全 文 ：麦类作物学报　 2006, 26( 2): 16～ 20
Journal of T riticeae Crops
　
华山新麦草居群取样策略的 SSR分析
刘文献1, 2 , 李立会2 , 刘伟华 2 , 张正茂 3 , 吴振海 4 , 王成社 1
(1. 西北农林科技大学农学院 , 陕西杨凌 712100;　 2. 中国农业科学院作物科学研究所 , 北京 100081;
3. 西北农林科技大学食品科学与工程学院 , 陕西杨凌 712100;　 4. 西北农林科技大学西北植物研究所 , 陕西杨凌 712100)
摘　要:为了研究我国特有植物华山新麦草 (Psathyrostachy s huashanica Keng )的遗传多样性并获得更为
科学、合理的结论 ,以分布于不同海拔高度黄埔峪 (海拔 500 m )和大夫峪 (海拔 1 218 m )的 2个华山新麦草居群
为研究对象 ,每个居群分单株采集 30株并以 6、 10、 14、 18、 22、 26和 30株为单位 ,利用 10对 SSR引物对其遗传多
样性进行分析。 结果表明: ( 1)分布于较低海拔的黄埔峪居群的平均等位变异数 ( 6. 3)和遗传多样性指数
( 0. 713)大于分布于较高海拔的大夫峪居群的等位变异数 ( 5. 1)和遗传多样性指数 ( 0. 662) ; ( 2)随着分析单位
个体数目从 6株增加到 30株 ,黄埔峪居群和大夫峪居群的等位变异数 ( 42～ 63和 43～ 51)和遗传多样性指数
( 0. 643～ 0. 713和 0. 618～ 0. 662)均表现增大的趋势 ,但当分析单位的个体数目达到 26株以上时 ,等位变异数和
遗传多样性指数基本不再发生变化 ; ( 3)当分析单位个体数目为 18株时 , 2个居群的等位变异数和遗传多样性
指数分别包含了各自居群 95%以上的遗传变异 ,建议在利用 SSR技术进行华山新麦草居群遗传多样性研究中 ,
以单个居群随机采集 18株华山新麦草为最佳分析单位个体数目。
关键词: 华山新麦草 ; SSR; 遗传多样性
中图分类号: S 512. 9; S 336　　　　文献标识码: A　　　　文章编号: 1009-1041( 2006) 02-0016-06
SSR Analysis on the Sampling Strategy of Psathyrostachys
Huashanic Keng Population
LIU Wen-xian1, 2 , LI Li-hui2 , LIU Wei-hua2 , ZHANG Zheng-mao3 , WU Zhen-hai4 , WANG Cheng-she1
( 1. Col leg e of Agronomy, Northw es t A& F Universi ty, Yangling , Sh aanxi 712100, China;
2. Ins ti tute of Crop Science, Chines e Academ y of Ag ricul tu ral Sciences , Bei jing 100081;
3. College of Food Science and Engineering, Northw es t A& F Univ ersi ty, Yangling, Shaanxi 712100, China;
4. No rthwes t Insti tute of Botany, Northw es t A& F Universi ty, Yangling , Sh aanxi 712100, Ch ina)
Abstract: To investiga te the Genetic div ersi ty o f Chinese endemic g rass species Psathyrostachys
huashanica Keng ef fectiv ely, tw o natural populations dist ributed in alti tude o f Huangpuyu ( 500 m )
and Dafuyu( 1 218 m ) w ere evaluated by 10 pairs of simple sequence repeat ( SSR) markers in 7 sample
levels wi th di fferent sample size. The resul ts showed: ( 1) the average number o f alleles ( 6. 3) and
genetic div ersity index ( 0. 713) o f low al titude population Huangpuyu w ere higher than tho se o f high
al titude population Dafuyu ( 5. 1 and 0. 662, respectively ) ; ( 2) the number o f alleles ( 42～ 63 and 43～
51) and genetic div ersi ty index ( 0. 643～ 0. 717 and 0. 618～ 0. 662) of Huangpuyu and Dafuyu
popula tions increa sed along wi th the sampling size from 6 to 30 plants, and became relativ ely uniform
when the sample size over 26; ( 3) As the sample size w as 18, the number of alleles and genetic
div ersity index of 2 populations ow ned mo re than 95 percentag e genetic v ariations of the to tal
popula tion, therefo re, w e suggested that 18 indiv iduals could represent the whole population of
Psathyrostachys huashanica Keng based on the genetic div ersi ty of SSR.
