全 文 ：甘蔗糖业 2006 年第 1 期 Sugarcane and Canesugar 2006 年 2 月
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斑茅杂交后代的分子鉴定*
劳方业 符 成 陈仲华 陈健文 张垂明 杨业后 邓海华
（广州甘蔗糖业研究所，广州 510316）
摘 要 采用 SSR、5S rDNA、Alu-like 分子标记技术对甘蔗（Badila）与斑茅杂交后代 F1 及其回交后代
BC1、BC2、BC3等进行分析，结果表明，SSR 是斑茅杂交后代真实性鉴定的有效方法，mSSCIR33 是较佳引物
之一；5S rDNA 可用于鉴别斑茅 F1，但因其多态性不高，不能用作回交后代真实性鉴定，用于斑茅血缘的
检测时，随着回交代数的提高，可靠性降低；Alu-like 不适宜用作杂种后代真实性鉴定，但是检测斑茅
血缘的较好方法。
关键词 甘蔗；斑茅；杂种鉴定；SSR；5S rDNA；Alu-like
0 前言
甘蔗遗传基础狭窄制约了甘蔗育种的发展。
引入野生种质基因，拓宽遗传基础已成为甘蔗育
种界的共识。在过去数十年甘蔗育种中，细茎野
生种相对得到较好的利用，取得了良好效果。斑
茅（Erianthus arundinaceus）是甘蔗近缘属植
物，由于粗生，宿根性好，抗逆性强，适应广而
倍受甘蔗育种家的重视。100 多年前就有人开始
尝试甘蔗与斑茅的杂交，而且这种尝试一直没有
停止过。曾经认为斑茅种质已成功引入了甘蔗栽
培种，但近年来，经分子标记技术鉴定，结果已
被否定。斑茅杂交后代真实性的分子标记鉴定方
法很多，如 RAPD[1]、SSR[2]、ISSR[3]、ITS[4]、5S
rDNA[2，5]、Alu-like [6]等。但这些鉴定技术应
用范围多为斑茅 F1或 F1-BC1，回交多代的真实性
鉴定未见报导。近年来海南甘蔗育种场在斑茅研
究利用方面取得重大突破，已育成了一批 BC1、
BC2、BC3[7，8，9]。因此，探索斑茅杂交后代真实
性鉴定技术，对加快斑茅的有效利用十分重要。
本文通过 SSR、5S rDNA、Alu-like 等分子标记
技术对斑茅杂交后代 F1、BC1、BC2、BC3 进行分
析鉴定，总结出这些方法在斑茅杂交后代鉴定中
各自特点以及适用范围，可供斑茅研究利用过程
中的分子鉴定参考。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料见表 1。
另外，在 5S rDNA 和 Alu-like 标记分析中
还加入内江 57-416、ROC16 作对照。
表 1 杂交组合及其后代
杂交组合 子代
母本 父本 代数 品 系
Badila 海南 92-77 F1 崖城 96-40
崖城 96-40 CP84-1198 BC1 YCE01-92,YCE01-116
YCE01-92 ROC20 BC2 YCE03-87,YCE03-456
粤农 73-204 YCE03-456 BC3 BC3-1,BC3-2,BC3-3,BC3-4
ROC20 YCE03-456 BC3 BC3-5,BC3-6
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取
采用 CTAB 法，参照 Hoisington 等[10]方法，
并略加改进。
1.2.2 SSR 分析
采用 CIRAD 的 mSSCIR21sa、mSSCIR33 等引
物。PCR 反应总体积为 20 µL，含模板 DNA 25 ng，
───────────────
* 基金项目：广东省自然科学基金项目(020630)、广东省国际合作项目（2003C50215）资助
劳方业(1961～)，男，硕士，高级农艺师
劳方业等：斑茅杂交后代的分子鉴定
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引物 6 µM，dNTP 0.2 mM，MgCl2 3.0 mM，Taq
酶 0.4 U 和匹配的缓冲液。扩增程序为：94℃ 1
min；然后，“94℃ 30 sec，解链温度（54℃） 1
min，72℃ 30 sec”，共 35 个循环；最后，72℃ 5
min。扩增产物经 95℃变性 10 min 后，在 5％聚
丙烯酰胺凝胶上电泳（功率 100W）2.5～3 h。
凝胶经银染显带后，拍照保存。
1.2.3 5S rDNA 分析
采用 Cox 等设计的引物。PCR 反应总体为 20
µl，含模板 DNA 25 ng，引物 6 µM，dNTP 0.2 mM，
MgCl2 3.0 mM，Taq 酶 0.4 U 和匹配的缓冲液。
扩增程序为：95℃ 3 min；然后，“93℃ 55 sec，
解链温度（55℃）15 sec，72℃ 30 sec”，共 30
个循环；最后，72℃ 5 min。扩增产物在 2％琼
