全 文 ：HEREDITAS (Beijing) 2009年 4月, 31(4): 420―425
ISSN 0253-9772 www.chinagene.cn 研究报告

收稿日期: 2008−08−06; 修回日期: 2008−09−10
基金项目: 广西自然科学基金资助项目(编号：桂科基 0448045)资助
作者简介: 谢莉(1981−), 女, 硕士, 研究方向：分子遗传学。Tel: 0772-2819293; E-mail: guilinxieli@163.com
通讯作者: 韩永华(1971−), 女, 博士, 副教授, 研究方向：分子遗传学。Tel: 0773-5833710; E-mail: hanyh329@163.com
DOI: 10.3724/SP.J.1005.2009.00420
FISH分析栽培高粱×拟高粱、甜高粱×拟高粱的染色
体行为
谢莉 1, 2 , 韩永华 1, 3，李冬郁 4，曾艳华 1
1. 广西师范大学生命科学学院, 桂林 541004 ;
2. 广西柳州市妇幼保健院, 柳州 545001;
3. 中国农业大学国家玉米改良中心, 北京 100193;
4. 广西畜牧研究所, 南宁 530001
摘要: 采用荧光原位杂交技术对 45S rDNA在栽培高粱×拟高粱、甜高粱×拟高粱 F1的有丝分裂和减数分裂染
色体进行定位研究。在有丝分裂中期染色体上 2个杂种分别检测到 2个杂交信号, 在减数分裂粗线期、终变期、
中期Ⅰ染色体上 45S rDNA位于一个二价体上, 说明这两个杂种携带 45S rDNA的染色体为同源染色体。根据
45S rDNA 位点随细胞减数分裂过程的位置变化 , 表明这两个杂种染色体配对行为正常 , 平均构型为
2n=2x=20(10Ⅱ), 证明 45S rDNA 可作为染色体的一个识别指标间接地观察细胞减数分裂过程染色体的变化
行为。
关键词: 栽培高粱; 甜高粱; 拟高粱; 45S rDNA; 荧光原位杂交
Analysis of the chromosomes of S. bicolor × S. propinquum and
S. dochna × S. propinquum by FISH
XIE Li1, 2, HAN Yong-Hua1, 3, LI Dong-Yu4, ZENG Yan-Hua1
1. College of Life Science, Guangxi Normal University, Guilin 541004, China;
2. Maternal and Children’s Health Care Hospital of Liuzhou City, Liuzhou 545001, China;
3. National Center of Corn Improvement, Agricultural University of China, Beijing 100193, China;
4.Guangxi Live Stock Institute, Nanning 530001, China
Abstract: By means of fluorescence in situ hybridization (FISH), we located and analyzed the sites of the 45S rDNA on
the F1 hybrids of S. bicolor × S. propinquum and S. dochna×S.propinquum. Two signals of 45S rDNA were mapped on the
mitotic metaphase chromosomes in the F1 hybrids, respectively, and one signal was present on a bivalent during meiotic of
synaptene, diakinesis, and metaphase I. We inferred that the two mitotic chromosomes carrying 45S rDNA were homolo-
gous pairs. Considering the signals of 45S rDNA location during meiotic process, chromosome pairing of these two F1 hy-
brids was normal with an average pairing configuration of 2n=2x=20 (10 II). Our results indicated that 45S rDNA could
provide a landmark for identification of individual chromosome during meiosis indirectly.
Keywords: S.bicolor; S. dochna; S. propinquum; 45S rDNA; fluorescence in situ hybridization

