全 文 ：收稿日期:2008-11-19;修回日期:2009-02-19
基金项目:甘肃省中青年基金资助项目(3YS061-A25-030);兰
州大学干旱农业生态教育部重点实验室基金资助
作者简介:李巧峡(1980-),女 ,甘肃天水人 ,实验师 , 硕士 ,主要
研究方向为植物生理生态 , E-mail:liqiaoxia8024@163.com.
文章编号:1673-5021(2009)03-0036-05
青藏高原喜马拉雅嵩草的遗传多样性研究
李巧峡 ,赵庆芳
(西北师范大学生命科学学院 , 甘肃　兰州　730070)
　　摘要:应用随机扩增多态 DNA(RAPD)方法对青藏高原东部喜马拉雅嵩草的遗传多样性进行了研究 , 结果表
明:在居群水平与物种水平上喜马拉雅嵩草都存在比较丰富的遗传多样性 , 多态位点百分率(PPB%)分别为
70.23%和 81.82%;Nei s 基因多样度(h)分别为 0.2446 和 0.2738;Shannon s 信息指数(I)分别为 0.3662 和
0.4099。 AMOVA 数据表明 ,喜马拉雅嵩草的遗传变异主要分布在居群内 , 居群内变异占总变异的 89.06%。遗传
分化系数(Gst)也显示了相似的结果 , 为 0.1066。综合各项指标表明 ,喜马拉雅嵩草符合风媒异交的繁育系统特征。
关键词:喜马拉雅嵩草;遗传多样性;风媒异交
中图分类号:S812;Q311　　　文献标识码:A
　　喜马拉雅嵩草(Kobresia roy leana)是莎草科苔
草亚科嵩草属多年生草本植物 ,主要分布于青海 、甘
肃南部和西部 、四川西部和西南部 、云南西北部 、西
藏 ,生于高山草甸 、高山灌丛草甸 、沼泽草甸 、河漫滩
等。喜马拉雅嵩草具有较广的生态适应性 ,在比较
干燥的山地 、湿润地段及灌丛中都有分布 ,是青藏高
原高寒草甸的主要优良牧草和生态草种 ,也是青藏
高原嵩草草甸的主要优势植物[ 1] 。由于嵩草草甸所
处的特殊地理位置与高寒的气候条件 ,生态系统十
分脆弱 ,极易破坏且难以恢复 。长期以来 ,由于不合
理的人类活动 ,如过度放牧和滥采滥挖 ,嵩草草甸退
化日趋严重[ 1 , 2] 。本研究以青藏高原分布的喜马拉
雅嵩草为研究对象 ,运用 RAPD分子标记对喜马拉
雅嵩草的遗传多样性进行研究 ,探讨在青藏高原高
寒生态条件下 ,其不同居群的遗传多样性及居群遗
传变异在时空中的分布式样等 。通过对遗传多样性
的研究阐明其在高寒环境胁迫条件下的适应机理和
繁育系统 ,为进一步研究高寒草甸生态系统的结构 、
功能及其演化提供理论依据 ,并为草场资源的合理
利用与保护 、退化草地的恢复与重建提供科学依据 。
1　材料与方法
1.1　材料
2003年 7月和 8月 ,在青藏高原的不同地方采
集了喜马拉雅嵩草(Kobresia roy leana)3个居群 63
个个体(表 1)。采用居群取样的方法(20m ×20m),
随机取 21个不同克隆系的新鲜叶片 ,分别用变色硅
胶或吸水纸进行快速干燥 ,带回实验室 ,室温干燥保
存待用。
表 1　喜马拉雅嵩草采样记录
Table 1　The sampling record of K.roy leana
居群
Population
code
采样地点
S amp ling
site
生境
Habitat s
海拔高度(m)
Alti tude
取样个体数
Sampling si ze
X1 天祝金强河岸 潮湿灌丛 2750m 21
X2 甘肃玛曲 阳坡灌丛 3860m 21
X3 青海拉脊山 阴坡灌丛 3630m 21
1.2　DNA提取与检测
采用改进的 CTAB法提取总 DNA [ 3] 。提取的
DNA 加 200μl 1×TE ,在 4℃冰箱中溶解 。在含有
0.5μg/mL EB的 0.8%琼脂糖凝胶中电泳检测各