Key words: Psathyrostachys huashanica Keng; SSR; Genetic div ersi ty
　　华山新麦草 ( Psathy rostachys huashanica
Keng )属禾本科新麦草属多年生草本植物 ,仅分
布于陕西华山一带 ,多生长于有一定湿度的谷坡
岩石、沟谷和路边 ,为典型的异花传粉植物 ,是我
国的特有种 [1 ]。由于它是小麦属的近缘种 ,加之其
具有耐旱、耐瘠、早熟、抗病等生物学特性 [2, 3 ] ,因
收稿日期: 2005-09-05　　　　修回日期: 2005-11-10
基金项目:科技部科研院所社会公益研究专项 ( 2004DIB3 J090)。
作者简介:刘文献 ( 1981- ) ,男 ,在读硕士 ,主要从事小麦遗传育种研究。
通讯作者:王成社 ( 1960- ) ,男 ,研究员 ,博士生导师 ,主要从事小麦遗传育种研究。
此开展华山新麦草的研究对探讨植物区系和小麦
属的起源、进化及作物改良具有重要意义。鉴于华
山新麦草独特的分类学地位、特殊的地理分布和
作为小麦族的重要基因资源 ,目前该物种已被列
为我国珍稀濒危物种和急需保护的农作物近
缘种 [4 ]。
取样策略 ( Sampling st ra tegy )是指对一定地
理分布范围内的生物个体取样时 ,使样本具有代
表性和包含尽可能多的遗传变异的取样方法 [5 ]。
它在很大程度上受到植物自身的生物学特性、环
境条件和取样目的的影响。 遗传多样性的取样策
略是与保护、研究和可持续利用生物资源紧密相
关的重要命题 ,直接关系到被保护利用对象是否
包括了必要和尽可能多的多样性 ,也关系到研究
结果是否具有代表性和重要参考价值。不少学者
提出了多种不同的取样策略模型 [6～ 8 ]。一般认为 ,
异花和常异花授粉植物的居群内遗传多样性丰
富 ,个体间差异比较大 ,大多采取集团取样
( Bulked seed samples)来代表居群整体水平 [9 ]。
但对异花和常异花授粉植物在一个居群内随机选
取多少个单株或个体才能使该样本量具有代表性
和包含尽可能多的遗传变异 ,则缺少理论依据。本
研究旨在通过对华山新麦草植物 SSR分子标记
的研究 ,探讨我国特有植物华山新麦草居群的最
佳取样策略 ,试图为该物种野外采集、合理利用、
有效保护以及生物多样性的研究提供可靠的理论
依据。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
实验材料于 2004年 9月 21～ 22日采集。依据
华山新麦草居群所处的海拔、生境的不同在黄埔
峪和大夫峪各设立 1个 5000 m2 ( 50 m× 100 m )样
方作为居群采样点 ,以单株为单位随机采集华山
新麦草成熟无病斑单株的健康叶片 2～ 3片 ,迅速
置于冰盒内并快速带回实验室储存于 - 70℃冰箱
中保存备用。在同一个居群内 ,每一份采集样本的
植株之间至少相隔 1 m ,以尽量保证包含不同的
基因型。详细资料见表 1。
表 1　参试的 2个华山新麦草居群采集地资料
Table 1　Habitat environment of 2 populat ions of P . huashanica
居群
Population
海拔高度
Alti tude(m )
经度
Longitude
纬度
Lat itude
生境
Habi tat
伴生植物
Plants su rrounded
黄埔峪　 Huangpu yu 500 34°31. 305′ 110°05. 940′ 山谷石坡 黄栌、枸树、野葡萄、臭椿、多花胡枝子、马棘
大夫峪　 Dafuyu 1 218 34°26. 664′ 109°56. 827′ 石质山坡 光果莸、凤毛菊、山桃、茅莓、野青茅、连翅
1. 2　取样梯度的划分
对每个居群依据样本量为 6、 10、 14、 18、 22、
26、 30个单株划分为 7个取样梯度 ,在各个取样梯
度对不同单株进行 SSR电泳分析。
1. 3　 DNA提取
DNA提取采用 Sharp等人提出的方法 [ 10]。利
用紫外分光光度计测定浓度 , 0. 8%琼脂糖检测
DNA质量 ,用 1× T E稀释至 30 ng /μL备用。
1. 4　 SSR引物
共选择位于小麦 21条染色体上的 285对 SSR
引物用于研究。所有引物均由上海生物工程公司
合成 ,序列参考 Ro der、 Pestsov a等发表的 SSR引
物序列 [11, 12 ]。
1. 5　 PCR扩增与电泳检测
PCR反应在 M J-Research公司的 PCT-200
扩增仪上进行。 20μL反应体系中含 90 ng DN A
模板 , 100 mmo l /L Tric-HCl , 50 mmol /L KCl, 2.
