全 文 ：格力兜兰的无菌播种与组培快繁研究
周 丽1，李松克2，邓克云3，魏春杰3 (1．兴义民族师范学院，贵州兴义 562400;2．黔西南民族职业技术学院，贵州兴义 562400;3．黔
西南州绿缘动植物科技开发有限公司，贵州兴义 562400)
摘要 ［目的］研究格力兜兰的无菌播种与组培快繁，探讨其最佳培养条件，以期能够商品化生产格力兜兰，实现其资源保护和可持续利
用。［方法］以人工授粉的种子为外植体，进行无菌播种试验，并对其进行幼苗形态键成和生根壮苗条件研究。［结果］210 d 胚龄的种
子萌发率高;种子萌发最佳培养基为 1 /2 RE + NAA 0． 5 mg /L + BA 0． 2 mg /L + CM 50 ml /L + CH 1 g /L，壮苗培养基为 MS + NAA 1. 0
mg /L + BA 0． 2 mg /L +活性碳 0． 6 mg /L +香蕉泥 50 g /L。［结论］该研究实现了格力兜兰的快速繁殖，提高了其繁殖系数，能够进行商
品化育苗。
关键词 格力兜兰;种子;无菌播种;组培快繁
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)18 －09590 －03
Aseptic Sowing and Tissue Culture Propagation of Paphiopedilum gratrixianum
ZHOU Li et al (Xingyi Normal University for Nationalities，Xingyi，Guizhou 562400)
Abstract ［Objective］To study the asepstic sowing and tissue culture propagation of Paphiopedilum gratrixianum，explore its best culture
conditions，so as to realize the commerical production，resources protection and sustainable utilization of Paphiopedilum gratrixianum． ［Meth-
od］Experiment of asepsis sowing was carried out on the seeds of artificial pollination，and the formation of seedlings and conditions of rooting
were studied． ［Result］210-day embryo seeds had the highest germination rate，the best medium for germination was 1 /2RE + NAA 0． 5 g /L
+ BA 0． 2 mg /L + Coconut milk 50 ml /L + Casein hydrolisis 1 g /L;the strong seeding medium was MS + NAA 1. 0 mg /L + BA 0． 2 mg /L +
Activated charcoal 0． 6 mg /L + Mashed banana 50 g /L． ［Conclusion］The study achieved the rapid propagation of Paphiopedilum gratrixia-
num and improved the propagation coefficient，which provided the basis for commercial production of Paphiopedilum gratrixianum tissue．
Key words Paphiopedilum gratrixianum;Seed;Aseptic sowing;Rapid tissue propagation
基金项目 贵州省科技厅项目(黔科合 NY 字［2008］3029) ;贵州省教
育厅自然科学类科研项目(黔教科 2008095)。
作者简介 周丽(1978 －) ，女，贵州兴义人，硕士，副教授，从事观赏与
药用兰科植物的快繁保育和杂交育种研究，E-mail:Zhoulizxx
@ yahoo． com． cn。
收稿日期 2012-02-16
兜兰又称拖鞋兰是兰科兜兰属(Paphiopedilum)植物。
兜兰属的所有种均属于“野生动植物濒危物种国际贸易公
约”(CITES)附录Ⅰ的保护对象，目前总共有 79个野生种记录
在案［1］，中国野生兜兰达到 18 种。兜兰属是兰科的一个濒
危类群，由于其观赏价值高，猖獗走私、过度采集、生长环境
受破坏、自然更新能力差等原因，其野生数量急剧减少，有些
已濒临灭绝［2］。
格力兜兰(Paphiopedilum gratrixianum)分布于云南东南
