全 文 ：文章编号:1007-2624(2008)03-0004-03
斑茅抗旱全长cDNA文库的构建
刘孝开，张木清
(福建农林大学农业部甘蔗生理生态与遗传改良重点实验室,福州 350002)
摘 要:以干旱处理后的甘蔗近缘属植物斑茅为材料,采用 SMARTTM方法,合成并富集 dscDNAs,然后通过电泳时
分段切胶以分离不同大小片段并分别与载体连接和转化,构建了斑茅的抗旱全长 cDNA文库,为进一步研究和利用
斑茅中的抗旱基因奠定了基础。
关键词:甘蔗;斑茅;全长cDNA;SMART;干旱胁迫
中图分类号:S566.1;Q78 文献标识码:A
水资源短缺、干旱是长期存在的世界性难题。甘蔗是我国乃至全世界最重要的糖料作物,选育抗旱性
强、水分利用率高的品种是提高其水分效率的最经济有效的措施之一。世界甘蔗育种的发展趋势是通过扩
大开发甘蔗种质及其近缘属植物的利用来提高糖料甘蔗的产量、糖分和生活力,并加速实施再生能源甘蔗
育种计划。斑茅[Erianthusarundinaceus(Retz.)Jeswiet]是甘蔗近缘属植物之一,种内变异丰富,高大粗壮、生
长直立,抗旱耐瘠抗病虫性强、宿根性好、分蘖多、生长快,有较强的生态竞争能力、适应性广等优良性状[1]。
因此,从斑茅中获得抗旱等优良基因对于高产高糖甘蔗品种的培育有重要的意义。因此,预先构建出斑茅在
干旱胁迫下的全长cDNA文库就不失为一条途径。本文就从干旱胁迫处理的斑茅,利用SMART[2]方法构建
了其全长cDNA文库,为进一步开发利用斑茅中的优良基因奠定了基础。
1 材料
1.1 植物材料
选取甘蔗近缘属植物斑茅,种植于盆中,以营养液正常培养。待株高约1m时,移植于塑料盆中,先以完
全营养液培养3d,以作适应。然后用含PEG(40%)的营养液处理,并记录时间。取处理12h和24h的植物叶片
用液氮速冻,保存于-84℃冰箱备用。
1.2 主要试剂
Trizol试 剂 (Invitrogen),DEPC (BBI),RNaseInhibitor(TaKaRa),OligotexmRNASpin-columnkit
(QIAGEN),SMARTPCRcDNASynthesisKit (Clontech),Advantage2PCRKit (Clontech),QIAEXIGel
ExtractionKit(QIAGEN),DNAFragmentPurificationKitver2.0(TaKaRa),BtypePlasmidIsolationKit(博大泰
克),pMD-18TVector(TaKaRa),IPTG(BBI),X-Gal(BBI)等,其它常规的分子生物学试剂购自上海生工、厦门泰
京及大连宝生物等公司。
2 方法
2.1 总RNA的提取和mRNA的纯化
用Trizol提取斑茅叶片总RNA,过程按试剂说明书进行;用 Qiagen公司的 OligotexmRNASpin-column
kit提取mRNA。提取的RNA用甲醛凝胶电泳/EB染色检测其质量,并用紫外分光光度计测其浓度和纯度。
2.2 全长cDNA第一链的合成
取 1.0!g斑 茅 叶 片 mRNA作 为 合 成 cDNA第 一 链 的 模 板 , 在 CDSI/3PCR引 物 (5-
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT(30)VN-3,N=A、G、CorT;V=A、GorC)和 SMARTITM寡核苷酸引物
(5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3)的引导下,通过PowerscriptI逆转录酶逆转录合成第一
链cDNA,42℃温浴90min,然后72℃,温浴15min,置于冰上待用或放-20℃保存(最长3个月),即为sscDNA。
2.3 全长cDNA第二链的合成
以 2!L第一链 cDNA产物为模板,用 LD-PCR引物 (5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3),在
EppendorfMaterCyclerPCR仪上用 LD-PCR(Long-DistancePolymeraseChainReaction)合成并扩增第二链
cDNA。PCR反应条件为:95℃1min;95℃30s,65℃30s,68℃6min,18个循环;4℃终止反应(为保证合成的二
收稿日期:2007-09-28
基金项目:国家自然科学基金(30370901)。
