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血满草 ＲAPD － PCＲ反应体系的建立与 DNA指纹图谱研究
杨青松1，熊勇1，赵艳2* ，卢志敏1，范汝艳1，3
(1. 云南民族大学 民族药资源化学国家民委 －教育部重点实验室，云南 昆明 650500;
2. 云南农业大学 基础与信息工程学院，云南 昆明 650201;3. 中国科学院昆明植物研究所，云南 昆明 650204)
摘要:目的:获得稳定性、重复性好的 ＲAPD － PCＲ反应体系，并构建血满草 DNA指纹图谱和进行遗传多样性分析。方法:以
血满草 3 个居群 11 个个体的幼叶为材料，CTAB法提取基因组 DNA，从模板浓度、引物浓度、dNTPs浓度和 Taq DNA聚合酶的用
量，构建最佳的 ＲAPD － PCＲ反应体系，通过扩增带型的差异构建其 DNA 指纹图谱，利用 Popgen32、NTSYS2 进行遗传多样性分
析。结果:3 个 ＲAPD引物扩增血满草 3 个居群 11 个样品共获得 27 条可靠、清晰和重复性高的条带，其中 17 条是多态条带。引
物 SBSA5 和 SBSA11 扩增条带组合可以构建 11 个样品的个体特异 DNA 指纹图谱。供试血满草居群间遗传距离在 0. 1493 ～
0. 2312 之间;居群内的遗传多样性分别为 0. 1102、0. 0153、0. 2294。遗传距离和相似性聚类分析表明，样品间的遗传距离与居群
的地理分布关系不明显。结论:ＲAPD分子标记在构建血满草 DNA指纹图谱是可行的，由其构建的指纹图谱可以将供试个体相
互区分鉴别出来。无论是居群间还是居群内，供试血满草的遗传多样性均较低，居群间的遗传分化较小，可能还在属于同一个大
的居群。
关键词:接骨木属;民族药;遗传多样性;聚类分析
中图分类号:Q811. 4 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2014． 05． 0111 － 4
Establishment Optimum Ｒeaction System and Construction DNA
Fringerprinting with ＲAPD for Sambucus adnata L.
YANG Qing － song1，XIONG Yong1，ZHAO Yan2* ，LU Zhi － min1，FAN Ｒu － yan1，3
(1. Key Laboratory of Ethnic Medicine Ｒesource Chemistry，State Ethnic Affairs Commission ＆ Ministry of Education，Yunnan
Minzu University，Kunming 650500，China;2. College of Basic Science and Information Engineering，Yunnan Agricultural University，
Kunming 650201，China;3. Kunming Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，Kunming 650204，China)
Abstract:Objective:To obtain stability and reproducibility ＲAPD － PCＲ reaction system，and build DNA fingerprinting and analyze ge-
netic diversity of Sambucus adnata L. Basing on ＲAPD markers. Method:Genomic DNA was extracted by CTAB from three populations，
11 individual leaves，and the optimal ＲAPD － PCＲ was constated from four factors，i. e. DNA template，primer，dNTPs and Taq DNA poly-
merase concentration. Using optimal reaction system，the DNA fingerprinting was constructed by different types and genetic diversity was
analyzed by Popgene32 and NTSYS2. Ｒesult:Three ＲAPD primers with high polymorphism and repeatability were successfully screened
out from 20 candidate primers. 27 reliable，clear and reproducible bands with 17 polymorphic ones were amplified from three populations，
11 samples using three ＲAPD primers. And individual － special DNA fringerprinting was constructed by amplified bands using primer SB-
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SA05 and SBSA11. The genetic diversity within S. adnata samples was low and genetic distance among populations was 0. 1493 － 0. 2312，
and genetic diversity within populations were 0. 1102，0. 0153，and 0. 2294，respectively. Genetic distance and similarity cluster analysis
showed that the relationship between genetic distance and geographic distribution of samples was not obvious. Conclusion:ＲAPD molecu-
lar markers to build DNA fingerprinting in S. adnata is feasible，and building its fingerprint can be distinguished from each individual iden-
tified. Whether among or within populations，genetic diversity of S. adnata samples for the test were low，and smaller genetic differentiation
was among samples，it indicated that all samples for the test may belong to the same larger populations.