部、老挝及越南北部，为地生或石上附生植物，属于绿叶种，
具有叶形秀美、花型美丽端庄、适应性强、花期长等优良特
点，是初级栽培首选植物之一。格力兜兰自然繁殖系数低，
采用组织培养中的器官培养法也很难从叶、花茎、子房等器
官中诱导出再生能力强的原球茎，因此无法通过无性克隆对
其进行商业化生产。目前应用最多的是通过种子无菌播种
获得大量种苗。该试验通过对培养基和种子年龄的筛选，探
讨格力兜兰的最佳培养条件，并对其进行幼苗形态键成和生
根壮苗条件研究，以期能够商品化生产格力兜兰，实现其资
源保护和可持续利用。
1 材料与方法
1． 1 材料 试验材料为格力兜兰大棚内盆栽植株，种内异
花授粉种子。
1． 2 方法
1． 2． 1 外植体消毒。剪取授粉后不同生长时间的果实，洗
洁精洗净表面后用自来水清洗，75%酒精表面消毒 30 s，浸
入 95%酒精中 1 s，取出后于酒精灯上点燃，待表面酒精烧尽
即可(注意不要在酒精灯上烤)。在灭菌滤纸上剖开果实，取
出种子接种于萌发培养基上［2］。
1． 2． 2 胚龄对种子萌发的影响。兰科植物的胚，是一卵形
的未分化的细胞团，不具子叶和胚乳，缺乏营养物质，在自然
条件下极难萌发［3］。自然状态下其萌发需要适宜的真菌感
染，种子从感染的真菌得到了萌发所需的养分，才能萌发，且
萌发率很低。采用组培的方法由蔗糖提供能量物质，在适宜
的条件下兰花的种子不需要共生菌也可以萌发。但该过程
对种子发育程度有一定要求［2］，故需要取不同时期的种子进
行胚抢救，寻找种子萌发最佳时期。
定期取授粉后 4、5、6、7、8、9 和 10 个月的种子于显微镜
下观察，记录种子情况，并播种观察萌发情况。
1． 2． 3 激素组合对格力兜兰种子萌发的影响。萌发培养基
以 Robert Ernst(简称 RE)为基本培养基，设 1 /2 RE和 RE 2
个标准，蔗糖分 20 和 30 g /L 2 个标准、7 g /L 琼脂粉(1 300
g /cm2) ，CH(水解酪蛋白)1 g /L，CM(椰子乳)50 ml /L，pH
5. 8。将 BA与 NAA按不同剂量组合添加到培养基中配制成
萌发培养基(表 2)。
在不同培养基配比试验中，采用授粉后 210 d的种子为
研究材料，取出各果实中的种子混匀后播种。启动萌发时间
以肉眼可见培养基上种子有明显膨大的原球体 30 个左右为
准。萌发率的统计，在超净工作台上，随机取播种 60 d的种
子，在显微镜下随机取不同视野统计 100粒种子中萌发的种
子数，萌发以胚突破种皮形成原球茎为准。
1． 2． 4 生根壮苗培养基。MS + NAA 0． 4 mg /L + BA 0． 2
mg /L +椰粉 12 g /L +香蕉 50 g /L +蔗糖 30 g /L +琼脂粉 7
责任编辑 王春艳 责任校对 卢瑶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(18):9590 － 9592
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.18.114
g /L，pH 5． 8，在不同的激素配比中寻找最佳组合。
壮苗生根采用 2步法:播种 70 d 左右，当萌发的原球茎
分化出 2个小叶尖时，将其转入萌发培养基 M12中，生长 60 d
左右，当小苗分化出 2个叶片，长出有 1 ～ 2个小根时将其转
入壮苗培养基中，每瓶 10 ～ 12 苗，培养 90 d 后便可出瓶
移栽。
1． 2． 5 培养条件。萌发光照强度为 5 00 lx，增殖、生根壮苗
时光照强度为 2 000 lx，光照时间 16 h /d，培养温度(25 ±
2)℃。
1． 2． 6 试管苗移栽。常温条件下炼苗 2 周后出瓶，洗净根
表面培养基，用 0． 01%高锰酸钾浸泡 3 min，阴凉处晾 8 ～ 10
h，操作时尽量避免伤根。栽培基质用经消毒处理的颗粒状
松树皮混合同体积的吸水石颗粒，每 12 cm的育苗袋中移栽
6株小苗，栽培基质只能填充到根茎处，切不可将根茎埋入基
质中，移栽浇足水后，一周内不浇水，经常向育苗袋周围的地
上洒水，使空气湿度维持在 85%以，并保持通风。
2 结果与分析
2． 1 胚龄对格力兜兰种子萌发的影响 由调查结果可知，
授粉后不同时期的种子形态差异较大，授粉 120 d 的果实内
无有效种子形成，胎座上的刮取物显微镜下仅见无色透明种
皮无明显胚，播种后呈浅褐色水浸状，不能萌发;授粉 150 d
胎座上取下的种子呈白色，显微镜下观察有无色透明的种
皮，种皮内有较小的胚，播种后能在较快时间内形成白色的
类胚状体，但是这些类胚状体在原培养基上长时间不分化，
经 120 d后分化率仅为 2%，若在较早时间内转入其他分化
培养基中也很少有分化，且在播种 90 d后开始有类胚状体变
褐死亡;授粉 180 d的种子，种皮浅黄色，约 30%种子有较饱
满胚，播种后能较快萌发，但萌发后的分化率仅为 60%左右;
授粉 210 d种子聚生在胎座上，轻轻拔动可分散，显微镜下可