作者简介:刘孝开(1979-),男,山东省成武县人。福建农林大学在读硕士生,研究方向:植物遗传学。
中 国 糖 料
SugarCropsofChina
2008年
第3期4
刘孝开,等:斑茅抗旱全长cDNA文库的构建
链cDNA足够用于后续实验,可进行2个反应的LD-PCR),即可得到dscDNA。扩增后,取适量PCR产物在
1.1%的琼脂糖电泳上检测cDNA第二链合成效果。
2.4 分段切取dscDNA片段
将得到的 dscDNA进行低电压(90V)电泳,以 1kbMarker(NEB)做对照,将分离的 dscDNA分成 0.7～
2kb、>2kb两部分,按照Qiagen琼脂糖凝胶回收试剂盒分别回收,用紫外分光光度计测定浓度。
2.5 与T-Vector连接和转化
将得到的大于 0.7kb而又小于 2kb的 dscDNA及大于 2kb的 dscDNA分别以 6∶1和 10∶1的摩尔比与
pMD-18TVector进行连接,将连接产物用热击转化法转入大肠杆菌DH5α超级感受态细胞,将转化产物接
种到 890LLB培养基中,于摇床上(37℃,180r/min)培养 1h,然后混合涂布在 LB/Amp+IPTG+X-Gal平板
上,倒置培养15h。
2.6 文库滴定、重组率测定
构建的cDNA文库滴度测定按照吴晓林[3]等方法操作(文库滴定公式pfu/mL=噬菌斑数×稀释倍数×103L/mL/
稀释的噬菌体铺板 L数)。重组率测定采用蓝白斑筛选方法,即在LB平板中加入Amp、IPTG和X-Gal,于
90mm平板上铺板,置37℃温育过夜。分别计算蓝色单菌落和白色单菌落数,并计算其百分比。
2.7 cDNA文库质量鉴定
从平板上随机挑取白斑于LB/Amp培养基中37℃,200r/min摇菌过夜,然后用TVector通用引物(P1:5-
GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3;P2:5-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3)作菌液PCR验证。反
应程序如下:94℃变性3min;94℃变性30s,55℃30s,72℃2.5min,30个循环;72℃10min;终止于4℃。然后
用1.1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,确定插入片段大小情况。
3 结果与分析
3.1 总RNA的制备
提取的总 RNA在紫外分光光度计下检测
A260/A280=2.01,说明质量较好。用电泳验证,可
以看到,上面的28S条带的亮度约是中间 18S条
带的两倍,最下面 5S条带隐约可见(图 1),说明
RNA并未降解,可以用来逆转录。
3.2 全长cDNA第一链的合成
从图 2可以看到第一链 cDNA呈 smear,并
且可以看到有若干条对应于高丰度mRNA的明亮条带,这
说明反转录较为成功。
3.3 全长cDNA第二链的合成
从图3可以看出,第二链cDNA的合成正对应于第一
链cDNA,最大dscDNA在3kb左右。
3.4 cDNA文库的构建和质量鉴定
构建的文库经测定,文库的容量为1.5×106个,因为在
实验过程中为了避免小片段 cDNA的干扰,我们已经把
700bp以下的dscDNAs在切胶回收时舍弃,所以数值有点偏低。蓝白斑筛选检测重组率大于97%。从文库中
随机挑取16个白斑,以载体克隆位点两端引物进行PCR扩增插入的cDNA片段。以琼脂糖电泳检测扩增产
物(图4),结果显示:cDNA插入片段长度均在700~2200bp,平均在1000bp以上,说明建库是成功的。
4 结论与讨论
全长cDNA文库的构建是进行分子生物学研究的基本方法之一,它可以很方便地用于分离全长基因以
进一步开展基因功能的研究。
成功地构建一个全长cDNA文库,分离得到高质量的mRNA是一个前提,并且得到的mRNA种类越多,
cDNA文库就越完整,这就对RNA的质量有较高的要求。我们所提取的RNA,在琼脂糖凝胶电泳上表现为
28S、18S、5S三条清晰条带,其中 28S∶18S约为 2∶1,说明 RNA没有降解;所提取的 RNA经紫外检测,A260/

3.0kb
2.0kb
1.5kb
1.0kb
0.5kb
第3期 5
料糖国中 年8002
A280=2.01,说明所提取的RNA较纯,没有蛋白污染。
在本实验中采用的 SMARTTM方法可以获得并富集较多的全长 cDNA[4],这是因为:① 在本研究中进行
