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滇重楼全长 cDNA文库的构建及初步分析
赵 爽，董 栩，马 腾
(云南中医学院中药学院，云南 昆明 650500)
摘要 目的:构建滇重楼全长 cDNA文库，为进行滇重楼生长发育相关基因及次生代谢产物合成途径相关基
因的研究奠定基础。方法:改良 Trizol 法提取滇重楼根茎总 ＲNA，通过 SMAＲT(switching mechanism at 5end of ＲNA
transcript)构建全长 cDNA文库，测定分析文库滴度、重组率及插入片段大小，对文库进行随机测序并通过 Blastx分
析后在 GenBank中进行同源性检索和功能预测。结果:文库的库容为 2. 5 × 107 cfu /mL，文库重组率 98. 5%，插入片
段大小平均为 1. 5 kb。随机挑取 192 个单克隆测序，其中有 149 条 ESTs(Expressed Sequence Tags) ，其中 9 条序列
与生长发育有关，5 条序列与滇重楼次生代谢产物的合成、运输与代谢有关。结论:利用 SMAＲT技术成功构建了滇
重楼全长 cDNA文库，该文库库容量大、重组率高且插入的 cDNA片段较长，可以满足滇重楼功能基因的鉴定、筛选
及表达调控研究。
关键词 滇重楼;全长 cDNA文库;SMAＲT;ESTs
中图分类号:Ｒ282. 1 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2014)01-0022-04
收稿日期:2013-09-05
基金项目:国家自然科学基金(81160502) ;云南省自然科学基金(2011FZ153)
作者简介:赵爽(1980-) ，女，博士，副教授，研究方向:药用植物生物技术;Tel:15911633836，E-mail:zm_zs@ 126. com。
Construction and Preliminary Analysis of a Full-length cDNA
Library for Paris polyphylla var. yunnanensis
ZHAO Shuang，DONG Xu，MA Teng
(Department of Chinese Materia Medica，Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China)
Abstract Objective:A full-length cDNA library of Paris polyphylla var. yunnanensis was constructed in order to research the
genes relating to growing development and the genes regulation of its secondary metabolite biosynthesis. Methods:The total ＲNA was ex-
tracted from Paris polyphylla var. yunnanensis using modified Trizol method. The SMAＲT(switching mechanism at 5 end of ＲNA tran-
script)technology was applied to construct the full-length cDNA library. The library titer，recombinant rate and length of insert fragments
were determined，the sequences of the library were analyzed by Blastx and were compared to GenBank database. Ｒesults:The capacity of
the library was 2. 5 × 107 cfu /mL，the recombinant rate was 98. 5% and the average size of the inserted fragment was 1. 5 kb. 9 ESTs
(Expressed Sequence Tags)were relating to growing development and 5 ESTs were relating to regulation of secondary metabolite biosyn-
thesis among 149 ESTs obtained from 192 clones sequenced. Conclusion:A full-length cDNA library of Paris polyphylla var. yunnanensis
is constructed by SMAＲT technology successfully，and the library has enough capacity，high recombinant rate and long insert fragment
for the further research to screen and identify the functional genes of Paris polyphylla var. yunnanensis.
