全 文 ：华北农学报·2010，25(3) :5 -8
收稿日期:2009 － 12 － 11
基金项目:国家科技支撑计划项目(2008BADB3B03)
作者简介:云 岚(1970 －) ，女，内蒙古呼和浩特人，副教授，博士，主要从事牧草种质资源与遗传育种研究。
通讯作者:云锦凤(1942 －) ，女，内蒙古土默特左旗人，教授，博士生导师，主要从事牧草种质资源与遗传育种研究。
45S rDNA基因在新麦草染色体上的分布
云 岚1，云锦凤1，王秀娥2，李海凤2，方宇辉2
(1．内蒙古农业大学 生态环境学院，内蒙古 呼和浩特 010018;
2．南京农业大学 农业部细胞遗传重点开放实验室，江苏 南京 210095)
摘要:分析 rDNA基因位点在染色体上的分布可以对新麦草染色体进行识别和分析其基因组特征。利用 FISH和
顺序 C-分带-FISH技术将 45S rDNA定位于新麦草细胞分裂中期染色体上，结果表明，45S rDNA在二倍体新麦草染色
体上有 6 个主要分布位点，另外几条染色体在两臂中部或长臂末端还显示出较弱的杂交信号，信号强度显示蒙农 4 号
新麦草基因组具有一定杂合性。分析确定新麦草的 45S rDNA 基因主位点分别位于 N1 染色体短臂末端、N3 染色体
短臂末端以及 N5 染色体短臂末端，推测这 3 对染色体是 NOR染色体。
关键词:新麦草;45S rDNA;C-分带;荧光原位杂交
中图分类号:S813． 9 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2010)03 － 0005 － 04
The Distribution of 45S rDNA in Chromosome of Russian Wild Ryegrass
YUN Lan1，YUN Jin-feng1，WANG Xiu-e2，LI Hai-feng2，FANG Yu-hui2
(1． College of Ecological and Environmental Science，Inner Mongolia Agricultural University，
Huhhot 010018，China;2． Cytogenetic Lab of Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)
Abstract:Chromosome and genome of Russian wild rye could be analyzed by the rDNA gene location． Chromo-
some was analyzed by sequential C-banding and 45S rDNA FISH． There were 6 main 45S rDNA sites located in the
end of short arms of 3 pairs of diploid chromosome． They were chromosome N1，N3 and N5，which can be speculated
as NOR chromosome． There were also weak hybridization signal on some long arm of chromosome． Heterozygosity could
be identified in Genome of variety Mengnong No． 4 by hybridization signal strength．
Key words:Russian wild rye;45S rDNA;C-banding;Fluorescence in situ hybridization
新麦草属(Psathyrostachys)包含不超过 10 个种，
该属植物的特征是具有基本的 N 染色体组［1］，2n =
14，是小麦族(Triticeae)中少有的二倍体属［2］。该属
植物具有抗旱、耐盐碱的习性，生长在砺质山坡、典型
草原和荒漠草原地区。新麦草(P． juncea)是该属中
唯一具有饲用价值的草种［3］，不仅具有较高的饲用价
值和生态价值，也具有较高的育种价值［4］，是改良禾
草及麦类作物的宝贵抗性遗传资源［5］。
前人对新麦草的细胞学研究多集中在染色体数
目与染色体结构分析方面，但在基因组分析中难以
发挥作用。C-分带和 FISH(荧光原位杂交)技术在
许多物种已被成功地用于进行染色体识别，进而研
究物种进化及不同物种基因组间的关系［6］。在真
核生物基因组中，rDNA 具有高拷贝数和串联重复
的特性，以 rDNA 作为探针进行的荧光原位杂交可
作为特定染色体识别的标记。目前已明确了小麦族
中小麦、黑麦、长穗偃麦草和灯芯偃麦草、中间偃麦
草和簇毛麦等多个物种 rDNA 基因位点分布特
