全 文 ：收稿日期:2010-02-24;　修订日期:2010-08-08
基金项目:国家民委科研基金项目(No.08HB03)
作者简介:刘杰书(1963-),男(土家族), 湖北建始人, 现任湖北民族学院
医学院教授 ,硕士研究生导师 ,学士学位 , 主要从事民族医药的开发与研
究工作.
羊耳蒜吡咯里西啶生物碱的气相色谱 -质谱联用检测
刘杰书 1 ,李泳锋1 ,刘金龙 2
(1.湖北民族学院医学院 ,湖北 恩施　445000;
2.湖北省生物资源保护与利用重点实验室 ,湖北民族医学院 ,湖北 恩施　445000)
摘要:目的 对羊耳蒜化学成分吡咯里西啶生物碱(PAs)进行检测。方法 对羊耳蒜全草以 70%乙醇为溶媒超声波细胞
粉碎机提取 , 离心 、除杂进而选择试剂分离纯化 ,所得提取物采用气相色谱 -质谱联用(GC-MS)机分析。结果 从不同
溶剂中的羊耳蒜中共检测到 19个 PAs, 分子量分别为 353, 393, 395和 397。结论 不同溶剂的羊耳蒜分离液含有的 PAs
不完全相同 , 系统地检测吡咯里西啶生物碱(PAs)是否合理 , 对羊耳蒜的 PAs检测为进一步的科学研究起到积极作用 , 将
为以后开发利用羊耳蒜提供理论依据。
关键词:羊耳蒜;　吡咯里西啶生物碱;　气相色谱-质谱联用
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2011.01.033
中图分类号:R284.2　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2011)01-0076-02
　　吡咯里西啶生物碱(Pyrrolizidinealkaloids, PAs)是一类从植
物中得到的天然有毒物质 ,在植物学范畴及地理学范畴均有广泛
的分布。许多 PAs对动物和人类有严重毒性作用 , 包括肝脏毒
性 , 肺脏毒性 ,致癌作用 , 致突变作用和神经毒性等。发展中国家
死亡率较高的肝脏疾病如肝硬化 、肝癌等部分原因亦归咎于服用
含 PAs的药用植物。 WHO早在 1989年就颁布了吡咯里西啶生
物碱健康与安全指南。在荷兰 , 规定 100 g食物中 PAs的含量不
得超过 0.1 μg[ 1] 。
羊耳蒜 , 兰科羊耳兰属植物羊耳蒜 Liparisjaponica(Miq.)
Maxim., 在中国羊耳蒜以带根全草入药 , 夏秋采收 , 洗净晒干。
在地方医药学中全草有活血调经 ,止血 , 止痛 ,强心 , 镇静的功效 ,
能治疗崩漏 , 白带 , 产后腹痛 , 外伤急救等病症 [ 2] 。目前在中国
广东 、福建 、广西 、湖南 、湖北 、贵州等省有药用羊耳蒜 , 每年生药
市场需求量达到 40吨。 Leander在 1967年 , Nishikawa在 1969
年 , Lindstrom在 1971年在对其羊耳蒜属研究时均分离出吡咯里
西啶生物碱 , 而中国还未见对羊耳蒜的吡咯里西啶生物碱类化学
成分研究相关报道 , 为此本实验对羊耳蒜的吡咯里西啶生物碱进
行的研究 , 用超声细胞粉碎机进行提取 , 用极性的大小进行分离 ,
用气相色谱 -质谱联用进行分析其中化学成分 ,用 NIST谱图库
检索鉴定化合物。
1　材料与仪器
1.1　仪器 采用美国 AgilentGC6890N/MS5975iGC-MS-DS。;
AW 120型电子分析天平(新疆嘉颖科技有限公司 , 精度 0.1
mg);JY96-II超声细胞粉碎机(宁波新芝生科技股份有限公
司);旋转蒸发器 RE-52(上海亚荣生化仪器厂);飞鹤离心机
AnkeTGL-16G等。
1.2　材料 羊耳蒜(采于中国湖北恩施 , 由湖北民族学院医学院
刘杰书副教授鉴定);乙醚 、醋酸乙酯 、丙酮 、正丁醇 、无水乙醇试
剂均为色谱纯(天津市西化特种试剂厂)。
2　方法
2.1　色谱柱 为 HP-5MS弹性石英毛细管柱(30 mm×0.25 mm
×0.25 μm);升温程序:从 60℃开始 , 保温 2 min, 以 5℃· min-1
升温到 160℃,保温 1· min-1 ,再以 10℃ /min升温到 260℃,保温
2 min。汽化室温度 260 ℃;载气:高纯氦气;载气流量 10 ml·
min-1;分流比 20∶1, 进样量 0.1μl。
2.2　质谱条件 质谱的电离方式为 EI, 灯丝电流 0.6 mA;电子能