第 4期 谢莉等: FISH分析栽培高粱×拟高粱、甜高粱×拟高粱的染色体行为 421


栽 培 高 粱 属 于 禾 本 科 (Gramineae)高 粱 属
(Sorghum)植物 , 是世界种植的第五大禾谷类作物 ,
还是重要的饲料植物和酿造业原料, 而且, 抗旱、耐
盐碱和瘠薄土壤。de Wet和 Huckabay[1]把高粱属分
为 5个亚属, 即 Chaeotosorghum、Heterosorghum、
Parasorghum、Stiposorghum 和 Sorghum。高粱亚属
(Section sorghum)又分为 3个种, 即 S. halepense (L.)
Pers. (2n=40)、 S. propinquum (Kunth) Hitchcock
(2n=20), S. bicolor (L.) Moench (2n=20)。S. propin-
quum为野生种, 中文名为拟高粱。S .bicolor 为栽培
种的高粱。甜高粱(S. dochna)(2n=20)是栽培高粱(S.
bicolor)(2n=20)的一个变种, 因其含糖量高而得名。
拟高粱作为野生种质资源对高粱品种的改良具有重
要意义, 它与栽培高粱(S. bicolor)、甜高粱(S. dochna)
染色体数均为 2n=20, 它们之间杂交不存在遗传障
碍。所以, 对栽培高粱×拟高粱、甜高粱×拟高粱
F1 减数分裂过程染色体形态、配对行为的观察, 可
为遗传学研究的可杂交性、杂种分析、染色体工程
的研究等提供依据。
串联重复序列在植物基因组遗传研究中占据重
要地位, rDNA 是高度重复的序列, 通常以几百乃
至几千个拷贝成簇分布在染色体上[2], 45S rDNA是
位于核仁组织区上的串联重复序列, 每个重复单位
依次编码 18S、5.8S、25S rRNA[3]。荧光原位杂交
(Fluorescence in situ hybridization, FISH)技术是目前
用于基因定位的最有效方法之一, 而减数分裂研究
不仅直接标示出减数分裂不同构型染色体的性质、
来源, 而且还使减数分裂染色体构型图像更清晰、
立体感强[4]。本研究采用 FISH技术将 45S rDNA在
栽培高粱×拟高粱、甜高粱×拟高粱 F1(2n=20)的有
丝分裂染色体(根尖细胞染色体)和减数分裂染色体
(花粉母细胞染色体)上进行定位, 追踪其随花粉母
细胞减数分裂的行径, 并为研究这两个杂种的染色
体行为提供依据。
1 材料和方法
1.1 材料
实验用栽培高粱×拟高粱、甜高粱×拟高粱 F1
实验材料由广西畜牧研究所李冬郁提供。
1.2 方法
1.2.1 染色体片的制备
根尖用 0.002 mol/L 8-羟基喹啉于 28℃处理 3 h,
水洗 3次, 0.075 mol/L KCl低渗处理 30 min, 固定液
(甲醇: 冰醋酸＝3: 1)固定, 4℃保存, 备用。花药幼穗
用固定液(甲醇: 冰醋酸＝3: 1)在 4℃下固定 12~24 h
后转移到 70%的乙醇中保存。
有丝分裂染色体制片方法参照 Song 等[5]的方
法。取根尖, 水洗净后用 2%纤维素酶和 2%果胶酶
按 1:1混合, 于 28℃酶解 2.5~3 h, 吸去酶液, 水洗 3
次, 去壁低渗火焰干燥法制片。减数分裂染色体制
片: 取花药, 水洗净后用 2%纤维素酶和 2%果胶酶
按 1:1混合, 于 28℃酶解 3~3.5 h, 加固定液制成单
细胞悬液, 离心, 洗涤, 滴片法制片。
1.2.2 探针标记
45S rDNA 被克隆在 pUC18 载体中 , 由美国
Nebraska 大学的 Arumuganathan 教授提供, 用生物
素-11-dUTP 或地高辛-11-dUTP 以缺刻平移法进行
标记(华美生物工程公司)。
1.2.3 原位杂交与信号检测
参照韩永华等[3]方法, 染色体制片在 60℃ 烘片
30 min。RNaseA(10 µg/mL, 用 2×SSC 稀释)在 37℃
处理 1 h, 2×SSC, 75℃下处理 5 min, 70% 甲酰胺
75℃处理 3.5 min。于−20℃ 70%、95%、100% 乙
醇中各处理 5 min。加入 40 µL 杂交液至染色体制
片上, 盖 24 mm×50 mm 的盖玻片, 90℃共变性 8～
10 min, 在 37℃保湿皿中温育 16～24 h。荧光信号
检出程序包括以下步骤: 杂交后的片子依次在 2×
SSC 溶液、0.1× SSC 溶液中各漂洗 15 min; 0.1%
TritonX-100 室温下处理 5 min; 1×PBS 溶液室温
下处理 5 min; 亲和素-CY3(Vector Laboraries)或抗
地高辛的抗体－FITC(Vector Laboraries)37℃温育 1 h;
1×PBS 溶液室温下振荡处理 3次, 每次 5 min; 每张
制片加 40 µL 含 20%抗猝灭剂(Vectashield, Vector
Laboraries)的 DAPI (4’6-diamidino-2-phenylindole)复
染(1 µg/mL DAPI 溶于含 20%抗猝灭剂的 1×PBS
中); 盖 24 mm×50 mm 的盖玻片; 制片在 Olympus
BX51荧光显微镜下, 红色、绿色、蓝色荧光分别用