Key words Paris polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch.)Hand. -Mazz.;Full-length cDNA library;SMAＲT;ESTs
滇重楼 Paris polyphylla Smith var. yunnanensis
(Franch. )Hand. -Mazz. 为百合科植物〔1〕，主要分布
于云南、贵州和四川等地，为云南省道地药材〔2〕。
滇重楼具有清热解毒、消肿止痛等功效〔1〕，是云南
白药、宫血宁胶囊、季德胜蛇药片等著名中成药的主
要原料之一。
由于滇重楼自然生长缓慢，加上无计划的采挖
和环境的破坏，导致其野生资源面临枯竭〔3〕。滇重
楼主要有效成分甾体皂苷的结构复杂〔4〕，人工合成
困难，利用现代生物技术将是此类化合物生产的主
要途径。构建 cDNA文库不仅可以保护濒危珍稀的
滇重楼资源，还可以进行功能基因组研究、提供构建
分子标记连锁图谱的探针等。目前虽然已建立起人
参〔5〕、甘草〔6〕等多种药用植物的 cDNA文库，但笔者
尚未见滇重楼 cDNA文库构建的相关报道。
本研究以滇重楼根茎为材料，采用 SMAＲT
(switching mechanism at 5end of ＲNA transcript)方
法构建滇重楼的全长 cDNA 文库并初步进行 ESTs
序列分析，为进一步探讨滇重楼生长发育的分子机
制、功能基因组学及次生代谢产物生物合成的调控
机制等研究提供依据。
1 材料
植物材料为六年生滇重楼的新鲜根茎，经云南
中医学院游春高级实验师鉴定为百合科植物滇重楼
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Paris polyphylla Smith var. yunnanensis (Franch. )
Hand. -Mazz. 的根茎，用清水冲洗，然后以 75%乙醇
消毒，切成小块，液氮速冻后保存于 － 80 ℃超低温
冰箱中。
SMAＲTTM ＲACE cDNA Amplification Kit(clon-
tech)、转录酶、Premix Taq DNA 聚合酶等购自宝生
物工程(大连)有限公司;琼脂糖凝胶 DNA 回收试
剂盒、PMD18-T克隆试剂盒、DH10B 感受态细胞、质
粒提取试剂盒等购自昆明丰科生物科技有限公司;
Trizol溶液、β-巯基乙醇、异丙醇、蛋白胨、酵母提取
物、NaCl、KCl、MgCl2、葡萄糖、IPTG、X-gal 等常规试
剂购自昆明赛贝斯商贸有限责任公司。
2 方法
2. 1 改良 Trizol法提取总 ＲNA 称取滇重楼根茎
材料 100 mg，利用改良 Trizol 法提取滇重楼根茎总
ＲNA〔7〕，所提取 ＲNA 采用 1%琼脂糖凝胶电泳检
测，并于 － 80 ℃下保存。
2. 2 双链 cDNA合成 根据本实验所采用的文库
构建试剂盒的说明书进行双链 cDNA 合成。取 2 ～
3 μL ＲNA 溶液为模板，以 CDSⅢ /3Primer 为引物
［5-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG (T)30
N －1N-3，N = A、G、C、T;N －1 = A、G、C］，在逆转录酶
作用下合成单链 cDNA。取 2 ～ 3 μL 一链反应产物
作为模板，以 5-Primer(5-AAGCAGTGGTATCAAC-
GCAGAGT-3)和 CDSⅢ /3Primer为引物，进行长链
PCＲ扩增，从而合成双链 cDNA。取 4 ～ 5 μL 扩增
产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测 cDNA 的质量;取
40 ～ 50 μL高质量的 cDNA 为模板，利用 2 μL 蛋白
酶 K于 45 ℃下作用 20 ～ 30 min后，利用酚 /氯仿抽
提、纯化产物，并将所得沉淀溶于 70 ～ 80 μL ddH2O
中，然后加入 sfiⅠ酶于 50 ℃下酶切 2 ～ 3 h，利用
DNA回收试剂盒回收得到 1 kb以上的 cDNA片段。
2. 3 cDNA文库构建 取 5 μL cDNA片段和 1 μL
