O2、MDA含量变化间均呈高度相关。表明
水分胁迫下平邑甜茶内肽酶活性的降低与活性氧代
谢失调引发的自由基（O2-·、H2O2、1O2）的累
积直接相关。
水分胁迫下，一方面提高了活性氧（O2-·、H2O2、
1O2）的产生速率，另一方面破坏了以SOD为主导
的细胞保护酶系统和抗氧化还原剂（ASA）的含量，
叶片在这双重因素作用下，加速膜脂过氧化链式反
应，增加过氧化有害物积累，导致光合色素降解，内
肽酶活性升高，蛋白质分解加剧，细胞膜系统破坏
及大分子生命物质的损伤，最终导致衰老趋于死。
References
[1] 陆定志, 傅家瑞, 宋松泉. 植物衰老及其调控. 北京: 中国农
业出版社, 1997:184.
Lu D Z, Fu J R, Song S Q. Plant Senescence and Regul-
ation. Beijing: China Agriculture Press, 1997: 184. (in
Chinese)
[2] 曹 慧, 韩振海, 许雪峰. 水分胁迫引起平邑甜茶叶片老化期
间内肽酶活力的变化及其生化特性研究.中国农业科学, 2002,
35(12): 1 514-1 518.
Cao H, Han Z H, Xu X F. Effects of water stress on
endopeptidases activity and biochemical properties of
Malus hepehensis leaves during aging process. Sc entia
Agricultura Sinica, 2002, 35(12): 1 14- 518. (in
Chinese)
[3] Feller U K, Soong T T, Hageman R H. Leaf proteolytic
activities and senescence during grain development of
field grow corn (Zea mays L.). Plant Physiology, 1977,
59: 290-295.
[4] 高 玲, 叶茂炳, 徐朗莱, 张荣铣. 小麦叶片老化期间内肽酶活
力上升的影响因素. 中国农业科学, 1999, 32(3): 102-104 .
Gao L, Ye M B, Xu L L, Zhang R X. Factors affecting the
rise of endopeptidases activity in wheat leaves during
aging. Scientia Agricultura Sinica, 1999, 32(3): 102-
104. (in Chinese)
[5] 沈成国. 植物衰老生理与分子生物学. 北京: 中国农业出版社,
2001: 10.
Shen C G. Plant senescent Physiology and Molecular
Biology. Beijing: China Agriculture Press, 2001: 10.
(in Chinese)
[ 6 ] Arnon D I. Copper enzymes in isolated chloroplast
polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiology,
1949, 24: 1-15.
[7] 王爱国, 罗广华. 植物的超氧自由基与羟胺反应的定量关系. 植
物生理学通讯, 1990, 25(5): 55-57.
Wang A G, Luo G H. Quantitative relation between the
reaction of hydroxylamine and superoxide anion radicals
in plants. Plant Physiology Communication， 1990, 25
(5): 55-57. (in Chinese)
[8] 林植芳, 林桂珠, 李双顺,郭俊彦.衰老叶片和叶绿体中H2O2累
积与膜脂过氧化的关系.植物生理学报, 1988, 14(1): 16-22.
Lin Z F, Lin G Z, Li S S, Guo J Y. The accumulation of
hydrogen peroxide in senescing leaves and chloroplasts
in relation to lipid peroxidation. Acta Phytophysiologica
Sinica, 1988, 14(1): 16-22. (in Chinese)
[9] 汤章诚.现代植物生理学实验指导.北京：科学出版社, 1999:
1-3.
Tang Z C. Modern Experimental Guide of Plant Physiology.
Beijing: Science Press, 1999: 1-3. (in Chinese)
[10] 蒋明义, 郭绍川. 渗透胁迫及光照下水稻幼苗叶片光合色素
降解过程中1O2的参与. 植物学报, 1996, 32(10): 797-802.
Jiang M Y, Guo S C. Involvement of singlet oxygen in the
breakdown of photosynthetic pigments in the leaves of
rice seedling exposed to osmotic stress and light. Acta
Botanica Sinica， 1996, 32(10): 797-802. (in Chinese)
[11] 李合生. 植物生理生化实验原理和技术. 北京: 高等教育出版
社, 2000: 167-169， 264-265.
Li H S. Experimental Principal and Technology of Plant
Physiology and Biochemistry. Beijing: Higher Education
Press, 2000: 167-169，264-265. (in Chinese)
[12] 邹 琦.植物生理学实验指导.北京: 中国农业出版社, 2000:
171-172.
Zou Q.Experimental Guide of P ant Physiology. Beijing:
China Agriculture Press, 2000: 171-172. (in Chinese)
[13] Wittenbach V A. Breakdown of ribulose bisphosphate
carboxylase and change in proteolytic activity during
dark induced senescence of wheat seedlings. Plant
Physiology, 1978, 62: 604-608.
[14] Bradford N W.A rapid and sensitive method for quantitation
2期 曹 慧等：水分胁迫诱导平邑甜茶叶片衰老期间内肽酶与活性氧累积的关系 279
of microgram quantities of protein utilizing the principle
of protein-dye binding. Annual Biochemistry, 1979, 72:
248-252.
[15] 郑少清, 曾广文. 植物叶片衰老及其延缓衰老的分子途径. 植
物生理学通讯, 1999, 35(2): 152-157.
Zheng S Q, Ceng G W. Senescence of plant leaf and the
molecular approach for its delaying. Acta
Phytophysiologica Sinica, 1999, 35(2): 152-157. (in
Chinese)
[16] Buchanan-Wollaston V. The molecular biology of leaf
senescence. Journal Exper ment Botany, 1997, 48: 181-
199.
[17] Barrett A J. The many forms and functions of celluler
proteinases. Feed Processing, 1980, 39: 9-14.
[18] Nilsen E T, Orcutt D M. The Physiology of Plants Under
Stress. New York: John Wiley & Sons, 1996, 70-78.
（责任编辑 曲来娥）
《中国小麦品种改良及系谱分析》专著出版
庄巧生院士主编， 中国农业出版社2003年９月首版
由国家科学技术学术著作出版基金和华夏英才基金共同资助
定价：155.00元
本书从亲本取材，组合选配和遗传资源利用的角度，按我国小麦区划分十大麦区阐明我国小麦品种改
良发展的历程、育成品种的生产利用及演变情况，以及品种系谱的组成与发展变化，并对我国小麦三大病
害（条锈、赤霉、白粉）的抗病育种、品种产量潜力的进一步提高和加工品质的改良等诸多领域作了专题
综述。在诸论中概括分析了1949～2000年我国小麦生产的发展，改良品种在增产中的作用以及育种技术的
改进，简要追述了20世纪20年代前后肇始的我国早期小麦育种史略，使读者对我国小麦品种改良事业的
起步与成长壮大有一个较为系统和全面的了解。
《中国小麦品种改良及系谱分析》集科学性、实用性和史料性于一体。它的出版无疑对丰富我国小
麦（其它作物）育种理论与技术文库和更有成效地指导今后小麦育种实践与品种利用，具有重要的参考价
值和实际意义。
全书共13章，约102.1万字，可供中等以上从事农业科研、教学、生产和管理人员阅读，特别
是小麦育种工作者随时查阅的珍贵文献。