征［7 － 10］。45S rDNA 是串联重复序列，它位于核仁
组织区(NOR)上，每个重复单位依次编码 18S、
5. 8S、28S rRNA［11］。本研究利用 FISH 和顺序 C-分
带-FISH技术将 45S rDNA定位于新麦草染色体上，
并探讨荧光原位杂交技术流程，为新麦草基因的物
理定位提供技术基础。
1 材料和方法
1． 1 试验材料
以新麦草的 2 个二倍体品种山丹新麦草和蒙农
6 华 北 农 学 报 25 卷
4 号新麦草为材料，种子采自内蒙古农业大学牧草
试验站。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 根尖细胞染色体制片 取当年收获饱满种
子，置于垫双层滤纸的培养皿中，于 25℃培养箱中
发芽，待初生根长 2 cm 时移入 28℃培养箱升温处
理 2 h，取根尖于 0℃冰水预处理 24 h，吸干水分于
卡诺氏液固定 2 h，45%醋酸软化 5 ～ 10 min 后切取
分生组织直接压片。相差显微镜下镜检，液氮冰冻
揭片。
1． 2． 2 标记探针 45S rDNA由南京农业大学细胞
遗传研究所王秀娥教授提供。杂交程序参照 Jiang
和陈佩度等［12，13］的方法。利用缺口平移法用荧光
素 Fluorescein -12-dUTP标记 45S rDNA探针。
1． 2． 3 原位杂交及信号检测 脱水后制片浸泡在
78℃的 70% Formamide in 2 × SSC 中变性 70 s，入
－ 20℃的 70%，95%，100%乙醇脱水 5 min，气干。
每张制片反应总体积 15 μL，其中 DNA 探针 2． 5
μL，100℃下变性 13 min，－ 20℃乙醇冰浴 10 min。
每张染色体制片加 15 μL 杂交液，盖 20 cm × 20 cm
盖玻片，37℃过夜。分别在 2 × SSC、50% FA 中洗脱
未杂交的 DNA探针。染色液为每张制片 500 μL的
1 × PBS加入 0． 6 μL PI，混匀染色 5 min，在 1 × PBS
中洗涤 4 ～ 5 次，气干，滴 6 μL 的 VECTASHIELD
胶，盖上盖片，在 Olympus BX60 荧光显微镜下观察，
并用 Spot Cooled CCD系统照相。
1． 2． 4 染色体 C-分带与原位杂交 C-分带过程参
照 Gill等［14］的方法，脱水干燥后的制片分别经 0． 2
mol /L HCl 60℃处理 2． 5 min、Ba(OH)2 过饱和溶液
室温下 7 min、2 × SSC 60℃处理 60 min，转入用1 /15
mol /L的 2 份 Na2HPO4 和 1 份 KH2PO4 缓冲液稀释
的 Giemsa染液(浓度为每毫升缓冲液加 1 滴染液)
中染色 2 ～ 4 h。蒸馏水冲洗后气干，滴二甲苯，在
Olympus BH2 显微镜下观察并照相。经 Giemsa 染
色的制片脱色后再进行原位杂交及信号检测。
2 结果与分析
2． 1 45S rDNA在新麦草染色体上的分布特点
FISH结果显示(图 1-A、1-B) ，45S rDNA在二倍
体新麦草染色体上有 6 个主要分布位点，均位于染
色体端部，且各位点信号均较强，说明 45S rDNA 在
二倍体新麦草基因组中的拷贝量较大。2 品种材料
存在一定差异，山丹新麦草染色体上 6 个 45S rDNA
位点信号均很强(图 1-A) ，蒙农 4 号新麦草染色体
6 个位点中，有杂交信号的最短一对染色体上，其中
一条染色体末端杂交信号较弱，如图 1-B 中灰色箭
头所示，显示其基因组具有一定杂合性。除了以上
6 个主要位点外，其中几条染色体在两臂中部或长
臂末端还显示出较弱的杂交信号，如图 1 中白色箭
头所示。说明新麦草染色体上，除核仁组织区主位
点外的区域也有 45S rDNA 互补的串联重复序列存
在，但拷贝数较小。
A．山丹新麦草(2n = 14) ;B．蒙农 4 号新麦草(2n = 14)。
A． var． Shandan(2n = 14) ;B． var． Mengnong No． 4(2n = 14)．
图 1 45S rDNA 荧光原位杂交
Fig． 1 45S rDNA FISH
箭头示染色体上杂交信号;A． C-分带;B． 45S rDNA荧光原位杂交。
Arrows indicate the hybridization signal;A． C-Banding;B．45S rDNA-FISH．
图 2 新麦草染色体顺序 C-分带和 45S rDNA-FISH
Fig． 2 Sequential C-Banding and 45S rDNA-FISH
patterns of P． juncea
2． 2 新麦草染色体组 45S rDNA定位
为了确定 45S rDNA位点分布与染色体具体身
份间的对应关系，进一步进行顺序 C-分带与原位杂
交，结果如图 2。经 Giemsa 染色后新麦草每条染色