量 70eV, 倍增器电压 1 023V,离子源 200℃, 扫描周期 0.5 S, 溶剂
延迟 3.0 min, 扫描范围 50 ～ 550 amu。
2.3　供试品的制备 将羊耳蒜干全草在 60℃烘箱烘至衡重后用
粉碎机粉碎 120目 , 精密称取干粉末 50 g置 1 000 ml烧杯中 , 加
500 ml70%乙醇 , 置于超声细胞粉碎机 500 W处提取 2次 ,每次
15 min, 提取液用离心机离心除杂 , 离心液用旋转蒸发器回收乙
醇得浸膏 1.262 g,称取硅胶 30g拌样上柱 ,分别用乙醚 、醋酸乙
酯 、丙酮 、正丁醇 、乙醇冲 5倍体积柱 , 所得试剂液回收 , 定溶至
25 ml容量瓶中 , 得供试品溶液。
2.4　样品测定 精确吸取供试品溶液 5种 , 分别注入气相色谱仪
中 , 对羊耳蒜进行 GC-MS分析 , 得到羊耳蒜的 GC-MS总离子
流图。启动 P6890MS化学工作站 , 利用 NIST05-Wiley275质谱
库对各色谱峰进行检索 ,根据质谱数据 、相对保留时间和有关参
考文献 ,确认中各化学成分。通过 ShimadzuGC-MSsolution数
据处理系统 , 按照峰面积归一法进行定量分析 , 得出羊耳蒜中
PAs的相对质量分数。
3　结果
供试品溶液经 GC-MS联用仪分析鉴定 , 在确定各对照组分
质谱数据和扫描峰号后 ,用 NIST谱库进行检索 ,并核对标准质谱
图及有关资料 [ 3] , 统计 5种供试品溶液从中分离 、鉴定出 19个
PAs。
3.1　离子流程图 见图 1 ～ 6。
图 1　70%乙醇羊耳蒜 GC-MS总离子流图
图 2　乙醚羊耳蒜 GC-MS总离子流图
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时珍国医国药 2011年第 22卷第 1期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.1
图 3　醋酸乙酯羊耳蒜 GC-MS总离子流图
图 4　丙酮羊耳蒜 GC-MS总离子流图
图 5　正丁醇羊耳蒜 GC-MS总离子流图
图 6　乙醇羊耳蒜 GC-MS总离子流图
3.2　PAs质谱图 见图 7。
图 7　PAs质谱图
4　讨论
裂解方式是:主要的离子是 M/Z83, 9-O-酯类的主要离子是
来自失去酰氧基的裂解 M/Z124,在这些化合物 M/Z83相对丰
度都在 30%以上 , M/Z124相对丰度是 100%, 与 B.linodstrom
andB.luning1971在 ibid文章中羊耳蒜分离的 auriculineandpal-
udosined化合物裂解 M/Z83相对丰度都在 30%以上 , M/Z124相
对丰度都是 100。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.1 时珍国医国药 2011年第 22卷第 1期
本实验中羊耳蒜主要检测出 19个 PAs都是 C7无羟基取代
的双吡咯烷生物碱。羊耳蒜含有的 PAs含量相对较高 , 现以开
始对其羊耳蒜中的 PAs进行提取 、分离与鉴定 , 并研究其毒性与
活性。目前随着一些人的长期使用 , 可能会带来严重疾病 , 卫生
部门应呼吁当地百姓现在尽量不要使用羊耳蒜来治疗高血压病。
参考文献:
[ 1 ] 　FoodStandardsAustraliaNewZealand, Pyrolizidinealkaloidsinfood:A
toxicologicalreviewandriskassessment[ J] .TechnicalReportSeries,
2001:2.
[ 2 ] 　宋立人.中华本草 , 8卷 [ M].上海:科学技术出版社 , 1999:736.
[ 3 ] 　丛浦珠 ,李笋玉.天然有机质谱学 [ M] .北京:中国医药科技出版
社 , 2003:414.
收稿日期:2010-01-18;　修订日期:2010-08-30
基金项目:国家 “十一五 ”科技支撑计划项目(No.2007BAI40B03);
成都中医药大学博士创新基金项目
作者简介:张传涛(1981-),男(汉族),河南台前人 ,现任成都中医药大学
附属医院医师 ,博士学位 ,主要从事中医药防治病毒性肝炎工作.
＊通讯作者简介:范昕建(1953-), 男(汉族),江苏徐州人 , 现任成都中医
药大学教授 ,博士学位 ,主要从事中西医结合防治病毒性肝炎工作.