脂糖凝胶上电泳（电压 4～5 V/cm）1.5～2 h。
然后经凝胶成象系统照相并保存。
1.2.4 Alu-like 分析
采用 PROLIGO 提供的引物。PCR 反应总体为
20 µl，含模板 DNA 25 ng，引物 6 µM，dNTP 0.2
mM，MgCl2 3.0 mM，Taq 酶 0.4 U 和匹配的缓冲
液。扩增程序为：94℃ 1 min；然后，“94℃ 30
sec，解链温度（55℃） 1 min，72℃ 30 sec”，
共 35 个循环；最后，72℃ 5 min。扩增产物在
2％琼脂糖凝胶上电泳（电压 4～5V/cm）1.5～2
小时。然后经凝胶成象系统照相并保存。
2 结果与分析
2.1 SSR 标记
从图 1 可看出，条带可分为 2 个区，S1～S12
1、Badila; 2、海南 92-77; 3、崖城 96-40; 4、CP84-1198; 5、YCE01-116; 6、YCE01-92; 7、ROC20; 8、
YCE03-87; 9、YCE03-456; 10、粤农 73-204; 11、BC3-1; 12、BC3-2; 13、BC3-3; 14、BC3-4; 15、ROC20;
16、YCE03-456; 17、BC3-5; 18、BC3-6
图 1 mSSCIR33 扩增图谱
为热带种（或栽培种）特有带区，而 S13～S18
则为斑茅特有带区。崖城 96-40（F1）既有母本
Badila 的带（S1、S2、S6），也有父本海南 92-77
的带（S13、S14、S15、S16、S17），是真杂种。
甘蔗糖业 2006 年第 1 期 Sugarcane and Canesugar
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YCE01-116（BC1）有来自于崖城 96-40 的 S6、S13、
S14、S15、S16、S17，也有来于自 CP84-1198 的
S4、S5。YCE01-92（BC1）有来自崖城 96-40 的 S6、
S13、S14、S15、S16、S17 也有来自 CP84-1198
的 S8、S9，可见 YCE01-116 和 YCE01-92 都是“崖
城 96-40×CP84-1198”的真杂种。YCE03-87（BC2）
从图 1 中无法判断其真假，但其他引物（如
mSSCIR21sa）扩增分析结果为真杂种（资料没有
显示）。YCE03-456（BC2）有 YCE01-92 的 S6、S13、
S14、S15、S16、S17，也有 ROC20 的 S3，所以
为真杂种。上述鉴定结果与同工酶及其他人的分
子标记鉴定结果一致[2,7,8]。BC3-1 虽然有 YCE03-
456 的 S1、S2、S3，也有粤农 73-204 的 S9、S10，
但出现父母均没有的 S4、S5、S7，应为假杂种，
而且不含斑茅血缘（无斑茅特有带）。BC3-2、BC3-3
为真杂种（有 YCE03-456 的 S1、S2、S3、S13、
S14、S15、S16、S17，也有粤农 73-204 的 S11、
S12）。BC3-4 含 YCE03-456 的 S1、S2、S3、S6，
有粤农 73-204 的 S9、S10、S11、S12，而且不
含父母本以外的带，应为真杂种，但却不含斑茅
血缘。BC3-5、BC3-6 都含有斑茅血缘，但前者无
ROC20 的带，无法判断真假；后者出现父母没有
的带（S8、S9），应为假杂种，其带型与 YCE01-
92、YCE03-87 很相似，是否为串粉或混淆所致，
尚需进一步研究。所有栽培品种及斑茅杂交后代
都出现热带种特有带，说明都含热带种血缘。另
外也不难发现，斑茅特有带随着回交代数的提高
而减弱，海南 92-77（泳道 2）最深，到了 BC3
已经很弱（泳道 12：BC3-2；泳道 13：BC3-3），
这与斑茅血缘所占的比例下降有关。
2.2 5S rDNA 标记
Badila 与其他栽培品种 CP84-1198、ROC20、
粤农 73-204、内江 57-416、ROC16 一样，只扩
增出一条约 230bp 的带，而斑茅（海南 92-77）
也只扩增出约 370bp 的带。崖城 96-40（F1）是
真杂种，同时含有热带种和斑茅的带。YCE01-116
（BC1）、YCE01-92（BC1）、YCE03-87（BC2）、
YCE03-456（BC2）都是真杂种（见 2.1），同时含
有热带种和斑茅的特有带。BC3-1 为假杂种，也
不含斑茅血缘，故无斑茅特有带。BC3-2、BC3-3
都是真杂种，也含斑茅血缘，但只有后者有斑茅
特有带，而前者则无。BC3-4 虽为真杂种，但无
斑茅血缘，故不含斑茅特有带。BC3-5、BC3-6 虽
然都有斑茅血缘，但只有前者有斑茅特有带，而
后者则无。从图 2 可知，所有的杂交后代与栽培
种一样都含 230bp 的带，说明这些品种（系）都