cDNA第一链合成时所用的PowerscriptI逆转录酶,因基因突变造成RNaseH活性缺失,从而可比野生型
MMLV逆转录酶能合成更长的cDNA片段;② 试剂盒中的SMARTITM寡核苷酸引物在mRNA的5末端充
当了一个短的延伸后的转换模板。当逆转录酶行进到完整mRNA的5端时,会表现出末端转移酶活性,在合
成的互补sscDNA的3末端加上几个碱基,主要是3个胞嘧啶,而SMARTITM寡核苷酸引物的3末端已经
设计好有3个鸟嘌呤碱基,据此就可以和胞嘧啶进行碱基互补配对,从而逆转录酶就可以完成模板转换,以
SMARTITM寡核苷酸引物为模板并继续复制到该寡核苷酸的末端,结果生成的全长sscDNA即含有mRNA
完整的5末端。该寡核苷酸引物序列和CDSI/3PCR引物序列及后来用到的LD-PCRPrimer序列都有一段
共同的锚定序列,在后来的PCR扩增中,只有那些在5末端含有锚定序列的sscDNA才可以充当被指数扩
增的模板,而不完整的cDNA和从非poly(A)+RNA转录的cDNA则不会被扩增,从而使mRNA得到富集。
另外,本实验在扩增dscDNA后,用琼脂糖凝胶按其大小分级分离并分别调整摩尔比进行载体连接和
转化,从而提高了大片段dscDNA与载体连接的效率,间接削弱了PCR扩增对大片段基因克隆的不利影响。
这种改进在保证全长率的基础上,使文库中插入片段的长度得到了保证[5]。这样操作比RuthWelenreuther等
[6]的方法简单易行。值得注意的是,在切胶时,将dscDNA的选取下限设为0.7kb;对于上限要根据紫外灯下
dscDNA所显示的亮度决定,对于亮度不明显的部分,切胶时应果断放弃,以保证回收后dscDNA的浓度。
在cDNA文库构建完成之后,要对载体中插入片段的大小进行检测。可以使用煮沸法[7]或碱裂解法[8]提取
质粒进行。有人分别以质粒DNA、甘油菌液和不含甘油的菌液做模板进行克隆检测后,发现用菌液直接作
PCR反应的模板和用质粒DNA作模板进行克隆的PCR检测都能得到同样明确的结果[9]。我们在实验中采用
了此方法,得到了插入子片段,成功地进行了cDNA文库的鉴定。插入片段长度在700～2200bp之间,且长度
并不均一,说明我们所构建的文库具有一定复杂性。
我们运用Clontech专利的SMART方法,构建了高效的富集全长的斑茅抗旱全长cDNA文库,经滴度测
定、重组率、PCR鉴定均符合cDNA文库的质量要求,可以对其进行随机挑选克隆测序分析,或利用探针、抗
体进行文库的筛选以寻找与抗旱有关的基因。
参考文献：
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AFul-lengthcDNALibraryConstructionofDrought
StressErianthusarundinaceus
LIUXiao-kai,ZHANGMu-qing
(KeyLaboratoryofEco-physiology&GeneticImprovementforSugarcane,MinistryofAgriculture,FujianAgricultureandForestry
University,Fuzhou350002,China)
Abstract:ThedscDNAsweresynthesizedandenrichedbyusingtheSMARTmethodbasedontheErianthus
arundinaceustreatedwithdroughtstress,andseparatedtothediferentfragmentsaccordingtosizesin
electrophoresis,thenjointheTvectorandtransformtheultra-competentcelofE.colirespectively,soachieve
theconstructionoftheFul-lengthcDNAlibrary,whichwouldredoundtotheresearchofanti-droughtgenesof
E.arundinaceus.
Keywords:Sugarcane;Erianthusarundinaceus;Ful-lengthcDNA;SMART;Droughtstress
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