Key words:Sambucus L.;Ethnic medicine;Genetic diversity;Cluster analysis
收稿日期:2014 － 06 － 11;修回日期:2014 － 07 － 08
基金项目:国家自然科学基金项目(“壳斗科栎属川滇高山栎分子谱系
地理学研究”，No． 31060031);云南民族大学民族药资源化学国家民委
－教育部共建重点实验室开放基金项目(“罗平布依族药用植物资源
的民族植物学调查”，No． MZY1301)资助
作者简介:杨青松(1980 －)，男，云南香格里拉人，博士，副教授，从事
植物分子生态学和资源植物学研究，Email:yangqskm@ 163． com;* 通
讯作者:赵艳(1982 －)，女，云南昆明人，实验师，从事生物化学研究，
Email:zhaoyankm@ 126． com。
0 引言
血满草(Sambucus adnata Wall. )是五福花科接骨木属的
多年生草本植物，又名接骨药、接骨丹等。我国接骨木属约 6
种，南北均产，是广泛使用、具有药用、食用及饲用价值的民族
植物［1］。血满草广布于我国云南、宁夏、西藏、青海、贵州、甘
肃、陕西、四川等地，生长于海拔 1 600 ～ 3 600m的山谷斜坡湿
地区、灌丛中、林下、沟边和高山草地，目前尚未由人工引种栽
培［2］。血满草在云南分布广泛，有极为丰富的自然资源，在傣
族和各民族有广泛药用历史［3］。研究发现血满草水提物及醇
提物均明显抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀，对醋酸致小鼠扭体
有明显对抗作用，具有较好抗炎镇痛作用［4］。
指纹图谱技术非常适合于品种资源(包括杂交亲本、自交
系)的鉴定工作，具有快速、准确等优点［5］。该技术已在各种
作物品种资源和纯度鉴定研究中得到应用［6］。DNA指纹图谱
是指能够鉴别生物个体之间差异的 DNA 电泳图谱，ＲAPD 技
术凭借其自身独特的优势成为这一领域的重要研究手段［7］。
马小军等［8］讨论了用毛细管 PCＲ方法扩增 ＲAPD指纹在中药
材鉴别上的应用前景，建立并优化了人参 ＲAPD 指纹的反应
体系。王培训等［9］运用 ＲAPD技术构建了不同产地的西洋参
样品的 DNA指纹图，并进行多态性分析。总之，ＲAPD技术是
中药材鉴定的有效工具，同时还表现出高度的个体特异性，是
DNA指纹图谱构建的简单、有效手段。
目前有关血满草遗传多样性的研究非常少，有关 DNA 指
纹图谱的研究也未见报道。所以本研究根据温度梯度筛选的
实验结果，对反应体系中模板浓度、引物浓度、dNTPs 浓度和
Taq DNA聚合酶的用量进行了反复多次筛选，构建效果最佳
的反应体系和退火温度。并对血满草 3 个野生居群 11 个个体
进行 DNA指纹图谱的构建和遗传多样性分析，以期为今后血
满草种质资源的种质鉴定和遗传多样性分析等提供科学
手段。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试的血满草采自云南省香格里拉县。采集血满草的嫩
叶，用变色硅胶干燥，储存备用。
表 1 样品来源
Table 1 The samples information of S. adnata
居群代码 海拔(m) 个体
Population ID Elevation(m) Individuals
Pop1 3 343 4(1 ～ 4)
Pop2 3 445 2(5，6)
Pop3 3 545 5(7 ～ 11)
1. 2 方法
1. 2. 1 总 DNA的提取与检测
采用改良的 CTAB 法提取血满草总 DNA［10］，用 0. 8%的
琼脂糖凝胶电泳进行检测，并将 DNA 浓度调整至 40ng /μl，置
于 － 20℃冰箱保存备用。
1. 2. 2 ＲAPD引物的筛选和退火温度的确定
先通过查阅文献设置获取一个初步反应体系和一个 PCＲ
反应程序［11］对 20 个引物(赛百威公司生产的 SBSA 随机引
物)进行筛选，挑选出有产物的引物。
再以筛选出的引物的理论退火温度(Tm值)为中心，使用
梯度 PCＲ仪设置 12 个温度梯度进行扩增，以确定所筛选引物
的最适退火温度。同时还可以根据引物筛选的条带多样性原
则再一次对引物进行筛选，提高效率和减少后续工作量，综合
对体系进行优化之后得出本实验反应最佳体系条件。
1. 2. 3 最佳反应体系的验证
通过 3 个居群 11 个个体的血满草资源和不同 ＲAPD引物
多次调整和验证最佳体系及其反应程序，以确定 ＲAPD 引物
扩增的稳定性。1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离扩增后的 PCＲ 产
物，电泳后照相。
1. 2. 4 数据分析
应用 Excel 软件统计 ＲAPD 引物扩增的 0、1 数据库，以
PopGene3. 2 软件中假定哈迪 －温伯格平衡条件下计算平均遗
传相似系数，用 NTSYS2 软件进行聚类分析［5］。
根据 ＲAPD引物扩增的电泳图，按每条引物扩增片段分
