全 文 ：收稿日期:2008-06-12
作者简介:谢莉 ,女(1981-),在读硕士 ,主要从事分子遗传学研究 ,
E-mail:guilinxieli@163.com
基金项目:广西自然科学基金(桂科基 0448045)资助
栽培高粱 、甜高粱和拟高粱比较基因组原位杂交分析
谢　莉 1, 2 ,曾艳华1 , 韩永华 1, 3＊
(1广西师范大学生命科学学院 ,桂林 541004 ;2广西柳州市妇幼保健院 柳州 545001;
3中国农业大学国家玉米改良中心 ,北京 100094)
摘要:用一种植物的总基因组 DNA与近缘或远缘物种的染色体杂交 ,可以研究植物近缘或远缘物种基因组进化关系 。以
拟高粱总基因组 DNA为探针 ,对栽培高粱 、甜高粱基因组进行杂交 ,结果表明栽培高粱 、甜高粱和拟高粱基因组中重复序列存
在很大的同源性 , 基因组进化关系表现出保守性。栽培高粱与拟高粱基因组间重复序列的同源性要比甜高粱与拟高粱间重
复序列的同源性高。
关键词:栽培高粱;甜高粱;拟高粱;比较基因组原位杂交
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1006-8376(2008)03-0070-04
　　在育种实践中 ,将作物与其近缘种杂交 ,然后通
过不断回交 ,可以使含有优良基因的野生近缘种的
染色体片段渗入作物 ,或通过基因工程方法将野生
近缘种的优质基因导入栽培种 [ 1] ,培育出高产 、优
质 、抗逆性和抗病虫害能力强的稳定纯系 ,一直是遗
传育种专家感兴趣的问题 。对染色体进行鉴定是改
良和利用这些异源基因的基础。形态标记 、细胞学
标记和生化标记通常被用于异源染色体的鉴别 ,基
因组荧光原位杂交 (genomicinsituhybridizaton,
GISH)与以上方法相比 ,具有更准确 、直观的优点 。
GISH技术可以用于分析种间杂种异源附加系 、易位
系 、间期核中不同基因组 、异源染色体或染色体片段
的分布 ,研究基因组和染色体间期核的组织模式及
在有丝分裂和减数分裂细胞周期的行为 [ 2 ～ 4] ,可鉴
别植物种间和属间杂种(包括体细胞杂种)的染色
体来源 、变异等 。已有的报道表明 ,通过运用 GISH
和随后的 FISH可鉴定麦类作物小片段易位系 ,确
定易位片段位置 、来源以及观察减数分裂染色体行
为等[ 5 ～ 8] 。
比较基因组原位杂交(comparativegenomicin
situhybridization, cGISH)是一种新的基因组原位杂
交分子显带方法 ,在没有封阻情况下 ,用一种植物的
总基因组 DNA与近缘或远缘物种的染色体杂交 ,
其杂交信号检出程序是专门用于检出重复 DNA顺
序的 ,因此可以直观地显示不同物种间共享的重
复序列在染色体上的分布[ 9] 。 cGISH最初用于植
物中检测杂交后代是否存在或渗入了原物种的基
因组 DNA,后来逐渐成为一种基因组进化分析的
新手段 。不同种间的比较基因组杂交在物种进化
和亲缘关系的研究上有重要作用 [ 10, 11] , 是研究不
同种基因组间重复序列的变异性和保守性的一种
简便方法 。
甚至可以用一种植物的总基因组 DNA与广泛
的远缘物种杂交 ,进行大范围的植物基因组比较分
析[ 12] 。如:Juta等[ 9]以拟南芥总基因组 DNA为探
针 ,对 10个其他物种的染色体进行比较基因组原位
杂交 ,检测到种间保守的重复 DNA序列的杂交信
号 ,信号的分布特点在不同种或不同染色体上是不
同的 。
禾本科(Gramineae)高粱属(Sorghum)植物中的
大多数种类为抗旱作物 ,在世界各干旱地区有广泛
的种植 ,作为粮食 、饲料 、工业原料等具有很高的经
济价值。栽培高粱(S.bicolor)、甜高粱 (S.dochna
)、拟高粱(S.propinquum)均为高粱属植物 ,染色体
数均为 2n=20。栽培高粱是古老的谷类作物之一 ,
它具有抗旱 、耐涝 、耐盐碱 、适应性强的优点 ,所以在
现代的农业生产上一直占有重要的地位 。甜高粱是
栽培高粱的一个变种 ,因其含糖量高而得名。拟高
粱是一种野生种质资源 ,对高粱品种的改良具有重
要意义。已有的研究表明 ,栽培高粱与甜高粱亲缘
关系较近 ,但它们与拟高粱亲缘关系较远 [ 13] 。本研
究中 ,我们以拟高粱总基因组 DNA为探针 ,对栽培
