全 文 ：黄斑姜中期染色体 CPD染色和
45S rDNA荧光原位杂交分析
赵丽娟1 , 2 ,3 , 　　郭　敏1
(怀化学院 1.生命科学系;　2.民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室;
3.湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室 , 湖南 怀化　418008)
摘　要:为了对黄斑姜 (Z ingiber flavo -maculatum S.Q.Tong.)的染色体进行识别并对该物种基因组的结构进行
初步研究 , 利用PI和 DAPI 组合 (CPD)染色和45S rDNA探针荧光原位杂交对中期染色体进行了分析.结果显示 , 黄
斑姜具有 2 对 45S rDNA 位点 , 分别位于第 3、 4 号染色体的短臂 , 对应于相应染色体上的显著的 CPD 带区.基于
rDNA位点和染色体测量数据 , 建立了黄斑姜的准确而详细的分子细胞遗传学核型.黄斑姜核型公式为 2n=2X=22=
12m+6sm+4st (SAT), 其核型不对称性为2B型.
关键词:黄斑姜;　核型;　CPD染色;　45S rDNA;　荧光原位杂交
中图分类号:Q343　　　文献标识码:A　　　文章编号:1671-9743 (2011)02-0045-03
收稿日期:2011-02-10
基金项目:湖南省教育厅一般项目 (07C503).
作者简介:赵丽娟 (1979-), 女 , 湖南溆浦人 , 怀化学院讲师 , 硕士 , 主要研究遗传学.
　　黄斑姜 (Zingiber flavo -maculatum S.Q.Tong)为
姜科 (Zingiberaceae)姜属 (Zingiber Boehm.)植物 .
我国现有的黄斑姜大都产云南南部的勐腊 、 景洪[ 1] ;
生于海拔 580—1 500 米的常绿阔叶林下 , 花期 7—8
月 , 果期 9—12月 .迄今为止 , 对黄斑姜的研究大多
是形态学 、 栽培技术 、 营养价值和保健作用等方
面[ 2-3] , 核型分析 、 DNA 物理定位和基因组结构分析
的报道很少 , 因此对其进行分子细胞遗传学研究十分
必要.
本研究取新生根尖分生区作为材料 , 采用去壁低
渗火焰干燥制片法[ 4] 制备形态良好的有丝分裂中期染
色体 , 并采用改良的 CPD染色技术和 45S rDNA 荧光原
位杂交技术对黄斑姜的染色体进行分析 , 为识别黄斑
姜的染色体提供新的标记 , 并结合染色体常规测量 ,
建立其分子细胞遗传学核型.
1　实验材料与方法
供试 材料黄 斑姜 (Zingiber flavo -maculatum
S.Q.Tong), 由中科院昆明植物研究所黄老师提供.
45S rDNA 探针来自番茄基因组 , 由美国 Nebraska
大学Arumuganathan教授提供.45S rDNA 片段长度为 9.1
kb , 包括 5.8S , 18S 和 25S 亚单位和非转录的间隔区
(IGS), 克隆载体为 pUC18 , 酶切位点为 Kpn I.
有丝分裂染色体用根尖按 Song等[ 4] 的方法制备 .
将黄斑姜置于沙土中于温室中培养 , 待根长到 1 ～ 1.5
cm时剪取根尖 , 用α—溴代萘室温下处理 1 h.用甲醇:
冰醋酸 (3:1)于 4℃固定过夜.固定的根尖水洗后用
1%的 纤 维 素 酶 (Cellulase RS)、 1%的 果 胶 酶
(Pectolyase Y23)及 1%的蜗牛酶 (Cytohelicase)的混合
液 (用柠檬酸缓冲液配制 , pH 4.5)于 28℃酶解 6 h.
火焰干燥法制片.染色体制片置-20℃贮存备用.
CPD 染色参照佘朝文等的方法进行[ 5] .观察在
Olympus BX60 荧光显微镜下进行 , 用紫外光滤色片
(UV)观察 DAPI染色 , 用绿色激发滤色片 (WG)观察
PI染色 .利用冷凝 CCD 照相系统 (Cool SNAP EZ ,
Photomatrics)和MetMorph软件拍摄和合成照片.
荧光原位杂交在已进行 CPD 的染色体装片上进
行.原位杂交和信号检测按佘朝文的方法[ 5] 进行.染色
体用 DAPI复染 , 用 Olympus BX60 荧光显微镜观察染色
体和杂交信号 , 用冷凝 CCD照相系统 (Cool SNAP EZ ,
Photomatrics)和MetMorph软件拍摄和合成照片.