5 mmol /L MgCl2 , 2 mmol /L dN TPs, 3μmo l /L
SSR引物和 1 U Taq DN A聚合酶。 PCR反应程
序为: 94℃预变性 5 min, 94℃变性 1 min, 50℃、
55℃或 60℃ (视所用 SSR引物退火温度确定 )退
火 50 sec, 72℃延伸 1 min,共 35个循环。扩增产物
用 6%聚丙烯酰胺变性胶电泳分离 ,银染技术显
示。
1. 6　数据分析
数据分析参照文献 [13, 14]进行。对电泳中能
清晰出现的条带记为 1,没有此扩增条带的记为 0。
分别统计 7个取样梯度上的 SSR位点的等位变异
数 ,并计算其保留比例即各取样梯度上的 SSR位
点的等位变异数占所有 SSR位点的等位变异数
的百分比和各个梯度居群的遗传多样性指数。
遗传多样性指数 He:
He= EHi /n, Hi= 1-EPi j2
其中EPij 2表示第 i个位点上第 j个等位变异
的频率 ,n为检测位点的总数。
多态位点的平均等位变异数 Ap:
Ap= EApi /np
式中 Api为第 i个多态位点的等位变异数 , np
·17·2期 刘文献等: 华山新麦草居群取样策略的 SSR分析　　
为所检测的多态位点的总数。
2　结果与分析
2. 1　 SSR引物的筛选
随机选取黄埔峪和大夫峪居群各 4个 DNA
样品用于 SSR引物的筛选。筛选条件:① 条带清
晰 ,不弥散 ,不模糊 ;② 所有样品均有质量好的条
带 ;③ 空白中无或少假带 ;④ 条带重复性好。 最
终从这 208对小麦 SSR引物中筛选出 10对作为正
式扩增用的引物 (表 2)。
表 2　筛选出的 10对小麦 SSR引物的位点及退火温度
Table 2　Name, chromosome loci and Annealling
temperature of 10 SSR primers
引物
Primer
位点
Location
退火温度
Anneal
temperature
(℃ )
引物
Primer
位点
Location
退火温度
Annea l
temperat ure
(℃ )
Xgwm595 5A 60 Xgwm212 6D 60
Xgwm219 6B 60 Xgwm249 2A /2D 55
Xgwm601 4A 60 Xgwm268 1B 55
Xgwm264 1B/ 3B 60 Xgwm526 2B 55
Xgdm127 6D 55 Xgdm8 3D 60
2. 2　各取样梯度的等位变异及其保留比例
用筛选出的 10对小麦 SSR引物对华山新麦
草黄埔峪与大夫峪居群的不同单株分 7个取样梯
度进行 SSR分析 ,并统计不同取样梯度下华山新
麦草两个居群的等位变异数及其保留比例。由表
3可以看出 ,所筛选出的 10对小麦 SSR引物在黄
埔峪和大夫峪居群中扩增结果具有一定的差异。
在黄埔峪居群中 ,平均每个引物可扩增出 49. 70
条谱带 ,单株平均扩增谱带数为 1. 657,每个引物
的平均等位变异数 ( Ap )为 6. 3;相比之下 ,大夫峪
居群中平均每个引物可扩增的谱带数和单株平均
扩增的谱带数都大于黄埔峪居群 ,分别为 56. 60