见种皮呈浅褐色，胚饱满，播种后萌发率和分化率均在 90%
以上;授粉 240 d的种子已成熟，易于从胎座上散落，种皮呈
褐色，胚明显，播种萌发率有所下降，分化率仍高;授粉 270 d
和授粉 300 d的种子已成熟，且果实易裂，胎座萎缩，种皮深
褐色，萌发率下降，分化率仍在 90%以上(表 1)。
表 1 不同胚龄对格力兜兰种子萌发的影响
胚龄∥d 启始萌发时间∥d 萌发率∥% 分化率∥%
120 － － －
150 25 80 2
180 36 88 60
210 35 93 99
240 49 79 95
270 52 42 98
300 67 26 93
2． 2 激素组合对种子萌发的影响 试验结果表明，在 M9 和
M12中种子的萌发率分别为 94%和 96%，萌发效果显著。M9
中种子启动萌发早，原球茎呈浅黄绿色，早期表面光滑，播种
40 d后表面产生细绒毛状物，根和叶分化正常，易长成壮苗;
M12中启动萌发也较早，由于加有植物生长调节剂的原因，萌
发后的原球茎分化较 M9 早，未观察到原球茎表面具绒毛的
时期，后期分化成苗过程均正常，所以 M12为萌发最佳培养
基。在其他组合中，高细胞分裂素的组合 M2、M6、M10、M14中
种子萌发率偏低，且萌发后的原球茎在早期膨大、后期分化
有少部分具畸形叶的小苗，幼苗形态键成效果不佳;细胞分
裂素与生长素等量的组合 M3、M7、M9、M15中种子萌发率不
高，萌发后的原球茎分化力较差，有时还有原球茎变褐死亡
的现象发生。该结果显示，不添加植物生长调节剂或浓度较
低的高生长素比细胞分裂素组合有利于种子萌发，20 g /L的
蔗糖浓度对种子萌发有促进作用，水解酪蛋白和椰子乳的加
入对提高萌发率有显著的作用(表 2)。
表 2 萌发培养基及效果
处理 蔗糖∥g /L 基本培养基 CH∥g /L CM∥ml /L
激素组合∥mg /L
BA NAA
启动萌发时∥d 萌发率∥%
M1 30 1 /2RE 1 50 － － 53 57
M2 30 1 /2RE 1 50 0． 8 0． 2 56 39
M3 30 1 /2RE 1 50 0． 3 0． 3 56 28
M4 30 1 /2RE 1 50 0． 2 0． 5 49 58
M5 30 RE － － － － 60 23
M6 30 RE － － 0． 8 0． 2 66 15
M7 30 RE － － 0． 3 0． 3 72 19
M8 30 RE － － 0． 2 0． 5 66 27
M9 20 1 /2RE 1 50 － － 30 94
M10 20 1 /2RE 1 50 0． 8 0． 2 35 63
M11 20 1 /2RE 1 50 0． 3 0． 3 35 78
M12 20 1 /2RE 1 50 0． 2 0． 5 28 96
M13 20 RE － － － － 42 53
M14 20 RE － － 0． 8 0． 2 49 47
M15 20 RE － － 0． 3 0． 3 49 36
M16 20 RE － － 0． 2 0． 5 42 64
2． 3 壮苗生根 移栽时发现，叶片为 3 ～ 4 片，叶长 7 cm左
右，根条数大于 5，根长为 3 ～3． 5 cm的小苗根系不易缠绕，出
瓶时不伤根，出瓶操作方便且移栽成活率高。这表明 4种生根
培养基中以 R1 培养出的小苗移栽方便成活率高(表 3)。
195940 卷 18 期 周 丽等 格力兜兰的无菌播种与组培快繁研究
将试验所得试管苗进行移栽，其成活率可达 90%以上
(图 1)。
表 3 壮苗培养基对小植株的影响
处理
激素组合∥mg /L
NAA BA
植株状况
叶片数
片
叶长
cm
根数
条
根长
cm
R1 1． 0 0 3 6． 35 3． 31 3． 39
R2 1． 0 0． 2 4 7． 82 5． 26 3． 43
R3 2． 0 0 3 7． 21 5． 48 5． 26
R4 2． 0 0． 2 3 7． 32 4． 97 4． 97
3 结论
该研究结果显示，格力兜兰种子虽然在授粉后 150 d播
种能大量萌发形成类胚状体，但是类胚状体的分化能力差不
易成苗。授粉 210 d后的种子直接播种在无激素或浓度较低
的高生长素比细胞分裂素组合的 1 /2 RE 培养基上，种子萌
发率大于 90%，形成的原球茎健壮，有利于增殖有成苗。壮
苗培养基为 MS + NAA 1． 0 mg /L + BA 0． 2 mg /L +活性碳 0．
6 mg /L +香蕉泥 50 g /L。用充分蒸透的颗粒状松树皮混合
同体积的吸水石颗粒作为栽培基质，兼有保水性和透气性，
根系恢复快生长快，成活率高，植株生长量大。该研究实现
注:A为开花;B为结果;C为播种 30 d原球茎形成;D为播种 150 d形成的小苗;E为健壮的试管苗;F为试管苗移栽。
图 1 无菌播种技术
了格力兜兰的快速繁殖，提高了其繁殖系数，在生产中有实
际应用价值。
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