全 文 ：水分胁迫诱导平邑甜茶叶片衰老期间内肽酶
活力的变化及其生化特性研究
曹　慧 , 韩振海 , 许雪峰
(中国农业大学园艺植物研究所 ,北京　100094)
摘要:平邑甜茶叶片在水分胁迫下内肽酶活力的变化可分为低值缓降期和速升期 ,对应于叶绿素含量缓降期
和速降期 ,用激活剂和抑制剂处理。结果表明 , 水分胁迫引起叶片老化过程中存在 3 种以上的内肽酶(巯基蛋白
酶 、丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶),而在蛋白质降解中起主要作用的是巯基蛋白酶。以牛血红蛋白 、酪蛋白为底物
时 ,最适 pH 为 5.2;以 Rubisco为底物时 , 最适 pH 为 4.8。这表明水分胁迫在平邑甜茶叶片衰老过程中起主要作用
的是酸性蛋白水解酶;3 种底物内肽酶的最适温度均为 45℃。另外 , 用不同浓度放线菌酮 、激素 、H2O 2 处理的试验
表明 ,放线菌酮和 BA 可抑制内肽酶的活性 , 而 ABA 和 H2O2 可促进内肽酶活力的提高。
关键词:水分胁迫;平邑甜茶;内肽酶
Effects of Water Stress on Endopept idases Activity and
Biochemical Properties of Malus hupehensis Leaves During Aging Process
CAO Hui , HAN Zhen-hai , XU Xue-feng
(Institute for Horticultural Plants , China Agricultural University , Beijing 100094)
Abstract:The changes of endopeptidases activities in Malus hupehensis leaves under w ater st ress included
tw o phases , low steady phase and rapid increase phase , which relatively consisted w ith the changes of chloro-
phyll contents.Identified by inhibito rs(IA , PMSF , EDTA), activato r(DT T)and different substrates , there
existed more than three subclasses of endopeptidases during leaf aging process , namely thiol-pro teinases , serine
proteinases , and metallo-proteinases , and among of them , thiol-proteinases w as the most active one.The opt i-
mum pH for casein 、bovine hemog lobin and rubisco w ere 5.2 , 5.2 , and 4.8 , respectively.Acid endopeptidases
played a key role during aging process under w ater st ress.The optimum temperature were all 45℃.The results
treated w ith actidione , ABA , BA , and H2O2 also indicated that BA and actidione could inhibited endopeptidases
activi ty.On the other hand , ABA and H2O2 could enhance its act ivity.
Key words:Water st ress;Malus hupehensis;Endopeptidases
收稿日期:2002-04-09
基金项目:北京市重点实验室“果树逆境生理与分子生物学实验室”及教育部优秀教师教科奖励基金资助项目
作者简介:曹　慧(1966-),女 ,山西太谷人 ,副教授 ,博士研究生 ,主要从事果树逆境生理与分子生物学方面的研究。 Tel:010-62892853;E-m ail:
hui99016@sina.com。韩振海为通讯作者 , Tel:010-62892467;Fax:010-62891055;E-mail:hzh@mail.cau.edu.cn
　　水分胁迫可诱发植物体内水分代谢失调 ,引起
组织膜结构的破坏 ,导致蛋白质降解 ,加速叶片老
化。叶片老化最重要的特征是叶绿素含量迅速降
低 ,内肽酶活力急剧升高。在多种植物离体和连体
叶片老化试验中已发现蛋白质下降与内肽酶活力上