422 HEREDITAS (Beijing) 2009 第 31卷


G、B、UV 滤光片观察 , 利用 DP70 成像系统和
DPController、DPManager软件合成照片。Photoshop
软件进行图片处理。
2 结果与分析
本研究中, 染色体用 DAPI复染, 经 UV激发在
荧光显微镜下呈现蓝色荧光, 染色体形态完好、构
型清晰。用生物素-11-dUTP标记的 45S rDNA, 经亲
和素-CY3检测后呈现红色荧光, 与染色体背景的蓝
色组合形成紫红色荧光。用地高辛-11-dUTP标记的
45S rDNA, 经抗地高辛的抗体-FITC 检测后呈现绿
色荧光 , 与染色体背景的蓝色组合形成淡蓝绿色
荧光。
在有丝分裂中期染色体中, FISH 检测的结果为
栽培高粱和甜高粱有丝分裂中期染色体检测到 2 个
杂交信号, 分别位于 2条最长的染色体上(图 1, A、
C); DAPI 复染的结果显示该区域着色较浅, 为第 1
号染色体次缢痕的位置(图 1, B、D)。栽培高粱×拟
高粱杂种 F1中期染色体检测到 2个很长的杂交信号,
被拉成细丝状, 分别位于 2 条最长的染色体上(图
1E), 而其他染色体已浓缩变短, 这一结果表明 45S
rDNA 在染色质变化周期中浓缩速度较慢, 我们在
各个亲本染色体中也观察到此现象 (文章待发表 );
DAPI 染色结果显示该信号位点是次缢痕的位置(图
1F)。在甜高粱×拟高粱杂种 F1的中期染色体中也检
测到 2个杂交信号, 分别位于 2 条最长的染色体上,
杂交信号的强度略有不同(图 1G), DAPI 染色结果
显示该信号位点为次缢痕的位置 , 且靠近着丝粒
(图 1H)。
在减数分裂染色体中, 栽培高粱×拟高粱粗线
期检测到 1个杂交信号, 位于 1个二价体上(图 2A),
终变期二价体浓缩形成“八”字形、“O”形、棒形
等, 染色体数目清晰可计, 平均构型为 2n=2x=20(10
Ⅱ), 杂交信号位于 1 个二价体上(图 2B); 中期Ⅰ
DAPI 染色显示的 10个二价体分散排列在赤道板上,
染色体的蓝色荧光信号很强, 杂交信号稳定地存在
于一个二价体臂内靠近着丝粒的地方(图 2C); 后期
二价体中的两条同源染色体分开 , 分别移向两极 ,
每极各有 10条染色体, 杂交信号也随着染色体分别
移向两极(图 2D)。甜高粱×拟高粱的信号位点与以
上结果相同, 粗线期同源染色体配对形成 10个二价
体, 杂交信号位于其中 1 个二价体中部靠近着丝粒
的地方(图 2E); 终变期二价体浓缩形成“X”形, 平
均构型为 2n=2x=20(10Ⅱ), 杂交信号位于 1 个二价
体上(图 2F); 中期Ⅰ10 个二价体排列在赤道板上,
45S rDNA清晰地定位在 1 个二价体臂内(图 2G)。
后期Ⅰ同源染色体分开, 未发现滞后染色体的异常
现象, 染色质也被 DAPI 染成蓝色, 分布均匀, 45S
rDNA分别定位在两极的两条染色体臂内(图 2H)。
上述研究结果表明这 2 个杂种减数分裂染色体
配对行为正常, 说明在有丝分裂中携带 45S rDNA
的染色体为同源染色体。
3 讨 论
rRNA 基因成簇分布在染色体的部位称 rDNA
位点 , 45S rDNA 通常参与核仁的形成, 故常常将
45S rDNA位点称为核仁组织区(NOR), 这一功能片
段在有丝分裂细胞中多定位在随体染色体上或次缢
痕中[6, 7], 也有些研究发现 45S rDNA定位在着丝粒
至短臂的区域或染色体长臂末端的局域, 甚至出现
杂交信号数目成奇数的情况[8]。Islam-Faridi 等[9]利
用 BAC-FISH技术也证实栽培高粱 NOR区位于第 1
号染色体上, 是个巨大的异染色质区。值得一提的
是, Kim 等[10]发现第 1 号染色体长度在有丝分裂过
程中是变化的, 因为 NOR的重组在细胞增殖周期进
程较慢, 有时候观察到 NOR 覆盖整条染色体短臂,
甚至延长至长臂的位置。由于对染色质结构重组引
起 NOR结构变化缺乏研究, 只有结合对杂交种减数
分裂染色体的研究才能进一步确定同属种质 NOR
区的位置关系。我们用杂种研究的结果证实栽培高
粱、甜高粱、拟高粱 NOR区都位于第 1号染色体次
缢痕上。
观察植物花粉母细胞减数分裂过程染色体配对
行为在研究种属间亲缘关系、可育性、可杂交性、
多倍体类型等方面起着重要作用。赵晓杰等[11]在研
究雄性不育系高粱 314A、13A 与 3 种苏丹草
(S.sudanense)(2n=20)杂交组合 F1代细胞遗传学等特
性时, 发现所有 F1代染色体均能正常配对。钟小仙
等[12]利用苏丹草与拟高粱杂交, 杂种 F1代花粉母细
胞减数分裂中期染色体配对正常。Magoon 等[13]对