模板有无降解 ,并以λDNA 为标准 ,电泳定量。
1.3　引物筛选
本研究所用引物购自上海生工公司 ,从 250个
RA PD随机引物中筛选条带清晰 、多态性高 、反应
稳定并且重复性好的引物进行扩增。
1.4　RAPD-PCR
扩增反应在 Biometra UNOⅡ PCR仪上进行 。
PCR程序如下:94℃预变性 5min;然后进入 40个循
环:94℃ 1min , 37℃1min , 72℃ 1min;循环完成后 ,
72℃延伸 7min;最后于 4℃保存。10μl反应体系组成
如下:50mmol/ L Tris-HCl(pH 8.3), 10% Ficoll ,
1mmol/L Tartrazine , 500μg/mL BSA , 2mmol/ L
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第 31 卷　第 3 期　　　　　　　　　　中　国　草　地　学　报　　　 　　　　　　　2009 年 5 月
　　Vol.31　No.3 　　　　　　　　　　Chinese Journal of G rassland 　　　　　　　　　 May 2009　　
MgCl2 ,200μmol/ L dNTP , 1μmol/ L Primer ,0.5 units
TaqDNA polymerase 和 5 ～ 10ng 模板。扩增产物在
含有 0.5μg/mL EB 的 1.5%的琼脂糖凝胶上电泳
3.5 ～ 4h ,电泳介质用 TBE 。使用 Uvi凝胶图像分析
系统成像 ,使用 100 ～ 3000bp分子量标记。
1.5　数据分析
根据反应产物在电泳图中的位置 ,按条带的有
无记为“1”或“0” ,形成 RAPD 表型的 0/1 数据矩
阵。用 POPGENE32软件计算各居群的多态位点
百分率(PPB)、Shannon信息指数(I)和 Nei s 基因
多样度(h);居群内遗传多样性(Hs)、总的遗传多样
性(Ht)、基因分化系数(Gst)、基因流估计值(Nm)
和 Nei s遗传距离。并用 AMOVA155软件分析居
群内和居群间的遗传变异 。
2　结果与分析
2.1　喜马拉雅嵩草的遗传多样性
用筛选的 14条 RAPD引物对喜马拉雅嵩草的 3
个居群进行扩增(图 1),所得片段的大小从 180bp到
2500bp ,平均每个引物扩增的位点数为 13.4个(表 2)。
14条引物扩增的多态性条带比率(PPB%)、Nei s
基因多样度(h)和 Shannon信息指数(I)见表 3。喜
马拉雅嵩草 3个居群共计 63个个体 ,共检测到 187
条扩增条带 ,多态条带 153 条。物种水平的多态条
带比率(PPB%)为 81.82%, Nei s基因多样度(h)
为 0.2738 ,Shannon 信息指数(I)为 0.4099。居群
平均多样性水平 PPB为 70.23%, h 为 0.2446 , I 为
0.3662。3个居群中以 X3的遗传多样性最高 ,PPB
为 72.73%,h 为 0.2485 , I 为 0.3735;X1的遗传多
样性最低 , PPB 为 69.52%, h 为 0.2375 , I 为
0.3509。按所检测到的多态位点丰富度 , 3 个居群
的排序为:X3(72.73%)>X1(69.52%)>X2
(68.45%);Nei s 基因多样度(h)排序依次为:X3
(0.2485)>X2(0.2478)>X1(0.2375);Shannon信
息指数所反映的趋势与 Nei s基因多样度的相同 ,
X3(0.3735)>X2(0.3683)>X1(0.3509)。
M 为 DNA 分子量标量(100～ 3000bp)。
M mean ladder(100～ 3000bp).
