全 文 ：华北农学报·2013，28 ( 1 ) : 67 -69
收稿日期:2012 － 11 － 11
基金项目:2010 年教育部科学研究重点项目(210043) ;内蒙古自治区自然基金博士基金项目(2010BS0402)
作者简介:李景环(1972 －) ，女，内蒙古赤峰人，副教授，博士，主要从事植物分子生物学的教学与科研工作和牧草育种科研工作。
通讯作者:云锦凤(1941 －) ，女，内蒙古土默特左旗人，教授，博士生导师，主要从事牧草育种的科研与教学工作。
加拿大披碱草 45S rDNA定位
李景环1，何慧敏1，云锦凤2
(1．内蒙古师范大学 生命科学与技术学院，内蒙古 呼和浩特 010022;2．内蒙古农业大学 生态环境学院，内蒙古 呼和浩特 010019)
摘要:以加拿大披碱草为材料，通过染色体原位杂交的方法，确定加拿大披碱草的 45S rDNA在染色体上的位置，
旨在为加拿大披碱草育种提供依据。结果表明，45S rDNA在加拿大披碱草的染色体上检测出 4 个位点(绿色) ，它们
分别位于第 2 对染色体短臂末端和第 5 对染色体短臂次缢痕上，即核仁组织区(NOＲ) ，且杂交信号强弱较一致。
关键词:加拿大披碱草;荧光原位杂交;核型分析;45S rDNA
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2013)01 － 0067 － 03
Karyotype Analysis and Physical Location of 45S rDNA in Elymus canadensis
LI Jing-huan1，HE Hui-min1，YUN Jin-feng2
(1． College of Life Science and Technology，Inner Mongolia Normal University，Huhhot 010022，China;
2． College of Ecology Environment，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010019，China)
Abstract:Localization of 45S rDNA on Elymus canadensis chromosome was studied by fluorescence in situ hy-
bridization(FISH)of chromosome on root tip． The results showed that four hybridization sites were detected at the
end of short arm of E． canadensis chromosome 2 and in secondary constriction(nucleolar organizing region)on chro-
mosome 5，which were the location of 45S rDNA． And the signal of hybridization were the same intensity．
Key words:E． canadensis;Chromosome karyotyping;FISH;45S rDNA
加拿大披碱草(Elymus canadensis)属禾本科
(Poaeeae)小麦族(Tritice-ae)披碱草属(Elymus) ，多
年生草本植物，集中分布于美国落基山脉以东和北
美地区，云锦凤教授 1984 年从北美洲引进，在内蒙
古农业大学牧草实验站进行引种栽培试验［1 － 4］。加
拿大披碱草具有适应性强，耐盐碱、抗旱、抗寒、抗风
沙，适口性好等优良特性［5］，在草原植被恢复，控制
侵蚀和提供野生动物栖息地等方面也具有重要作
用［6］，对环境胁迫和生物胁迫均具有很强的适应
性，综合性能好，是牧草遗传改良的重要资源［7 － 8］。
为了科学利用加拿大披碱草，培育牧草新品种，本研
究通过染色体原位杂交的方法检测 45S rDNA 在加
拿大披碱草染色体上的位置，以便在细胞和分子水
平上为加拿大披碱草的分类提供依据，为杂交亲本
的选择提供证据，为牧草新品种的培育奠定基础。
1 材料和方法
1． 1 材料和试验地概况
披碱草种子 2008 年采集于内蒙古农业大学牧
草试验地。试验地为沙壤质暗栗钙土，pH 值 7． 8 ～
8． 2，肥力适中，具有灌溉条件。45S rDNA 探针由南
京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室细
胞研究所赠送。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 染色体标本的制备材料培养及处理 将加
拿大披碱草种子置于 25 ℃的培养箱内萌发，待根尖
长到 1． 5 ～ 2 cm 时，取其根尖放在盛有冰水混合物
的小离心管中，放于 4 ℃冰箱内 24 h，然后在卡诺固
定液中固定 24 h，再置于 4 ℃冰箱内备用。
染色体压片将加拿大披碱草根尖经过一定的预
处理(用冰水混合物)、固定(卡诺固定液)、软化(用
45%醋酸)、染色(用 1%醋酸洋红染液)之后，置于
载玻片中央，盖上盖玻片，用解剖针或镊子轻敲盖玻
片，直至染色体分散良好。
镜检(电子显微镜 40 倍观察) ，并选择染色体分
散良好的玻片，置于 － 20 ℃冰箱。第 2 天(约 24 h
后)冰冻揭片，之后将玻片浸在无水乙醇中脱水
20 ～ 30 min，常温晾干，备用。
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1． 2． 2 45S rDNA探针的标记 本试验中采用缺刻
平移法标记探针，即采用切口平移法标记探针。这
一方法是利用 DNA 聚合酶Ⅰ的 5→3的聚合酶活
性，5→3的外切酶活性以及 DNaseⅠ的水解活性相
结合进行的［9］。
45S rDNA 探针的标记反应体系为:灭菌双蒸