和 1. 887,而每个引物的平均等位变异数 ( Ap )却
低于黄埔峪居群 ,为 5. 1。可以看出华山新麦草两
个居群虽然有一定的差异 ,但都表现出较丰富的
等位基因变异 ,居群内单株多处于基因型杂和状
态。 SSR引物 Xgwm268对华山新麦草大夫峪居
群的扩增结果见图 1。
由表 4可知 ,两个居群依所取的单株数量的
多少在 SSR电泳谱带上发生明显变化。当取样量
为 6株时 , 10对引物扩增出的等位变异数最少 ,分
别为 42和 43。 随着取样量的增加 ,扩增出的等位
变异数也逐渐增加。当取样量为 30株时 , 10对引
物扩增出的等位变异数达到最大 ,两居群分别为
63和 51。两个居群平均 SSR扩增等位变异的保留
比例在各取样梯度也明显不同 ,呈现出随着取样
梯度的增加 ,其保留比例在逐渐增大 (图 2)。当取
样量达到 18株时 ,两个居群的 SSR等位变异保留
比例和平均等位变异保留比例分别达到了 96.
8% 、 96. 1%和 96. 5%。这表明当居群取样量为 18
株时 ,该样本就包含居群 95%以上的遗传变异。通
常认为在可操作范围内一个居群内最佳取样数下
的群体要求包括该居群 95%以上的遗传变异 [15 ] ,
而该样本量即为达到此要求的最小样本量。因此 ,
随机采集 18个单株可被视为是对华山新麦草居
群采集、保护的最小样本量。
图 1　引物 Xgwm268对大夫峪居群 30个单株的扩增结果
Fig. 1　 An amplif ication prof ile of the 30 individuals of Dafuyu using Xgwm268
2. 3　各取样梯度的遗传多样性
对不同单株取样量下华山新麦草两个居群的
SSR遗传多样性指数分 7个取样梯度进行统计。
分析表明 ,两个居群的遗传多样性指数都随着单
株取样量的增加呈现增大趋势 (表5)。当取样量为
6株时 ,黄埔峪和大夫峪居群的遗传多样性指数
最低 ,分别为 0. 643和 0. 618;当取样量分别达到
26和 30株时 ,黄埔峪和大夫峪居群的遗传多样性
指数达到最大 ,分别为 0. 717和0. 662。由图 2可以
直观地看出 ,两个居群的平均遗传多样性指数在
总体上随着取样量的增加而逐渐向最高值 0. 688
靠近 ,当取样量为 18株 (包含 18株 )以上时 ,随着
取样量的增加遗传多样性指数变化基本趋于一
致 ,这进一步说明了在对我国华山新麦草居群的
野外考察收集、保护及多样性研究过程中 ,要至少
随机选取 18个单株才能代表和反映一个居群的
·18· 麦　类　作　物　学　报 26卷
整体遗传特性。
表 3　 10对小麦 SSR引物在华山新麦草中的扩增结果
Table 3　 Amplif ication results of 10 pairs of
SSR primers in P. huashanica
引物
Prim er
黄埔峪　 Huangyu
扩增谱
带总数
Total
band No.
单株平均扩增
谱带数
Mean
band
No. of
individ ual
等位变
异数
Ap
大夫峪　 Dafuyu
扩增谱
带总数
Total
band
No.