有热带种血缘，与 SSR 分析结果一致。从 F1-BC2，
凡是含斑茅血缘，都出现斑茅特有带，但到了
BC3，即使含有斑茅血缘，也不一定出现斑茅特
有带。这可能与 5S rDNA 位点仅存在于小数染色
体上以及该基因位点在回交过程中不断分离有
关。根据 Q.CAI 等[2]报导，5S rDNA 标记在 BC1 已
出现分离现象。由此可见，凡有 370bp 特征带的
材料，可断定其含有斑茅血缘，反之，则不能否
定其不含斑茅血缘。
表 2 斑茅杂交后代的 SSR 标记（引物：mSSCIR33）鉴
定结果
杂交后代
品系 代数 结 果
崖城 96-40 F1 真杂种（含斑茅血缘）
YCE01-92 BC1 真杂种（含斑茅血缘）
YCE01-116 BC1 真杂种（含斑茅血缘）
YCE03-87 BC2 真假不确定*（含斑茅血缘）
YCE03-456 BC2 真杂种（含斑茅血缘）
BC3-1 BC3 假真杂种（不含斑茅血缘）
BC3-2 BC3 真杂种（含斑茅血缘）
BC3-3 BC3 真杂种（含斑茅血缘）
BC3-4 BC3 真杂种（不含斑茅血缘）
BC3-5 BC3 真假不确定（含斑茅血缘）
BC3-6 BC3 假真杂种（含斑茅血缘）
注： * mSSCIR21sa 等引物鉴定为真杂种
2.3 Alu-like 标记
凡有斑茅血缘的品系（品种）就可扩增出一
条约 270bp 带，反之无带（见图 3）。Badila 与
其他栽培品种 CP84-1198、ROC20、粤农 73-204、
内江 57-416 不含斑茅血缘，BC3-1、BC3-4 也不
含斑茅血缘，都没有扩增出带。海南 92－77 为
斑茅，崖城 96－40、YCE01-116、YCE01-92、
劳方业等：斑茅杂交后代的分子鉴定
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YCE03-87、YCE03-456、BC3-2、BC3-3 为均斑茅
真杂种后代，BC3-5、BC3-6 也都有斑茅血缘（见
2.1），故全部能扩增出一条很强的带（约 270bp），
而且其强弱与回交代数的升高没有明显变化。从
上述分析可看出，在检测斑茅血缘方面，Alu-like
与 SSR 结果一致，但与 5S rDNA 有所不同，前者
在 BC3-2 和 BC3-5 可扩增出斑茅特有带，而后者
则不能。可见，Alu-like 标记比 5S rDNA 更适
用于斑茅血缘的检测。
3 讨论

1、Badila; 2、海南 92-77; 3、崖城 96-40; 4、CP84-1198; 5、YCE01-116; 6、YCE01-92; 7、ROC20; 8、
YCE03-87; 9、YCE03-456; 10、粤农 73-204; 11、BC3-1; 12、BC3-2; 13、BC3-3; 14、BC3-4; 15、ROC20;
16、YCE03-456; 17、 BC3-5; 18、BC3-6; 19、内江 57-416; 20、ROC16
图 2 5S rDNA 扩增图谱
1、Badila; 2、海南 92-77; 3、崖城 96-40; 4、CP84-1198; 5、YCE01-116; 6、YCE01-92; 7、ROC20; 8、
YCE03-87; 9、YCE03-456; 10、粤农 73-204; 11、BC3-1; 12、BC3-2; 13、BC3-3; 14、BC3-4; 15、ROC20;
16、YCE03-456; 17、 BC3-5; 18、BC3-6; 19、内江 57-416
图 3 Alu-like 扩增图谱
在过去数 10 年间，甘蔗与斑茅的属间杂交，
育种家们做过许多尝试，但都未能取得重大进
展，只有少数证明育成了 F1 真杂种。主要原因
是：甘蔗与斑茅亲缘关系较远，杂交时亲和性很
差，不容易授粉成功，即使偶然授粉成功获得 F1，
也因其可育性差而无法进一步进行杂交利用。斑
茅杂交后代的真实性鉴定经历了形态学、染色
体、同工酶、分子标记等阶段。这些方法各有优
缺点，当然可靠性也有很大的差别。随着分子生
物学的飞速发展，分子标记分析方法也层出不
穷。其中以 PCR 为核心的技术，以其简便、快速
和可靠性高等特点迅速成为真假杂种分子鉴定的
有力工具。而 PCR 引物的设计，直接影响扩增产
物的多态性和特异性，是这些技术应用的关键环
节。本研究所用的 SSR、5S rDNA、Alu-like 3
种分子标记技术都是基于 PCR 的方法，通过设计
不同的引物来扩增不同的特异 DNA 片段，从而达
到识别真假杂种或判断是否含有斑茅血缘的目
甘蔗糖业 2006 年第 1 期 Sugarcane and Canesugar
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的。这 3 种方法各有特点。SSR 是目前用于鉴定
真假杂种的最有效的方法之一，但扩增产物的分