水，10 × DNA酶 Buffer，DNaseⅠ，45S rDNA，绿荧光，
dNTP，DNA 聚合酶Ⅰ，共 50 μL。在 16 ℃下反应
2 h，加 EDTA终止反应，放到 － 20 ℃冰箱，备用。
1． 2． 3 原位杂交 ①探针变性(探针由双链变为
单链) :将探针配制成杂交液:即甲酰胺 7． 5 μL、20
× SSC 1． 5 μL、鲑鱼精 DNA 0． 5 μL、45S rDNA探针
3 μL、50% DS 3 μL 等，将含有 45S rDNA 杂交液于
105 ℃下变性 13 min 后立即放到 － 20 ℃冰箱 10
min以上，备用。
②玻片上染色体变性(染色体 DNA 变成单
链) :将含有制好的加拿大披碱草根尖染色体标本
放到盛有 70%甲酰胺的脱水缸里，于 78 ℃水浴下
变性 70 s;立即用 － 20 ℃的梯度乙醇溶液脱水，即
依次是 70%乙醇、95%乙醇和 100%乙醇，将样品洗
涤脱水，每次洗涤 5 min;标本在空气中干燥 30 min
以上。
③原位杂交:将步骤①中准备好的杂交液吸取
15 μL，加到步骤②中准备好的玻片上，盖上盖玻片，
放在 37 ℃培养箱过夜(至少 6 h)。
1． 2． 4 漂洗 将杂交后的染色体制片脱去盖玻片，
在 42 ℃ 2 × SSC溶液中洗涤 2 次，每次洗涤 5 min;
之后在常温 1 × PBS溶液中洗涤 1 次，5 min，洗去未
杂交的探针DNA。最后，将玻片置于空气中自然干燥。
1． 2． 5 染色封片镜检 用 PI(碘化丙啶)染染色体
底色，用树胶封片。并在荧光显微镜下观察，选择染
色体清晰的细胞照相［10］。
2 结果与分析
从图 1，2 可知，加拿大披碱草共有 28 条染色
体，其中 4 条染色体有荧光标记(图 1，2 染色体上发
亮的记号) ;染色体参数见表 1，最长染色体的长度
为 16． 82 μm;最短染色体长度为 5． 01 μm;染色体
组的平均长度为 10． 90 μm;从染色体的臂率分析得
知，其中 m类型的染色体有 11 对，sm类型的染色体
有 3 对，其核型公式为:2n = 4x = 28 = 22m(2SAT)+
6sm;45S rDNA在加拿大披碱草的染色体上检出 4
个位点，它们分别位于第 2 对染色体短臂末端和第
5 对染色体短臂上，即核仁组织区(NOＲ) ，且杂交信
号强弱较一致。
图 1 加拿大披碱草 45S rDNA原位杂交图
Fig． 1 Fluorescence in situ hybridization
of 45S rDNA in E． canadensis
表 1 加拿大披碱草染色体核型参数
Tab． 1 Karyotype parameters of E． canadensis
染色体序号
No． of chromosome
绝对长度 /μm
Absolute length
相对长度 /%
Ｒelative length
臂比
Ｒatio of arm
染色体类型
Type of chromosome
01 5． 68 + 11． 14 = 16． 82 11． 02 1． 96 sm
02 6． 59 + 7． 96 = 14． 55 9． 53 1． 21 m
03 5． 45 + 8． 87 = 14． 32 9． 38 1． 63 m
04 5． 01 + 8． 19 = 13． 20 8． 65 1． 63 m
05 4． 78 + 7． 73 = 12． 51 8． 20 1． 62 m
06 5． 46 + 6． 59 = 12． 08 7． 92 1． 21 m
07 5． 45 + 6． 14 = 11． 59 7． 59 1． 13 m
08 5． 00 + 6． 14 = 11． 14 7． 30 1． 23 m
09 3． 87 + 6． 14 = 10． 01 6． 56 1． 59 m
10 3． 87 + 5． 00 = 8． 87 5． 81 1． 29 m
11 2． 96 + 5． 23 = 8． 19 5． 37 1． 77 sm
12 3． 18 + 4． 09 = 7． 27 4． 76 1． 29 m
13 1． 82 + 5． 23 = 7． 05 4． 62 2． 87 sm
14 2． 05 + 2． 96 = 5． 01 3． 28 1． 44 m
1 期 李景环等: 加拿大披碱草 45S rDNA定位 69
图 2 加拿大披碱草核型图
Fig． 2 The karyotype of E． canadensis chromosome
3 结论与讨论
本研究结果表明，加拿大披碱草染色体核型公
式为 2n = 4x = 28 = 22m(2SAT)+ 6sm;45S rDNA 在
加拿大披碱草的染色体上检出 4 个位点(亮点) ，它
们分别位于第 2 对染色体短臂末端和第 5 对染色体
短臂次缢痕上。
探针标记的成败主要在于控制 DnaseⅠ的量。
DnaseⅠ活性太低则不能在 DNA 上有效地打开切
口，使荧光标记的碱基掺入不充分;DnaseⅠ活性太
高则会将 DNA 模板切碎，使其不能进行标记反应。
一般按 1:10 000 稀释 DnaseⅠ就可以得到平均长度
约为 600 bp 的探针。细胞染色体杂交常用较长的
探针以增加杂交信号。
45S rDNA在很多植物中序列保守性很强，但是
其所在染色体的位置却有所不同。
本研究通过荧光原位杂交、核型分析等技术确
定了加拿大披碱草染色体数目以及 45S rDNA 所在
的染色体位置。即 45S rDNA 在加拿大披碱草的染
色体上检出 4 个位点(亮点) ，它们分别位于第 2 对
染色体短臂末端和第 5 对染色体短臂次缢痕上，且
杂交信号强弱较一致。
本研究结果有助于在细胞水平上以及分子水平
上对加拿大披碱草进行更系统的研究，为加拿大披碱
草栽培管理、繁殖与育种提供更科学和直观的依据，
同时也为禾本科小麦族牧草的遗传育种奠定基础。
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