子量大小排列，并根据条带的有无构建血满草 DNA 指纹
图谱［5］。
2 结果与分析
2. 1 血满草 ＲAPD扩增最佳反应体系
通过引物筛选和梯度 PCＲ扩增后，在 20 个候选 ＲAPD引
物中获得 3 个引物，根据最佳反应体系获得清晰条带，且重复
性好。具体反应体系和退火温度见表 2。
3 个引物的反应条件为:94℃、5min;94℃、1min，56℃、
1min，35cycle;退火温度 2min;72℃ 5min，hold 4℃。
2. 2 ＲAPD标记多态性分析
根据所筛选的 3 个 ＲAPD引物分别对 3 个居群 11 个血满
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草样品进行扩增，共得到可靠、清晰和重复性高的条带 27 条，
其中有 17 条是多态条带，总的多态条带比率为 63. 0%，每个
引物平均多态位点数为 5. 7，3 个引物在 11 个血满草样品中得
到的平均多态条带率为 33. 3% ～ 76. 9%。
表 2 血满草 3 个候选引物最佳 ＲAPD反应体系及退火温度
Table 2 The best reaction system and Tm of three selected ＲAPD primers
for S. adnata
引物
反应体系(μl)
Primer dNTP Buffer TaqE ddH2O
最佳退火
温度(℃)
SBSA05 2 1 2 0. 8 13. 7 42
SBSA11 2 1. 5 2 0. 8 13. 2 45
SBSA19 2 1. 5 2 0. 8 13. 2 45
表 3 血满草 3 个 ＲAPD引物扩增条带多态性
Table 3 Amplified bands and polymorphic bands by three ＲAPD primers
of S. adnata
引物名称 扩增条带数 多态性条带数 多态百分率(%)
SBSA05
SBSA11
SBSA19
6
8
13
2
5
10
33. 3
62. 5
76. 9
2. 3 血满草野生居群遗传多样性
根据［0、1］矩阵用 PopGene3. 2 软件分析计算，血满草样
品居群间的遗传距离在 0. 1493 ～ 0. 2312 之间;居群 1 与居群
3 的遗传距离较小，而居群 2 与居群 3 的遗传距离较大(表
4)。
表 4 血满草居群间的 ＲAPD遗传距离(左下)与遗传相似度(右上)
Table 4 The genetic identify (above diagonal)and genetic distance (low
diagonal)of S. adnata (Nei’s)
Pop ID 1 2 3
1
2
3
＊＊＊＊
0. 2087
0. 1493
0. 8116
＊＊＊＊
0. 2312
0. 8613
0. 7936
＊＊＊＊
居群 1 内的遗传多样性指数为 0. 1102 + 0. 1952;居群 2
内的遗传多样性指数为 0. 0153 + 0. 0797;居群 3 内的遗传多
样性指数为 0. 2294 + 0. 2296(表 5)。无论居群内还是居群
间，供试血满草样品的遗传多样性均较小，表明各个居群的分
化不明显。
表 5 血满草 3 个居群内的遗传多样性
Table 5 Genetic diversity within three populations of S. adnata
Pop1 Pop2 Pop3
遗传多
样性指数
0. 1102 + 0. 1952 0. 0153 + 0. 0797 0. 2294 + 0. 2296
根据 ＲAPD标记遗传相似性建立的 11 个个体遗传关系
聚类图(图 1)表明，在相似系数为 0. 01 处，11 个血满草样品
被分为三个类群，其中第一个类群有 1、2、3、9 号四个样品;第
二个类群只有 4 号一个样品，表明它与其他样品间的亲缘关
系较远。第三个类群包括 5、6、7、8、10、11 号六个样品，分为两
个亚类。用于分析的 11 个样品中，1、2、3、4 属于 Pop1;5、6 属
于 Pop2;7、8、9、10、11 属于 Pop3，聚类分析结果显示个体间亲
缘关系与地理分布关系不大。
图 1 血满草居群个体遗传关系聚类图(NJ法)
Fig. 1 Cluster dendrogram of genetic similarity for S. adnata populations
by NJ
同样，基于遗传距离和相应的遗传相似性系数的主成份
分析也表明，个体间亲缘关系与地理分布关系不大。从主成
份分析结果直观的可以看出，样品 1、2、3 聚集在同一个区域
内，4、5、6 聚集在同一个区域内，7、9 聚集在同一个区域内，而
8、10、11 聚集在同一个区域内，说明同一区域中各自在遗传上
的相似性高，与个体地理分布没有关系。
图 2 血满草居群个体遗传关系主成分分析散点图
Fig. 2 The scatter plot of genetic similarity for S. adnata populations by