pDNＲ-LIB 载体、2 μL T4 DNA 连接酶混合后，于
14 ℃下连接 10 ～ 12 h。将连接后的产物点样到分
子透析膜上，脱盐 1 ～ 1. 5 h，利用电击转化法将 2 ～
3 μL脱盐后的产物转化到大肠杆菌感受态细胞中
(菌株 DH10B)。转化产物经过复苏培养后，即为
cDNA文库。向 cDNA文库溶液中加入 25% ～ 30%
甘油后，于 － 80℃长期保存。
2. 4 cDNA文库质量鉴定 转化产物经过复苏培
养后，取 1 μL和 0. 5 ～ 1 mL LB液体培养基混匀，取
100 μL混合液涂在 LB 固体培养基(3 mg /mL 氯霉
素)上，放置于 37 ℃恒温培养箱中 10 ～ 12 h。根据
公式:文库滴度(cfu /mL)=菌落数 × 10 × 1000 进行
统计。为了进一步鉴定文库的质量，在平板上随机挑
取 16个单菌落，每个菌落分别加入 20 μL LB液体培
养基震荡混匀后，取 1 μL 作模板，用引物 M13(F:
5-GTAAAACGACGGCCAGTA-3，Ｒ:5-AACAGCTA-
TGACCATGTTC-3)进行菌落 PCＲ 检测，以鉴定构
建的滇重楼根茎 cDNA文库的插入片断大小和文库
重组率。
2. 5 ESTs测序及生物信息学分析 随机挑取 192
个单克隆进行 5端测序，用 Chromas 软件剔除载体
序列，用 DNAtools 软件去除冗余序列后，用 Se-
quencher Demo 2. 0 软件进行序列质量分析和拼接。
将通过 GenBank数据库和 BlastX 对有效的 ESTs 序
列进行比对分析。依据以下标准将有效的 ESTs 分
为 4 类:(1)分值(Total score)≥150、E值(The value
of E)≤1 × 10 －15、相似度(Largest ident)≥40%，为
高度相似;(2)150 ＞分值≥60、1 × 10 － 15 ＜ E 值≤
1 × 10 － 10、40% ＞相似度≥30%，为中度相似; (3)
分值 ＜ 60、E 值 ＞ 1 × 10 － 10、相似度 ＜ 30%，为低度
相似;(4)在数据库中暂时无相关记录者，为无匹
配。
3 结果与分析
3. 1 滇重楼总 ＲNA 质量的检测 从琼脂糖凝胶
电泳图(图 1)上可以看出，利用改良 Trizol 法提取
的滇重楼根茎总 ＲNA 28S 和 18S 2 个条带都较清
晰，没有降解，并且 28S亮度约为 18S的 2 倍。表明
提取的总 ＲNA 质量比较高，完整性好，符合 cDNA
文库构建的要求。
图 1 滇重楼总 ＲNA检测
3. 2 cDNA的合成 双链 cDNA经 1%琼脂糖凝胶
电泳后形成 1 条弥散状条带(图 2) ，长度约 0. 1 ～ 6
kbp，中间有几条与组织特异高丰度表达 mＲNA相对
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应的宽带，表明合成的双链 cDNA较完整，质量较好。
图 2 滇重楼双链 cDNA检测
3. 3 文库的滴度、重组率及插入片段的大小 按
照载体与 cDNA的最适连接比进行放大培养检测，
结果显示原始文库滴度为 2. 5 × 107 cfu /mL，蓝白筛
选鉴定文库的重组率为 98. 5%。随机选取 16 个克
隆，PCＲ 鉴定插入片段的大小，电泳显示片段长度
大部分在 0. 5 ～ 3. 0 kb，平均大小在 1. 5 kb 左右(图
3) ，满足 cDNA 文库构建要求。
3. 4 EST 测序结果及分析 利用 Sequencher 2. 0
Demo软件对所获得的 192 条 EST 进行聚类分析和
拼接。去除 5 个空载体序列，共获得 149 个非重复
序列(UniGenes) ，其中包括 27 个重叠群(contig)
(占 18. 12%)和 122 个独立 ESTs(singletons) (占
81. 88%)。UniGenes的平均长度为 1 507 bp，其中
大于 700 bp 有 129 条，占总量的 86. 58%，小于 700
bp有 20 条，占总量的 13. 42%。
图 3 滇重楼 cDNA文库插入片段大小鉴定
将有效的 EST 序列通过 BlastX 和 GenBank 数
据库进行比对。在 149 个 UniGenes 中，103 个