高粱 、甜高粱染色体上进行定位 ,以比较拟高粱与栽
培高粱 、甜高粱之间的基因组关系 。
1　材料和方法
氨基酸和生物资源　2008, 30(3):70～ 73
AminoAcids＆BioticResources
DOI :10.14188/j .ajsh.2008.03.015
1.1　植物材料和染色体制片
供试材料栽培高粱(S.bicolor, 2n=20)、甜高
粱(S.dochna, 2n=20 )、拟高粱(S.propinquum, 2n
=20),均由广西畜牧研究所李冬郁提供。
染色体制片参照 Song等 [ 14] 的方法并略做修
改 。
1.2　基因组 DNA提取及标记
拟高粱总基因组 DNA提取采用 CTAB法提
取 [ 15] 。用抢头反复吹打将 DNA打断为 10kb左右 ,
用切口平移法对打断的 DNA进行标记 ,适当增加
DnaseI的比例并延长标记时间至 4 h, 0.5 mol· L-1
Na2EDTA终止反应 ,点印迹检测效果 (华美生物公
司)。
1.3　原位杂交及信号检出
参照 Guatafaon等[ 16]方法并略作修改 。
1.3.1原位杂交
(1)染色体制片在 60 ℃烘片 30min。
(2)RNaseA(10 mg· L-1 ,用 2×SSC稀释)在
37℃处理 1h。
(3)2×SSC, 75℃下处理 5 min。
(4)70%甲酰胺 75℃处理 3.5min。
(5)于 -20℃体积分数 70%、95%、100%乙醇
中各处理 5min。
(6)置室温下约 20 min,使染色体制片完全干
燥 。
(7)沸水中变性杂交液(杂交液中含质量分数
50%去离子甲酰胺 , 8%硫酸葡萄糖 , 鲑精 DNA2
μg, 10%20×SSC, 0.1%SDS)10 min,迅速置冰上 5
min以上 。
(8)加入 40 μL杂交液至染色体制片上 ,盖 24
mm×50 mm的盖玻片 , 90 ℃共变性 8 ～ 10 min,在
37 ℃保湿皿中温育 16 ～ 24 h。
1.3.2荧光信号检测
1.3.2.1杂交后的片子依次在 42℃2×SSC溶液 、0.1
×SSC溶液中各漂洗 15min;0.1% TritonX-100室
温下处理 5min;1×PBS溶液室温下处理 5min。
1.3.2.2每张制片加 100 μL链亲和素 -CY3(strep-
tavidin-Cy3)(1g· L-1链亲和素 -CY3 0.4 μL用
1%BSA/PBS稀释成 50 μL)或抗地高辛 -FITC(an-
ti-digoxigenin-FITC)3 μL200 mg· L-1抗地高辛
的抗体 -FITC用 1%BSA/PBS稀释成 50μL)37℃
温育 1 h。 1×PBS溶液室温下振荡处理 3次 ,每次
5 min。
1.3.2.3 每张制片加 40 μL含 20%抗瘁灭剂
(Vectashield)的 DAPI(46-diamidino-2-pheny-
lindole)复染(1mg· L-1DAPI溶于含 20%抗猝灭
剂的 1×PBS中;盖 24 mm×50 mm的盖玻片。
1.3.2.4制片在 OlympusBX51荧光显微镜下 , 红
色 、绿色 、蓝色荧光分别用 G、B、UV滤光观察 ,利用
DP70成像系统和 DPControler、DPManager软件合成
照片 。Photoshop软件进行图片处理。
2　结果
以生物素标记的拟高粱总基因组 DNA对自身
有丝分裂中期染色体杂交时 ,每条染色体大部分
被涂染 ,显示很强的杂交信号 ,少部分显示较弱的
杂交信号(图 1:c)。这一结果表明 ,拟高粱基因组
中重复顺序占很大比重。荧光原位杂交的信号与
DAPI染色带型比较发现 ,在 DAPI荧光亮度较大
的着丝粒和近着丝粒区域荧光原位杂交的信号较
强 ,而在 DAPI浅染的常染色质区杂交信号相对较
弱(图 1:a、b)。与栽培高粱基因组杂交显示杂交
信号集中分布在被 DAPI深染的着丝粒附近 ,而染
色体臂远端无散在分布的信号 ,表明两个品种间
在染色体臂远端部分重复序列的同源性很低 (图
1:d、e、f)。与甜高粱基因组杂交时 ,从杂交信号分
布看 ,信号的强弱分布不连续 ,某些染色体的着丝粒
区 、长臂内 、短臂中部显示较弱的杂交信号 ,而在某