单株平均扩增
谱带数
Mean
band
No. of
individ ual
等位变
异数
Ap
Xg wm595 47 1. 567 5 39 1. 300 5
Xg wm 29 39 1. 300 7 35 1. 167 4
Xg wm601 54 1. 800 3 64 2. 133 3
Xg wm264 72 2. 400 6 127 4. 233 9
Xgdm127 27 0. 900 2 40 1. 333 2
Xg wm212 61 2. 033 10 43 1. 433 4
Xg wm249 51 1. 700 10 62 2. 067 7
Xg wm268 49 1. 633 8 66 2. 200 9
Xgdm8 57 1. 900 7 51 1. 700 5
Xg wm526 40 1. 333 5 39 1. 300 3
Average 49. 70 1. 657 6. 3 56. 60 1. 887 5. 1
另外 ,黄埔峪和大夫峪位于华山不同的山峪 ,
中间有高耸的山脉阻隔 ,且黄埔峪居群分布于海
拔 500 m处 ,而大夫峪居群生长于海拔 1 218 m
处 ,两者海拔相差 718 m ,因此地理隔离和海拔的
不同构成了两个居群生存环境的主要差异。而一
些研究发现 ,地理隔离和海拔的差异也会对植物
的遗传变异水平产生一定的影响 [16 ]。笔者在不同
取样梯度下对黄埔峪和大夫峪的遗传多样性指数
进行比较时发现 ,位于低海拔的黄埔峪居群的遗
传多样性指数总是高于位于高海拔大夫峪居群的
遗传多样性指数 ,通过相关分析比较 ,两者遗传多
样性指数差异达到了极显著水平 (r= 0. 906, P <
0. 01)。说明地理隔离和海拔差异有可能是影响华
山新麦草遗传多样性的环境因子。虽然黄埔峪和
大夫峪居群遗传结构已经具有一定的差异 ,分别
代表着生长于两种主要不同生态环境下华山新麦
草居群 ,但根据以上分析 ,无论是从居群等位变异
的保留比率还是从居群的遗传多样性指数方面来
看 ,都要至少随机选取 18个单株才能代表和反映
一个华山新麦草居群的整体遗传特性 ,因此此取
样策略对不同生态环境下华山新麦草居群的采集
和保护都具有一定的适用性。
表 4　华山新麦草居群不同取样量的 SSR等位
变异数及其保留比例
Table 4　 SSR Alleles and the reserve percentage
in diff erent sampling levels
取样梯度
(样本量 )
Sampling
si ze
( sample
No. )
黄埔峪
Huang puyu
等位
变异数
Alleles
保留比例
Reserv e
percentage
大夫峪
Dafuyu
等位
变异数
Alleles
保留比例
Reserv e
percentag e
两居群
Two populat ions
等位
变异数
Alleles
保留比例
Reserve
percen tage
1( 6) 42 0. 667 43 0. 843 85 0. 746
2( 10) 51 0. 810 45 0. 882 96 0. 842
3( 14) 59 0. 937 48 0. 941 107 0. 939
4( 18) 61 0. 968 49 0. 961 110 0. 965
5( 22) 62 0. 984 49 0. 961 111 0. 974
6( 26) 63 1. 000 49 0. 961 112 0. 982
7( 30) 63 1. 000 51 1. 000 114 1. 000
表 5　不同单株取样量下两居群遗传多样性指数
Table 5　 Genetic diversity indexes of 2 populations in diff erent sampling levels
居群
Population
取样梯度 (样本量 )
Genetic diversi ty of tw o populat ions in dif ferent sample lev els ( s am ple No. )
1( 6) 2( 10) 3( 14) 4( 18) 5( 22) 6( 26) 7( 30)
黄埔峪　 Huang puyu 0. 643 0. 695 0. 693 0. 715 0. 714 0. 717 0. 713
大夫峪　 Dafuyu 0. 618 0. 629 0. 644 0. 661 0. 659 0. 658 0. 662
平均值　 Average 0. 630 0. 662 0. 669 0. 688 0. 687 0. 688 0. 688