离和分析比 5S rDNA、Alu-like 复杂。能否鉴定
出后代的真假取决于引物使用。本研究表明，
mSSCIR33 能鉴定大多数杂交后代的真假，也能
判断是否含有斑茅血缘，是一个很好的引物。但
是它无法鉴定 YCE03-87 和 BC3-5 的真实性。因
此，要鉴定一些杂交后代的真实性，有时候可能
要使用数个有效引物才能办到。5S rDNA 比较简
便，但多态性不高，不能用于真假杂种鉴定，只
能用于初步判断是否含有斑茅血缘或热带种血
缘。本研究表明，随着回交的不断进行，斑茅血
缘在后代中的比例不断下降，到了 BC3，即使还
含有斑茅血缘，有的品系如 BC3-2 和 BC3-5 等，5S
rDNA 也无法检测到。这表明 5S rDNA 位点在基
因组中分布不多，而且在回交过程中不断分离。
Q. Cai 等[2]研究也有同样的结论。因此 5S rDNA
只能用于判断斑茅与热带种（包括栽培种）F1 的
真实性或 F1 中是否含有斑茅血缘，回交代数越
多，斑茅血缘的检测结果的可靠性就越差。Alu-
like 简便，比 5S rDNA 重复性好，稳定性高，
与 5S rDNA 一样，也不能用于真假杂种鉴定。但
用于判断是否含有斑茅血缘，要比 5S rDNA 敏感
得多，结果更为可信。本研究显示，mSSCIR33
和 Alu-like 分析斑茅血缘的结果相同，但前者
到了高代品系斑茅特有带已经很弱，而后者基本
不变。这可能与 Alu-like 序列广泛存在于整个
斑茅基因组中有关，K.Alix 等[6]通过 Southern
杂交分析也证实了这一点。因此可以推断，Alu-
like 标记与后代分离关系不大，只要含有斑茅
血缘，就能扩增出斑茅特征带，且强弱变化不会
很明显。由此可见，Alu-like 标记可用于斑茅
杂交后代初步筛选，从实生苗开始就可以剔除大
量假杂种或不含斑茅血缘后代材料，大大地减少
相关工作量，节省人力、物力，从而加快斑茅种
质资源的有效利用。
参考文献
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CIMMYT Applied Molecular Genetics Laboratory,
Mecico， D.F 1992
Molecuar Identification of Genuine Hybrids from the Cross of
Saccharum and E. arundinaceus
劳方业等：斑茅杂交后代的分子鉴定
-11-
Lao Fangye, Fu Cheng, Chen Zhonghua, Chen Jianwen; Zhang Chuiming, Yang
Yehou, Deng Haihua
(Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute, Guangzhou 510316)
Abstract Molecular markers such as SSRs, 5S rDNA and Alu-like were used to identify genuine progeny from
Saccharum×E.arundinaceus and the backcross descendants in this study. The results showed that Microsatellite
marker analysis is a reliable method and mSSCIR33 is a good prime pair for hybrid identification among the
progenies. Although the 5S rDNA PCR is efficient in identifying F1 progeny, its low level of polymorphism
within these two species means it is not suitable for identifying hybrids from the backcross, it is not a reliable
method of verifying whether the pedigree of E.arundinaceum existed among the putative hybrids from the
backcross. Alu-like PCR method is fast and efficient in verifying whether the pedigree of E. arundinaceus existed
in putative hybrids, but it is not suitable for identifying hybrids, as Alu-like band is monomorphic.