图 1　引物 S377 对喜马拉雅嵩草 X3(1 ～ 21 泳道)样品的扩增谱带
Fig.1　RAPD bands of X3 sample s(lane 1～ 21)amplified with S377
表 2　14个随机引物在喜马拉雅嵩草 3 个居群产生的片段大小范围 、位点总数
Table 2　Band size and total loci of K.roy leana population by 14 RAPD-PCR
引物
Prim er
片段大小(bp)
Band siz e
总位点数
Total loci
引物
Primer
片段大小(bp)
Band size
总位点数
Total loci
S1270 1800～ 300 14 S209 2500～ 350 14
S1489 1500～ 220 13 S304 1800～ 250 16
S1515 2200～ 300 16 S306 1800～ 380 13
S1516 2500～ 300 14 S331 1500～ 180 16
S1519 1750～ 400 12 S372 1200～ 320 11
S186 2500～ 550 9 S377 1300～ 280 13
S2088 1200～ 400 11 S411 1300～ 180 15
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李巧峡　赵庆芳　　青藏高原喜马拉雅嵩草的遗传多样性研究
表 3　喜马拉雅嵩草 3 个居群遗传多样性的 RAPD分析
Table 3　Genetic diversity of RAPD analysis about K.royleana population
居群
Populat ion
多态条带数
No.of
poly morphic
多态条带比率(%)
Percentage
polym orphic loci
等位基因观察值
Ob served number
of al lelesna
有效等位基因数
Ef fective number
of allelesne
Nei s基因多样度
Nei s gene
diversityh
S han non多样性指数
Shannon s in format ion
index
X1 130 69.52 1.6952 1.4036 0.2375 0.3569
X2 128 68.45 1.6845 1.4307 0.2478 0.3683
X3 136 72.73 1.7273 1.4219 0.2485 0.3735
平均 131.33 70.23 1.7023 1.4117 0.2446 0.3662
物种 153 81.82 1.8182 1.4711 0.2738 0.4099
标准差 0.3867 0.3691 0.1889 0.2595
2.2　喜马拉雅嵩草的遗传结构
用 AMOVA 进行分子方差分析 ,表明喜马拉雅
嵩草的遗传变异主要存在于居群内(89.06%),居群
间遗传变异较小(10.94%,见表 4)。居群的基因分
化系数(Gst)为 0.1066 , 基因流估计值(Nm)为
4.1906(表 5)。
表 4　喜马拉雅嵩草的分子方差分析(AMOVA)
Table 4　AMOVA analysis about K.royleana population
变异来源
S ource of variance
自由度
D.f
平方和
SSD
期望平均平方值
MSD
方差成分
Variance component
百分比(%)
Percen tage
P-值
P-value
居群间 2 171.90 85.95 2.95 10.94 <0.0010
居群内 60 1440.76 24.01 24.01 89.06 <0.0010
表 5　喜马拉雅嵩草居群间的基因分化系数
Table 5　The Gst-values of K.royleana population
Nei s总基因多样度
Ht
Nei s居群内基因多样度
Hs
Nei s基因分化系数
Gst
Nei s基因流估计值
Nm
0.2738 0.2446 0.1066 4.1906
2.3　喜马拉雅嵩草居群间的遗传距离和聚类分析
在喜马拉雅嵩草的 3个居群中 ,以 X1(天祝)和
X3(青海)的遗传一致性最高(0.9487),遗传距离最
近(0.0526);以 X2(玛曲)和 X3(青海)的遗传一致
性最低(0.9310),遗传距离最远(0.0715)(表 6)。
表 6　喜马拉雅嵩草 3 个居群的遗传相似性
(对角线上)和遗传距离(对角线下)
Table 6 　Nei s genetic similarity(above diagonal)and genetic
distance(below diagonal)among three populations of K.royleana
居群 Population X1 X2 X3
X1 - 0.9464 0.9487
X2 0.0551 - 0.9310
X3 0.0526 0.0715 -
3　讨论
3.1　遗传多样性研究
喜马拉雅嵩草为多年生草本植物 ,繁殖对策以