第 4期 谢莉等: FISH分析栽培高粱×拟高粱、甜高粱×拟高粱的染色体行为 423




图 1 45S rDNA 在栽培高粱、甜高粱、栽培高粱×拟高粱、甜高粱×拟高粱有丝分裂染色体中的定位
A: 45S rDNA在栽培高粱中的定位; B:被 DAPI染色的栽培高粱染色体灰度图(→: 信号的位置, 以下同); C: 45S rDNA在甜高粱中的定位; D:
被 DAPI染色的甜高粱染色体灰度图; E: 45S rDNA在栽培高粱×拟高粱中的定位; F: 被 DAPI染色的栽培高粱×拟高粱染色体灰度图; G: 45S
rDNA在甜高粱×拟高粱中的定位; H: 被 DAPI染色的甜高粱×拟高粱染色体灰度图。

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图 2 45S rDNA 在栽培高粱×拟高粱、甜高粱×拟高粱减数分裂染色体中的定位
A~D: 45S rDNA在栽培高粱×拟高粱减数分裂粗线期、终变期、中期Ⅰ、后期Ⅰ染色体中的定位(: →杂交信号。以下同); E~H: 45S rDNA在
甜高粱×拟高粱减数分裂粗线期、终变期、中期Ⅰ、后期Ⅰ染色体中的定位。

10 个优高粱(Eu-sorghum)杂交种的 F1的粗线期
染色体研究发现杂种有的染色体配对行为正常, 后
代可育, 有的却不育; 染色体配对行为不正常的后
代中有的可育, 有部分不育, 并筛选出优良的杂种
后代。这些研究表明具有相同染色体数目的高粱属
植物通过种间杂交可获得良好杂交后代。野生高粱
作为一种种质资源对高粱的改良具有重要意义, 因
此对栽培高粱×拟高粱、甜高粱×拟高粱杂交后代

第 4期 谢莉等: FISH分析栽培高粱×拟高粱、甜高粱×拟高粱的染色体行为 425


遗传学研究非常有意义。我们用 DAPI 染色观察的
两个杂种 F1染色体配对行为, 发现终变期、中期Ⅰ
染色体为 10个二价体, 平均构型为 2n=2x=20(10Ⅱ),
未观察到单价体、多价体异常现象, 减数分裂过程
正常, 说明亲本染色体同源性较高, 杂种 F1 可望获
得优良性状。这为选育优良株系提供有用资料。
以 DNA 特异序列为细胞学标记的探针, 追踪
杂种后代染色体行为方面的文章已有较多报
道[14, 15]。唐祈林等[4]采用多色基因组荧光原位杂交
(Mc-GISH)技术分析玉米×四倍体多年生玉米杂种
F1 不同的染色体构型, 确定了不同构型染色体的来
源。采用 FISH技术, 我们获得了 45S rDNA序列随
细胞减数分裂过程变化的行径, 粗线期、终变期、
中期Ⅰ都位于一对二价体上, 后期Ⅰ平均分配到细
胞两极, 该技术达到类似同位素示踪的效果 [16], 且
克服了同位素的放射性污染、需要特殊防护措施及
设备等的缺点。本研究从分子水平上证明这两个杂
种减数分裂过程是正常的。
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