体都出现至少一条 C-分带，7 对染色体可根据各自
独特的带型而彼此区分开来。新麦草 C-分带带型
特征表现为以端带和近端带为主，部分染色体有中
间带，很少有着丝粒带和近着丝粒带。带纹在不同
材料间存在一定变异，如 N4 染色体短臂上的中间
带在不同材料就具有多态性。同一物种 C-分带具
有多态性和杂合性这一现象在苜蓿(Medicago sativa
L．)、雀麦(Bromus riparius Rehm)等 C-分带研究中
也有报道［15，16］。本研究与 Wei［17］以及王秀娥［18］的
P． juncea分带结果相似，均以显现端带为主并有一
定数量的中间带纹。但染色体在排列顺序上有差
异，其中 N1 与 Nj3、N5 与 Nj4、N6 与 Nj6 类似外，其
3 期 云 岚等:45S rDNA基因在新麦草染色体上的分布 7
他染色体带型均有或多或少的差异，推测是由于所
用的 P． juncea 材料不同而造成的带型多态性。
经比较鉴定可以将 3 对 45S rDNA 位点初步定
位于新麦草的 3 对染色体上(图 2 箭头所示)。经
染色体排序，确定新麦草的 45S rDNA 基因分别位
于 N1 染色体短臂末端，N3 染色体短臂末端，以及
N5 染色体短臂末端，且从杂交信号强度来看序列片
段比较大。同时由 C-分带结果可见，这三对染色体
在显示杂交信号的位置也显示 C-带，这表明 N1、N3
和 N5 染色体短臂末端的 C-带可能是核仁组织区
带，推测这 3 对染色体是 NOR染色体。
3 讨论
由于不同物种的 C-分带带型有明显的差异，可
用做鉴别物种的依据，染色体 C-带带型的多态性和
杂合性现象普遍存在，新麦草是异花授粉植物，其
C-分带显示出的多态性和杂合性也反映了该物种的
这一遗传特性，表明染色体分带可在一定程度上显
示出微小的种内变异。Wei研究来自不同地理区的
10 个新麦草居群 C-带时认为，新麦草 C-带几乎在
所有水平都存在多形性，包括不同地区间、同一地区
不同居群间、同一居群不同个体间、同一个体的同源
染色体间。但这并不影响染色体的识别。
高等植物中，核糖体是合成蛋白质的场所，构成
核糖体的主要成分是 rRNA和蛋白质的复合物。编
码 rRNA的基因有两种，即 45S rDNA 和 5S rDNA。
45S rDNA 的重复单位依次编码 18S、5. 8S、28S
rRNA。18S． 26S rRNA多基因家族与细胞分裂核仁
组成区(NOR)的形成密切相关［19］。一般在基因组
中有 1 对或几对染色体具此位点，由它构成的核仁
组织区，在形态上一般表现为染色体的次缢痕［20］。
在小麦族植物小麦、簇毛麦、大麦等的基因组中，45S
rDNA 都位于次缢痕上，即核仁组织区(NOR)
上［21］。该基因被认为在植物进化过程中相当保守，
与核仁的形成直接相关，它在染色体上的物理位置
也比较保守，一般位于染色体的次缢痕处。例如小
麦的祖先种和它们衍生的多倍体种在经历了长时间
的平行进化后 rDNA 的位置仍然保守［22］。但也有
报道显示，同属的二倍体物种间的 rDNA 位点数有
较大的变化。例如稻属(Oryza)的 6 个二倍体种的
rDNA位点数从 1 对到 3 对不等，rDNA 位点所在的
染色体位置和 rDNA 重复单位的拷贝数也出现变
化［23］，甚至在亚种间和不同的栽培种间也有表现出
差异的情况。栽培稻的粳稻(O． sativa ssp． japonica)
只有 1 对 45S rDNA位点，而籼稻(O． sativa ssp． indi-
ca )则有 2 对位点［24］。
本试验结果表明，新麦草基因组中主要在 3 对
染色体上具有 45S rDNA 位点，分别位于 N1、N3 和
N5 染色体短臂末端，可以初步推测这 3 对染色体是
NOR染色体。同时也说明新麦草染色体的次缢痕
可能位于染色体末端，属端 NOR 染色体。端 NOR
染色体类型来源可能是通过染色体结构变异如缺
失、易位等行为，将原始物种染色体随体丢失掉形
成［25］。这种染色体类型虽然较为少见，但也并非唯
一情况。徐川梅［26］将 45S rDNA定位到栽培一粒小
麦(T． monococcum)的 1A和 5A染色体的短臂末端。
其他科属如 Zhang 和 Sang 用荧光原位杂交对芍药
属植物(Peonia)的研究表明，rRNA基因位于染色体
的端部，并且存在易位现象［27］。因对 2 品种新麦草
材料进行 C-分带及 FISH过程中一直未见到随体存
在，故推测新麦草染色体可能属于端 NOR 染色体。
但也不排除这 2 个品种材料具有特殊性，这 3 对染
色体也可能就是 Wei所指出的 D、F和 G染色体，因
miunte随体丢失而观察不到，因此这一结论还有待
用更多材料进一步验证。
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