HH胶囊抗乙肝病毒的体外(2.2 .15细胞)实验研究
张传涛1 ,廖志航 2 ,吴　疆 3 , 范昕建1＊ ,陈东辉 2 ,孟宪丽1
(1.成都中医药大学附属医院 ,四川 成都　610075;　2.四川省中医药科学院 ,四川 成都　610041;
3.四川大学华西医院 ,四川 成都　610041)
摘要:目的 研究 HH胶囊体外抗 2.2.15细胞乙肝病毒作用。方法 HepG2.2.15是最常用的乙肝病毒感染的体外实验
模型 , 用不同浓度的 HH胶囊干预 2.2.15细胞 , 用 CCK-8检测药物细胞毒性 , 酶联免疫法检测乙肝病毒表面抗原(HB-
sAg)和乙肝病毒 e抗原(HBeAg),荧光定量聚合酶链反应法检测乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)。结果 HH胶囊可
以不同程度降低细胞外 HBsAg、HBeAg、 HBVDNA及细胞内 HBVDNA,此作用具有时间和药物浓度依赖性。结论 HH
胶囊具有良好的抗 HBV作用。
关键词:HH胶囊;　2.2.15细胞;　抗 HBV
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2011.01.034
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2011)01-0078-02
Anti-HepatitisBVirusEffectofHHCapsuleson2.2.l5CelLineinvitro.
ZHANGChuan-tao1 , LIAOZhi-hang2 , WUJiang3 ,FANXin-jian1＊ , CHENDong-hui2 , MENGXian-li1
(1.ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine, Chengdu610075, China;2.HuaxiHospitalofSichuan
University, Chengdu610041 , China;3.SichuanAcademyofTraditionalChineseMedicine, Chengdu610041, Chi-
na)
Abstract:ObjectiveTostudytheanti-hepatitisBvirusefectofHHCapsuleson2.2.l5cellineinvitro.MethodsHepG2.
2.15 celsarethemostcommonmodelofhepatitisBvirus(HBV)infectioninvitro, HHCapsuleswithdifferentconcentrationswas
usedtotreat2.2.15 cels, CCK-8 wasusedtodetectdrugtoxicity.Enzyme-linkedimmunosorbentassaywasusedtodetect
hepatitisBvirussurfaceantigen(HBsAg)andhepatitisBviruseantigen(HBeAg), hepatitisBvirusDNA(HBVDNA)of2.2.
15 celswasobservedbyfluorescencequantitativepolymerasechainreaction.ResultsTodifferentdegree, HHcapsulesreduced
thequantityofextracelularHBsAg, HbeAg, HBVDNAandtheintracelularHBVDNAinatimeanddose-dependentmanner.
ConclusionHHcapsuleshasdefiniteanti-HBVeffect.
Keywords:HHcapsules;　2.2.15;　Celline;　Anti-HBV
　　我国是慢性病毒性乙型肝炎(简称慢乙肝)的高发地区 , 慢
乙肝严重危害我国人民的生命健康 , 而对于慢乙肝的治疗 , 目前
仍无理想的药物及方 法 , 因此寻找安全有效的抗乙肝病毒
(HBV)药物十分迫切。 HepG2.2.15细胞是一种转染了人乙肝
病毒的人肝癌细胞株 , 能持续而稳定地表达乙肝病毒表面抗原
(HBsAg)、乙肝病毒 e抗原(HBeAg)、乙肝病毒脱氧核糖核酸
(HBVDNA)、HBVDNA多聚酶及 Dane颗粒 , 是目前筛选抗 HBV
新药的最常用细胞模型。 HH胶囊是我们长期临床治疗慢性乙
肝的经验方 ,我们在国家 “十一五”科技支撑计划项目资助下对
HH胶囊进行了新药研发 , 现将 HH胶囊体外(HepG2.2.15细
胞)抗 HBV作用研究结果报道如下。
1　材料与仪器
1.1　HepG2.2.15细胞 四川大学华西医院生物治疗国家重点实
验室保种 、传代 ,细胞接种于含 10%的胎牛血清的 1640培养液 ,
置于 37℃、 5%CO2、95%湿度的培养箱 , 实验过程中每周用 G418
筛选。
1.2　试剂及设备 HH胶囊组成:黄连 6 g, 虎杖 15 g,赶黄草 15
g,甘草 5 g等 ,由四川省中医药科学院制备水 、醇提取物后 ,用二
亚基亚砜(DMSO)溶解于培养液 [ 2] 。
CCK-8试剂盒(碧云天生物);拉米夫定片(3TC,葛兰素史
克);胎牛血清(赛黙飞世尔生物);G418(Sigma);RPMI1640培养
基(GIBICO);基因扩增仪(美国 Bio-Rad);CO2培养箱(Sanyo),
酶标仪(BioTek)。
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时珍国医国药 2011年第 22卷第 1期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.1