营养繁殖为主 ,有性繁殖为辅[ 4] 。野外观察发现喜
马拉雅嵩草产生种子的能力不小 ,但是关于其在有
性繁殖中的交配系统目前了解很少。嵩草属植物均
属苔草亚科 ,苔草亚科植物都是风媒传粉[ 5 , 6] ,而且
同属苔草亚科的生长于湿地和宽广生境的苔草属植
物大部分是以远交为主的植物[ 6 , 7] 。本研究中 ,
AMOVA 数据分析表明喜马拉雅嵩草的遗传变异
主要分布于居群内 , 居群间变异占总变异的
10.94%,Gst为 0.1066 ,均低于同属的矮生嵩草(居
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中国草地学报　2009年　第 31 卷　第 3 期
群间遗传变异为 16.96%,G st 为 0.1891)[ 8] 、甘肃
嵩草(居群间遗传变异为 14.29%, Gst 为 0.1438)
与西藏嵩草(居群间遗传变异为 20%, Gst 为
0.1884)[ 9] 。因此 ,喜马拉雅嵩草的有性繁殖与以上
三种嵩草属植物一样 ,也符合风媒异交为主植物的
特点 。
就三种遗传多样性参数 PPB值 、Shannon 信息
多样性指数(I)和 Nei s 基因多样度(h)来看 ,与用
RAPD 分析的其它嵩草属植物[ 8 , 9] 相比 ,喜马拉雅
嵩草无论是在物种水平上还是在居群水平上 ,均具
有较高的遗传多样性 。喜马拉雅嵩草与矮生嵩草一
样 ,实生苗的不断补充可能是维持其遗传多样性的
主要原因之一[ 8] 。另外 ,风媒异交在一定程度上也
增加了居群内不同个体和居群间的基因交流 ,使喜
马拉雅嵩草保持较高的遗传多样性 。
3.3　遗传距离分析
基于 Nei s遗传距离结果显示 ,地理距离较近
的居群遗传相似性较大 ,这与沙伟等人[ 10] 的研究结
果相似。X1(天祝)和 X3(青海)的地理距离最近 ,
遗传一致性最高 , X2(玛曲)和 X3(青海)的地理距
离最远 ,遗传一致性最低 。由此表明 ,在较近的地理
区域内 ,种子 、花粉交流频繁 ,在一定程度上增加了
居群间的基因交流 ,结果表现为喜马拉雅嵩草在较
近距离内居群间的遗传分化相对较小。
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—39—
李巧峡　赵庆芳　　青藏高原喜马拉雅嵩草的遗传多样性研究
Genetic Diversities of Kobresia royleana in the
East-southern of Qinghai-Tibet Plateau
LI Qiao-x ia , ZHAO Qing-fang
(Collegeo f Li f e Science , Northwest Normal Universi ty ,Lanzhou 730070 ,China)
Abstract:Kobresia roy leana is the the dom inant species in the Kobresia meadow of Qinghai-Tibet
plateau.The genet ic diversity o f K .roy leana collected f rom the Qinghai-Tibet plateau in China w as inves-
tig ated based on RAPD markers.The results show ed that there w ere a compara tively high genetic diversi-
ties at the populat ion level and the species level , the percentag e of polymo rphic lo ci(PPB%)was 70.23%
and 81.82% respectively ;Nei s gene diversity (h)was 0.2446 and 0.2738 respect ively ;Shannon s info r-
mation index (I)was 0.3662 and 0.4099 respectively.AMOVA showed that most of the genetic v ariabi li ty
(89.06%)resided among individuals w i thin populations , whereas only 10.94% resided among popula-
tions.The Gst-values(0.1066)show ed the similar result.This results accorded w ith reproductive charac-
teristics o f wind-crosspo llinated plants.
Key words:Kobresia roy leana;Genet ic diversi ty;Wind-cro ss po llinat ion
—40—
中国草地学报　2009年　第 31 卷　第 3 期