PCA
2. 4 基于 ＲAPD标记血满草 DNA指纹图谱
在筛选出来的 3 个引物中，单个引物不能构建个体特异
的指纹图谱，两个引物组合中 OPA5 和 OPA11 的组合可构建
个体特异的指纹图谱;而 3 个引物组合也能构建个体特异的
指纹图谱。基于可操作性和成本考虑，建议用 OPA5 和 OPA11
组合构建血满草 DNA指纹图谱。
3 讨论
ＲAPD分子标记技术易受多种因素的影响，大量文献报道
ＲAPD技术不稳定，结果重复性差［12］。任何一种分子标记方
法无论在理论上还是在实际研究中都有各自的优缺点，目前
还找不到一种完全能相互替代的技术［13］，ＲAPD技术也如此。
虽然有不稳定、重复性差等缺点，但在应用过程中，只要操作
人员努力摸索最优的反应条件，优化反应体系和程序设计，还
是可以得到重复性好、令人满意的结果。
运用不同 ＲAPD 引物组合扩增 DNA 来构建指纹图谱区
分鉴别血满草个体是可行的，本实验筛选出来的三个引物中，
05
2014 年 24(5) 生 物 技 术
图 3 基于 ＲAPD标记血满草 DNA指纹图谱
Fig. 3 DNA fringerprinting of S. adnata by ＲAPD markers
SBSA5 和 SBS11 的组合可构建个体特异的指纹图谱。为了简
便快捷，建议在构建血满草指纹图谱时使用 SBSA5 和 SBSA11
组合使用。在对其他物种遗传多样性分析研究中要用到指纹
图谱时，为避免盲目，可先任选两个引物组合，若选用的两个
引物不能构建指纹图谱，再依次增加引物个数。
本研究的遗传多样性分析表明，供试血满草的遗传多样
性较低，遗传距离与地理分布关系不明显，由此可推测所有样
品可能还属于同一个大居群。但由于所选的材料不多，可能
无法全面了解血满草的遗传差异。我们还需要进一步收集材
料，深入开展工作。同时，也表明血满草对不同的地理环境具
有较高适应性，从而造成不同种群和不同个体间的遗传差异
不明显。基于遗传背景，作为一种大宗的民族药，其后续引
种、开发的可行性较高。
4 结论
3个 ＲAPD引物扩增血满草 3 个居群 11 个样品共获得可
靠、清晰和重复性高的条带 27 条，其中 17 条是多态条带。遗
传多样性分析表明供试血满草居群间遗传距离在 0. 1493 ～
0. 2312 之间;居群内的遗传多样性分别为 0. 1102 ～ 0. 2294。
居群间和居群内遗传多样性均较低，遗传距离与居群的地理
分布关系不明显，可能还在属于同一个大的居群。引物 SB-
SA5 和 SBSA11 扩增条带组合可以构建 11 个样品的个体特异
DNA指纹图谱，ＲAPD 分子标记在构建血满草 DNA 指纹图谱
是可行的，由其构建的指纹图谱可以将供试个体相互区分鉴
别出来。
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白粉病胁迫下甜瓜叶片 Hsp70 差异表达分析
巴雪丽，刘婷婷，钟俐*
(新疆大学 生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046)
摘要:目的:研究甜瓜叶片 Hsp70 基因在白粉病胁迫下的表达差异。方法:采用对白粉病抗性不同的 2 个甜瓜品种，Trizol法
提取叶片总 ＲNA，PCＲ技术克隆 Hsp70 基因核心片段，采用 Semi － Q － ＲT － PCＲ技术，以 Actin基因为内参基因，对白粉病胁迫下
不同处理、不同品种的甜瓜叶片 Hsp70 基因的表达进行差异分析。结果:抗病品种 MＲ － 1 与感病品种伽师瓜叶片中的 Hsp70 基
因表达量均随着接种时间的延长逐渐减少，但 MＲ －1 接种白粉病 1d 后表达量稍有增加;且伽师瓜中 Hsp70 基因的表达差异较
MＲ －1 明显。结论:两种甜瓜叶片感染白粉病后，Hsp70 表达量均减少。
关键词:白粉病;甜瓜;Hsp70;基因克隆;差异表达分析
中图分类号:S652 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2014． 05． 0112 － 4
Expression Analysis of Hsp70 Gene from the Leaves of
the Muskmelon under the Powdery Mildew Stress
BA Xue － li，LIU Ting － ting，ZHONG Li*
(College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China)
Abstract:Objective:The expression of Hsp70 gene under the powdery was studied. Method:The intact seedlings of susceptible varieties
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