升有关[ 1 ～ 5] ,但水分胁迫引起植物叶片内肽酶活性
变化及其生化特性方面的研究尚未见报道 。本试验
以苹果属植物平邑甜茶的液培苗为试材 ,研究了水分
胁迫引起平邑甜茶叶片老化期间内肽酶活力变化及
其生化特性 ,以探讨水分胁迫诱发植物衰老的机制。
1　材料与方法
1.1　材料
选取均匀一致的平邑甜茶(Malus hupehensis
中国农业科学　2002 , 35(12):1514-1518
Scientia Ag ricultura Sinica
pamp Reld.)种子经 4℃层积处理发芽后 ,播于蛭石
内 ,在培养室内培养 。待幼苗长到 4片真叶时 ,移至
营养液水培 ,营养液初始 pH 用 KOH 调至 6.0 ,每
周更换 1次营养液 ,每天定时通气 ,14 h 光照 ,光照
强度 400 μmol photons·m-2·s-1 ,温度为白天/夜
间:22 ～ 28℃/17 ～ 21℃。
1.2　处理
取 10周龄的幼苗 ,分别移入正常或含有 20%
PEG的水溶液进行胁迫处理 ,共设 6次重复。从处
理开始 ,每隔 2 d取样一次(每天早晨 8:00 取样),
取幼苗顶端第 3至第 5片叶测定各项生理指标。用
不同浓度放线菌酮 、激素暗处理叶片 ,于处理 48 h
后取样测定内肽酶活力 。不同 H2O2 浓度处理的叶
片分别于处理后 0 、24 、48 和 72 h 取样测定其内肽
酶活力。
1.3　测定方法
1.3.1　酶液的提取和活力测定 　参照 Witten-
bach
[ 6]方法 ,将 1 g 叶片置于研钵内加入 5 ml 5
mmol·L-1的 HEPES 缓冲液[含 1 mmol·L-1 ED-
TA ,2 mmol·L-1 DTT 及 1%(w /v)PVP , pH 8.0]
冰浴研磨成匀浆 ,15 000 g 离心 30 min(4℃)。取 2
ml上清液加入已平衡好的 Sephadex G-25(1.0 cm
×25 cm)层析柱 ,用 HEPES 缓冲液洗脱 ,收集的洗
脱液用于蛋白质含量和内肽酶活性的测定。
酶反应体系含 1.4 m l 200 mmol·L-1柠檬酸缓
冲液[ 以牛血红蛋白(bovine hemog lobin)、酪蛋白
(casein)为底物时 pH为 5.2 ,以 Rubisco(纯化制剂)
为底物时 pH 为 4.8] 、0.4 ml酶提取液 、0.2 ml底
物 ,于 38℃保温 1 h后用 12%三氯乙酸(TCA)终止
反应(对照在反应前加 TCA 终止反应)。在 4℃下
放置 30 min ,4 000 g 离心(10 min)2次后 ,上清液用
于氨基酸的茚三酮反应 。反应结束后 ,用分光光度
计测定在 570 nm处增加的吸光率(■A570),酶活力
则以比活力■A570·mg-1·h-1表示 。
在 pH 3.0 ～ 8.8 测定 pH 对内肽酶活力的影
响。在 25 ～ 75℃的预设温度范围内 ,测定温度对内
肽酶活力的影响 。参照Wittenbach[ 6]介绍的方法测
定二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酸(IA)、苯甲基磺酰氟
(PMSF)、乙二胺四乙酸(EDTA)对内肽酶活力的影
响。提取的内肽酶酶液按上述方法过滤洗脱 , IA 、
PMSF、DTT 、EDTA 于反应开始前分别溶于 200
mmol·L-1柠檬酸缓冲液中[以牛血红蛋白 、酪蛋白
为底物时缓冲液 pH 为 5.2 ,以 Rubisco 为底物时缓
冲液 pH 为 4.8 ,其中 IA在酶反应体系中终浓度为
2 mmol·L-1 , PMSF 、 DTT 为 1 mmol·L-1 , EDTA
为 2.5mmol·L-1 ,于 38℃保温 1 h 。终止反应后测
定其内肽酶活力。
1.3.2　总可溶性蛋白质含量的测定　采用Read和
Northcote的方法测定总可溶性蛋白质含量[ 7] ,以牛
血清白蛋白(BSA)为标准蛋白 。
1.3.3 　叶绿素含量的测定 　叶绿素含量采用
Arnon
[ 8]介绍的方法测定。
2　结果与分析
2.1　水分胁迫下平邑甜茶叶片中叶绿素含量的变化
在水分胁迫处理初期 ,平邑甜茶叶片中叶绿素
含量下降较为缓慢 ,从胁迫第 5天开始叶绿素含量
极显著下降(图 1)。叶绿素含量的大幅度降低 ,表
明水分胁迫已引起平邑甜茶叶片的衰老。
图 1　水分胁迫下叶绿素含量的变化
Fig.1　Changes of chlorophyll content under w ater stress
2.2　水分胁迫下平邑甜茶叶片中内肽酶活力的变化
从图 2可以看出 ,水分胁迫下的平邑甜茶叶片
衰老期间内肽酶活力的变化 ,可明显划分为 2个时
期 ,即低值缓升期和速升期 ,分别对应于叶绿素的缓
降期和速降期 。其中在内肽酶低值缓升期 ,酶活力
变化幅度不大 ,胁迫 5 d 后 ,酶活力开始大幅度上
升 ,以牛血红蛋白为底物的酶活力上升幅度最大 ,酪