(69. 13%)和数据库中高度相似，30 个(20. 13%)中
度相似，7 个低度相似，9 个无匹配。高度相似和中
度相似的 UniGenes共有 133 个，其中根据比对结果
推测出基因功能的有 115 个，比对上但未推测出功
能的有 18 个(表 1)。已知功能的基因中与初级代
谢产物合成及代谢相关的基因有 40 个，如核糖体结
合蛋白Ⅱ家族基因、氧化还原酶、脱氢酶等;抗病 /防
御相关的基因有 29 个，如几丁质酶基因、巯基蛋白
酶抑制剂基因(CPI)等;蛋白质泛素修饰酶相关的
基因有 14 个，如泛素缀合酶基因(ubiquitin-conjuga-
ting enyme)等;生长发育相关的基因有 9 个，如生长
素抑制蛋白基因(AＲP1)和植物转录调节因子
(WＲKY8)等;信号转导相关的基因有 10 个，如参与
植物过敏反应的基因(ＲGL) ;次生代谢产物合成、
运输和代谢相关的基因有 5 个，如查耳酮合酶基因、
肉桂醇脱氢酶基因、细胞色素 P450 基因等;其他已
知功能基因，如谷胱甘肽巯基转移酶基因等。而低
度相似和无匹配序列共 16 个，很有可能为新基因，
但有一部分序列可能是已知基因的非保守区域，加
上比对上但未推测出功能的 18 个，这 34 个序列为
进一步探讨新的功能基因提供了参考信息。
表 1 滇重楼 ESTs序列与 GenBank
数据库同源性比较结果
类型 EST /个 占总 EST比例 /%
初级代谢 40 26. 85
抗病 /防御 29 19. 46
蛋白质泛素修饰酶 14 9. 40
生长发育 9 6. 04
信号转导 10 6. 71
次生代谢 5 3. 36
其他已知功能 8 5. 37
未知功能 34 22. 82
合计 149
4 讨论
构建 cDNA文库已成为研究功能基因组学的基
本手段之一。经典 cDNA 文库的构建虽然高效、简
便，但文库克隆的片段一般较小，所能提供的基因信
息有限〔8〕。全长 cDNA文库不仅能提供完整的 mＲ-
NA信息，而且可以对蛋白质序列进行预测，有助于
及时进行体外表达或通过反向遗传学研究基因的功
能等〔9〕。本研究使用 SMAＲT 技术构建的滇重楼
cDNA文库便是全长 cDNA文库。
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ＲNA的制备是高质量 cDNA 文库构建的前提
和基础。本研究采用的改良 Trizol 法操作简便，避
免了复杂操作可能引起的 ＲNase 污染。最终从富
含多酚和多糖的滇重楼根茎中分离出了高质量的
ＲNA，符合 cDNA文库构建的要求，同时为其他富含
多酚和多糖的药用植物 ＲNA提取提供借鉴。
cDNA 文库的质量主要表现在库容量和重组
cDNA片段的大小〔10〕。一般来说，文库滴度能达到
105 cfu /mL 以上即为有效文库〔11〕，本研究构建的滇
重楼根茎 cDNA 文库的原始文库滴度为 2. 5 × 107
cfu /mL，重组率为 98. 5%，高于理论标准值，可以满
足筛选到低丰度的 mＲNA 的要求。并且该文库插
入片段大部分在 0. 5 ～ 3. 0 kb，平均大小在 1. 5 kb
左右，保障了高比例全长 cDNA片段的获得。
本研究通过随机测序获得了 149 条 ESTs序列，
虽然测序序列的数量较少，但是仍然获得了与滇重
楼生长发育相关的基因，如生长素抑制蛋白基因
(AＲP1)及植物转录调节因子(WＲKY8)等;与滇重
楼次生代谢产物合成相关的基因，如肉桂醇脱氢酶
基因及细胞色素 P450 基因等;另外，获得的与抗逆
性相关的基因如几丁质酶基因和巯基蛋白酶抑制剂
基因，还可以作为候选的抗病基因和抗虫基因用在
农作物或园艺作物上。目前本实验室一方面对已获
得的有价值的功能基因进行全长测序及功能验证，
另一方面进行大规模测序，希望获得更多与滇重楼
生长发育和次生代谢产物合成途径相关的基因，为
从分子水平上调控滇重楼药材的质量奠定基础。
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·52·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 37 卷第 1 期 2014 年 1 月