Keywords Sugarcane; Erianthus arundinaceus; Hybrid Identification; SSR; 5S rDNA; Alu-like
(本篇责任编校：李金玉)
（上接第 16 页）种，早施肥管理，促使其早生
快发，为高产打基础；因生长中后期叶面积指数
大，应搞好中耕管理和培土防倒工作；充分利用
该品种早熟高糖的优良种性，适时早砍入榨，10
月下旬即可砍收，适榨期 11 月～2 月份。适宜
在全州中等以上肥力的水田和旱地推广种植。
4.4 盈育 91-59
新植出苗快苗势好，萌芽率高，但分蘖力
偏低，宿根发株一般，成茎中等，有效茎 75000
条/hm2 左右，全生育期生长旺盛，宿根性好。
新宿平均产蔗 115620 kg/hm2，比 CK1、CK2 分
别增产 4％和 11％；新宿平均糖分 11 月
11.08％、12 月 13.28％、1 月 15.35％、2 月
16.52％、全期平均 14.06％，比 CK1 减 0.62 个
百分点，比 CK2 增 0.94 个百分点；新宿平均含
糖 16260 kg/hm2，与 CK1 持平，比 CK2 增 19％。
结论：该品种属中晚熟、中高糖、中大茎、丰
产型种。产量及含糖量较高，糖分偏低，适榨
期间还原糖低，重力纯度高，蔗汁比高，但纤
维份偏低，抽穗开花早，1 月初砍收，适榨期 1
月～4 月。栽培上应适时下种，加强肥水管理，
满足最大生长需要，以获取较高产量；种植时
适当加大下种量，以保证有足够的有效茎；注
意螟虫、蓟马的危害，及时防治。建议在全州
水田、坝地示范推广种植。
4.5 德蔗 93-88
新植出苗率低，但分蘖力强，成茎率一般，
宿根分蘖发株一般，有效茎 82500 条/hm2 左右，
前中期生长快。新宿平均产蔗 98190 kg/hm2，
比 CK1 减 12％，比 CK2 减 6％；平均糖分 11 月
14.46％、12 月 16.06％、1 月 16.95％、2 月
17.76％，全期平均 16.31％，比 CK1、CK2 分别
增 1.63 和 3.19 个百分点；新宿平均含糖 16020
kg/hm2，与 CK1 持平，比 CK2 增 17％。结论：
该品种属特早熟、高糖、中茎、中产种。糖分、
含糖量较高，产量中等，且重力纯度高，还原
糖低，纤维份适中，蔗汁比高，是一个难得的
特早熟丰产型高糖品种。栽培上应适时早种，
适当加大下种量，保证有足够的基本苗；施足
底肥，早施重施追肥，早培土，控制后期无效
分蘖，满足最大生长量；加强宿根管理，提高
宿根产量；充分利用该品种早熟高糖的优良种
性，适时早砍入榨，10 月下旬即可砍收，适榨
期 11 月～1 月中旬。适宜在全州中等以上肥力
的水田和坝地推广种植。
(本篇责任编校：李金玉)