蛋白居中 ,以 Rubisco为底物的酶上升幅度较为缓慢。
2.3　水分胁迫下平邑甜茶叶片内肽酶的 pH效应
在 pH 3.0 ～ 8.8 之间测定酶液的内肽酶活力。
pH 3.0 ～ 6.0为柠檬酸缓冲液 , pH 7.2 ～ 7.8为磷
酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液 , pH 8.8为 Tris-HCl
缓冲液 。由图 3可知 ,以牛血红蛋白 、酪蛋白为底物
时最适 pH为 5.2 ,以 Rubisco 为底物时最适 pH 为
4.8。试验表明 ,水分胁迫引起植物叶片衰老中起主
要作用的是酸性蛋白水解酶 。
151512 期　　　　　　　　曹　慧等:水分胁迫诱导平邑甜茶叶片衰老期间内肽酶活力的变化及其生化特性研究　　　　　　　　
图 2　水分胁迫下内肽酶活力的变化
F ig.2　Changes of endopeptidases activity under water stress
图 3　pH对内肽酶活力的影响
F ig.3　Effects of pH reaction mixture on endopeptidases activity
2.4　水分胁迫下平邑甜茶叶片中内肽酶的温度效应
将未加酶液的反应混合液分别在 25 ～ 75℃的
预定温度中先保温 10 min ,然后加入酶液以保证酶
促反应自始自终保持预定的温度 ,测定温度对内肽
酶的效应。由图 4可知 ,内肽酶分别以 Rubisco、酪蛋
白和牛血红蛋白为底物的最适反应温度均为 45℃。
图 4　温度对内太酶活力的影响
F ig.4　Effects of reaction temperature on endopeptidases activity
2.5　水分胁迫下平邑甜茶叶片内肽酶的抑制和激
活
酶的提取液与一定浓度的激活剂或抑制剂一起
保温 30 min ,然后进行酶活力的测定。由表可以看
出 ,与对照相比 , DTT 显著提高内肽酶的活力 ,而
IA 、PMSF 、EDTA 均导致酶活力有一定程度的降
低 ,其中 IA对内肽酶活性的抑制最大 。
表　激活剂和抑制剂对内肽酶活力的影响
Table　Effects of activation and inhibition on endopeptidases
activity
激活剂或抑制剂
Activator or
inhibitor
内肽酶活力
Endopeptidases activity(■A570·mg-1pro tein·h-1)
相对活性
Relative activity(%)
Rubisco为底物
Rubisco substrate
　对照 Cont rol 9.62 b B 100
　DTT (1 mmol·L-1) 14.5 a A 150.7
　IA (2 mmo l·L-1) 5.88 c C 61.1
　PMSF(1 mmol·L-1) 7.24 bc BC 75.3
　EDTA (2.5 mmol·L-1) 8.73 b B 90.7
Casein 为底物
Casein subst rate
　对照 Contro l 13.26 b B 100
　DTT (1 mmol·L-1) 20.99 a A 158.3
　IA (2 mmo l·L-1) 6.72 c C 50.7
　PMSF(1 mmol·L-1) 11.09 b B 83.6
　EDTA (2.5 mmol·L-1) 12.32 b B 92.9
Bovine hemoglobin为底物
Bovine hemoglobin substra te
　对照 Contro l 16.54 b B 100
　DTT (1 mmol·L-1) 26.88 a A 162.5
　IA (2 mmo l·L-1) 9.71 c C 58.7
　PMSF(1 mmol·L-1) 13.25 b B 80.1
　EDTA (2.5 mmol·L-1) 15.12 b B 91.4
2.6　水分胁迫下外源因素对平邑甜茶叶片内肽酶
活性的影响
2.6.1　放线菌酮和氯霉素对平邑甜茶叶片中内肽
酶活性的影响　用放线菌酮和氯霉素处理离体叶
片 ,处理后 48 h测定内肽酶的活力(以 Rubisco 为底
物),以对照内肽酶的活力为 100。测定结果表明
(图 5),随放线菌酮和氯霉素浓度的增加 ,内肽酶活
力逐渐降低 。其中放线菌酮的抑制作用显著高于氯
霉素。由于放线菌酮专一性地抑制 80S核糖体上蛋
白质的合成 ,氯霉素专一地抑制 70S 核糖体上蛋白
质的合成 ,所以试验结果表明 ,内肽酶是由核基因编
码的蛋白水解酶。
1516　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中　国　农　业　科　学　　　　　　　　　　　　　　　　　　35卷
图 5　放线菌酮和氯霉素对内肽酶活力的影响