些染色体的着丝粒区 、长臂中部或远端 、短臂内显示
增强的信号 ,但信号强度要比拟高粱总基因组 DNA
对自身和栽培高粱染色体杂交时相对弱些(图 1:g、
h、i)。
3　讨论
为了研究物种基因组之间的同源性 ,人们主要
利用 RFLP、RAPD等各种分子标记进行基因组间的
比较遗传作图 ,来揭示物种间染色体或染色体片段
上基因的同线性 (synteny)或共线性(colinearity)的
存在 [ 17, 18] 。然而 ,这一技术仅仅是用一部分标记来
探测整个基因组的关系 ,难免有一定的局限性 ,不
能全面地反映基因组之间的关系 ,特别是不能反
应它们重复 DNA的特点 。在真核生物基因组中重
复序列占有很大比例 ,它们比编码序列更容易发
生变异 ,物种间重复序列的同源程度可以反应它
们亲缘关系的远近。许多重复序列在近缘种甚至
不同属间是共享的 ,但在不同基因组中分布模式
是不同的 ,而有些重复序列是基因组甚至染色体
特异的 [ 19, 20] 。
·71·谢　莉等:　栽培高粱 、甜高粱和拟高粱比较基因组原位杂交分析
图 1　拟高粱基因组 DNA与自身 、栽培高粱 、甜高粱有丝分裂染色体杂交
a-c:拟高粱自身基因组杂交 , d-f::拟高粱基因组 DAN与栽培高粱杂交 , g-i:拟高粱基因组DNA与甜高粱杂交 ,
a、d、g:DAPI染色的染色体 b、e、h:杂交信号 , c、f、i:染色体和杂交信号的合成图
　　比较基因组原位杂交可以直观地显示该物种及
不同物种间共享的重复序列在染色体上的分布 ,它
是研究不同种基因组间重复序列的变异性和保守性
的一种简便方法 。本研究以拟高粱总基因组 DNA
为探针 ,对栽培高粱 、甜高粱基因组进行杂交 ,结果
表明栽培高粱 、甜高粱和拟高粱基因组中重复序列
存在很大的同源性 ,基因组进化关系表现出保守性 。
甜高粱与拟高粱基因组间重复序列的同源性要比栽
培高粱与拟高粱间重复序列的同源性低些 。
应用比较基因组原位杂交技术研究物种间重复
序列的关系具有如下的优越性:第一 ,它可直观地展
示物种间重复基因组 DNA的同源性及其在染色体
上的分布特征;第二 ,杂交信号的分布与 DAPI染色
结果相比较 ,可以划分出重复 DNA中保守的和易变
的部分;第三 ,比较基因组原位杂交技术很稳定 ,且
易于操作 ,重复性高。
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StudyonComparativeGenomicinsituHybridizationofS.bicolor,
S.dochnaandS.propinquum
XIELi1 , ZENGYan-hua1 , HANYong-hua1, 2
(1ColegeofLifeScience, GuangxiNormalUniversity, Guilin541004;
2NationalCenterofCornImprovement, AgriculturalUniversityofChina, Beijing100094, China)
Abstract:Thecomparativeanalysisofgenomicevolutionbetweencloselyordistantlyrelatedspecieshasbeen
analyzedbyagenomicDNAcross-hybridizedwithotherspecies.S.propinquumgenomicDNAwasusedasa
probecros-hybridizedwithS.bicolorandS.dochna.Theresultsrevealedhighlyhomologousinrepeatsequence
andconservedgenomeevolution.S.propinquumgenomecross-hybridizedwithS.bicolorgenomeshowedhigher
homologousinrepeatsequencethanS.propinquumwithS.dochna.
Keywords:S.bicolor;S.dochna;S.propinquum;comparativegenomicinsituhybridization
·73·谢　莉等:　栽培高粱 、甜高粱和拟高粱比较基因组原位杂交分析