3　讨 论
对生物多样性进行研究、保护和利用 ,首先面
临的问题便是如何取样。在种质资源采集和生物
多样性保护过程中 ,除了个体数和居群数都很少
的一些濒危物种外 ,由于人力和物力的限制 ,通常
不可能对每个物种的所有居群和个体都进行采集
或保护 ,而只能采集或保护其中的一部分。然而人
们又希望在可操作的前提下 ,获取的样本能包含
尽量多的遗传变异 ,能够反映该物种或居群在进
化过程中形成的特定时空遗传结构式样。 如果没
有一个合理的取样策略 ,保护的资源和研究的结
果便很难客观反映它的真实情况 [5 ]。车永和等对
冰草属 ( Agropyron Gaertn)植物的 5个种 22个居
群分 8个取样梯度 ,分别随机取 3、 6、 9、 12、 15、 18、
21、 24粒种子的混合样进行醇溶蛋白的 A-PAGE
分析 ,结果发现 ,混合取样量最低应保持在 12个
个体及以上方能代表冰草居群整体 ,反映居群的
整体遗传特性 [17 ]。 李昂等对细距堇菜 ( Viola
tenuicoynis )的研究表明 ,从样本数量上看 ,对大群
体取样时样本数应大于 30才能得到较准确的遗
传参数估算值 ,而样本数小于 20时的估算可能有
·19·2期 刘文献等: 华山新麦草居群取样策略的 SSR分析　　
图 2　不同单株取样量下两个居群 SSR等位变异保留比率及遗传多样性指数
Fig. 2　 SSR Allele reserve percentage and genetic diversity indexes in diff erent sampling levels
较大的偏差 [18 ]。本研究利用 SSR分子标记对生长
于华山不同生态环境中的两个居群分单株进行取
样策略研究。研究结果表明 ,分布于较低海拔的黄
埔峪居群的平均等位变异数和遗传多样性指数都
大于分布于较高海拔的大夫峪居群的等位变异数
和遗传多样性指数 ,两个居群在各取样梯度上的
等位变异数和遗传多样性指数存在着随样本量的
增加随之变大的趋势。 两个居群不同取样量整体
以 6株扩增的等位变异数 ( 85)为最少 ,以 30株扩
增的等位变异数 ( 114)为最多。当样本量为 18时 ,
该样本就包含了居群 95%以上的遗传变异。两个
居群的平均遗传多样性指数随取样量的增加也表
现增大 , 取样量为 6株时遗传多样性指数最低 ( 0.
630) ;当取样量达到 18株时 ,遗传多样性指数便
达到最大值 ( 0. 688)。当取样量超过 18株时 ,随着
取样量的进一步增加遗传多样性指数变化基本趋
于一致。说明了在对我国华山新麦草居群野外考
察收集、保护及多样性研究过程中 ,要至少随机选
取 18个单株才能代表和反映一个华山新麦草居
群的整体遗传特性。这对今后华山新麦草的野外
考察收集和保护都具有借鉴意义。
华山新麦草为我国特有种 ,仅分布于陕西华
山 ,为典型的异花传粉多年生植物 ,可通过分蘖和
地下茎进行生长。 华山新麦草主要分布在生境比
较严酷的路边及峭壁的岩石凹陷或空隙沉积土
中 ,居群呈间断的“岛屿”状分布 ,空间占有率相当
有限 ,居群中的个体数量也很少。为适应华山严酷
的生存环境 ,华山新麦草居群内保持着较高的遗
传多样性 [2, 19 ]。虽然近年来随着华山旅游业的发
展 ,个别位于旅游景区的华山新麦草居群的生长
环境受到严重的人为破坏 ,但大多数居群仍处于
自然生长环境状态 ,因此该野生物种的遗传变异
在长期的进化过程中主要还是受到自然环境因素
的影响 ,通过花粉、种子传播的基因流受人为因素
的影响相对较少 ,因此相当一部分变异是和环境
异质性相关的。建议在对华山新麦草进行野外考
察收集时 ,对确定所要采集的居群数目采用聚集
取样法 ,即取样居群成聚集状分布 ,每组内有若干
居群 ,组间大致呈均匀分布 ,从而可以获得大量受
地理环境和微地形变化影响而产生的变异 ,以保
证取样能够代表该物种的在进化过程中形成的特
定时空遗传结构式样。
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·20· 麦　类　作　物　学　报 26卷
和优质品种选育的理想方法。
虽然 HMW-GS对小麦的品质具有相当重要
的影响 ,但小麦品质的影响因素较为复杂 ,应将
HMW-GS、 LMW-GS、醇溶蛋白以及淀粉特性综
合考虑 ,才有可能在品质育种实践中获得理想的
效果。
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·71·2期 冯 毅等: 黄淮麦区部分推广小麦品种高分子量麦谷蛋白亚基组成分析