F ig.5　Effect of actidione and chloramphenicol on eddopepti-
dase activity
2.6.2　激素对平邑甜茶叶片内肽酶活性的影响　
不同浓度的 ABA和 BA处理离体叶片 48 h ,测定内
肽酶活力(Rubisco 为底物)。以对照内肽酶的活力
为100。由图 6可以看出 ,内肽酶活力随 ABA 浓度
的增加迅速升高 ,随 BA浓度的增加而逐渐下降。
图 6　激素对内肽酶活力的影响
F ig.6　Effect of hormone on endopeptidase activity
2.6.3　H2O2 对平邑甜茶叶片内肽酶活性的影响　
用 0.5 mmol·L-1和 1 mmol·L-1的 H2O2 处理离体
叶片 ,处理后 0 、24 、48 和 72 h 测定内肽酶的活力
(以 Rubisco 为底物)。测定结果表明(图 7), H2O2
可促进内肽酶活力的上升 ,随着 H2O2 浓度的增大
和处理时间的延长 ,内肽酶活力也随之增高。
3　讨论
叶绿素含量的变化是植物叶片对水分胁迫比较
敏感的指标之一 ,水分胁迫引起叶绿素含量下降 、蛋
白质降解是叶片衰老的基本特征。水分胁迫下平邑
图 7　H2O2对内肽酶活力的影响
Fig.7　Effect of H2O2 on endopeptidase activity
甜茶叶片中叶绿素含量的变化可划分为缓降期和速
降期 ,相对应于内肽酶活力的变化 ,说明随着水分胁
迫时间的延长 ,叶绿素含量下降 ,叶片趋向衰老 ,内
肽酶的活力也随之增大 ,从而进一步加速了叶片的
衰老死亡 ,以致对植株造成不可逆的伤害 。
Hartley[ 9]曾依据作用机理将蛋白水解酶分为
丝氨酸 、巯基 、酸性和金属等 4种蛋白酶。而 Bar-
ret[ 10]则建议把所有分解蛋白质肽键的酶称为蛋白
水解酶 ,并按其作用的底物可分为内肽酶(endopep-
tidases)或称蛋白酶(proteinases)和外肽酶(exopept i-
dases)。目前普遍认为植物体蛋白质的降解先是由
内肽酶的作用 ,将蛋白质水解成小肽 ,再由外肽酶起
作用将小肽彻底水解成氨基酸 ,然后这些终产物被
用于贮存或运输。根据内肽酶活性中心的催化机理
分为巯基蛋白酶(thiol-proteinases)、丝氨酸蛋白酶
(serine pro teinases)、天冬氨酸蛋白酶(aspartic pro-
teinases)、金属蛋白酶(metallo-pro teinases)以及类型
未确定的蛋白酶(unclassif ied proteinases)。因此 ,和
其它酶不同 ,鉴别蛋白酶的种类时 ,抑制剂的专一性
效应比底物和 pH 等更为重要 。试验结果表明 ,
DTT(巯基蛋白酶的保护剂)可显著提高蛋白水解
酶的活力;而 IA(巯基蛋白酶的专一性抑制剂)、
PM SF(丝氨酸蛋白酶的专一性抑制剂)和 EDTA
(金属蛋白酶的专一性抑制剂)使内肽酶活力比对照
均有不同程度的降低 ,其中 IA 抑制内肽酶的活力
最显著。由此看来 ,水分胁迫下苹果属植物叶片中
至少存在 3种内肽酶 ,即巯基蛋白酶 、丝氨酸蛋白酶
及金属蛋白酶 ,其中最活跃的是巯基蛋白酶 。本试
验结果还表明 ,以牛血红蛋白 、酪蛋白为底物时蛋白
水解酶的最适 pH 均为 5.2 ,以 Rubisco为底物时最
适 pH 为 4.8;最适温度均为 45℃。
151712 期　　　　　　　　曹　慧等:水分胁迫诱导平邑甜茶叶片衰老期间内肽酶活力的变化及其生化特性研究　　　　　　　　
本试验还对水分胁迫引起叶片老化期间内肽酶
活力上升的影响因素进行了研究 ,结果表明 ,水分胁
迫下内肽酶活力的上升可能与以下因素有关:(1)内
肽酶的从头合成 。经放线菌酮与氯霉素处理的试验
结果表明 ,水分胁迫下叶片老化过程中有内肽酶的
从头合成 ,并且这种合成主要是在对放线菌酮敏感
的细胞质 80S 核糖体上进行的;(2)激素的调节作
用。外源 BA能阻止内肽酶活力的上升 ,而 ABA 则
促进内肽酶活力的上升。说明水分胁迫诱导植物衰
老的过程中 ,内源激素相对含量及其比值的变化会
影响内肽酶活性的变化 ,从而加速或延缓叶片的老
化;(3)活性氧的影响 。水分胁迫可诱发植物体内水
分代谢失调 ,引起组织膜结构的破坏 ,使活性氧的产
生与清除之间的代谢失调 ,造成 H2O2 等活性氧的
累积。经外源 H2O2 处理可显著提高内肽酶的活
性 ,并随着 H2O2 浓度的增加和处理时间的延长而
增加。H2O2含量的增加是植物衰老的主要变化标
志之一[ 11] ,已有证据表明 , H2O2 可能充当某种信号
传递物质 ,调控一些防卫基因的表达[ 12] 。说明在植
物衰老过程中有一些水解酶从头合成 ,至于本试验
外源 H2O2 可以促进内肽酶活性的提高是否是
H2O2促进内肽酶的从头合成 ,还有待进一步研究。
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