图片处理和染色体测量使用 Adobe Photoshop软件
进行 , 核型分析参照李懋学和陈瑞阳[ 6] 的方法进行.
2　结果
黄斑姜染色体经 CPD 染色后 , 有两对染色体出现
了显著的红色 CPD带纹 (图 1A , 白色箭头所示), 说
明该染色体区段为GC丰富区[ 5] , 通过观察多个分裂相
发现 , 这两对染色体具有随体 , CPD带位于短臂的次
缢痕近端一侧.相继的 45S rDNA FISH显示 , 黄斑姜具
有2 对 45S rDNA 位点 (图 1B , 白色箭头所指绿色信
号), 对应于相应染色体上的显著的 CPD带区 , 而且
第 30卷第 2 期　　 　 　　　　　　怀化学院学报　　 　 　　　　　　Vol.30.No.2
2 0 1 1 年 2 月　 　 　 　 　JOURNAL OF HUAIHUA UNIVERSITY 　 　 　 　 　 　Feb., 20 11
DOI :10.16074/j.cnki.cn43-1394/z.2011.02.013
CPD带和 FISH信号的大小和强度上也是对应的.
图 1　黄斑姜染色体的 CPD显带 (A)、 45S rDNA荧光原位杂交 (B)、 核型 (C)和核型模式图 (D)
表 1　黄斑姜的核型分析参数表
编号
No.
相对长度 (%)
Relative Length(S+L)=T
臂比
Arm Ratio(L S)
类型
Type
1 3.24+9.02=12.26 2.78 sm
2 4.2+7.37=11.57 1.76 sm
3 2.03+8.77=10.10 4.31 st＊
4 1.65+8.20=9.85 4.96 st
5 4.32+5.49=9.81 1.85 sm
6 3.43+6.35=9.78 1.28 m
7 3.62+5.21=8.83 1.43 m
8 4.00+4.38=8.38 1.10 m
9 2.86+4.38=7.24 1.53 m
10 2.80+3.18=5.98 1.14 m
11 2.41+3.05=5.46 1.26 m
＊随体长度未计算在内.
　　基于 CPD带和 45SrDNA FISH信号 , 结合常规的染
色体测量 (表 1), 对黄斑姜的染色体进行区分 、配对 ,
建立了体现它们染色体基本形态特征 、 CPD带及 45S
rDNA位点分布情况的分子细胞遗传学核型 (图 1C).
核型分析结果表明 , 显著的 CPD带和对应的 45S rDNA
杂交信号分别位于第 3 、 4对染色体的短臂.黄斑姜的
核型公式为 2n=2x=22=12m+6sm+4st (SAT).根据
染色体长度进行分类的方法[ 6 , 7] , 最长和最短染色体的
比值是 2.25 , 臂比大于 2 的染色体的比例为 0.27 , 因
此核型不对称性属 2B型.核型模式图见图 1D.
3　讨　论
本研究中采用了 CPD染色对黄斑姜的染色体进行
分析.CPD染色能够精确的显示植物基因组的 GC丰富
·46· 怀化学院学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　2011 年 2月
的 45S rDNA 位点[ 5] .我们的结果表明 , 所有的 45S
rDNA杂交信号都出现在相应染色体位置的 CPD带区 ,
说明 CPD染色能有效地对 45S rDNA 进行物理定位.黄
斑姜与在大麦 、四棱豆 、 番茄等物种上检测到非 rDNA
CPD带不同[ 8] , 其 CPD带只专一地显现在核仁组织区
(NOR).
已有的研究报道了姜属的其他种植物的染色体数
目[ 9 , 10] , 但并没有进行核型分析 .已报道的姜属植物
的染色体都为 2n=22[ 9 , 10] .Mahautyh (1970)认为姜科
植物姜属的染色体基数为 11 , 而且几乎全是二倍
体[ 11].我们的结果显示黄斑姜也是二倍体 , 其染色体
为 2n=22 , 其染色体基数也为 11.
我们的实验对黄斑姜染色体的 45S rDNA 位点进行
了FISH 定位 , 明确其具有 2 对 45S rDNA 位点 .45S
rDNA FISH不仅能够准确识别植物的 rDNA 位点 , 而且
其杂交信号还可以作为标记用于核型分析中染色体的
精确识别 , 而且通过同一属不同物种的 45S rDNA 比较
定位分析 , 还以探讨物种间的进化关系[ 12] .因此我们
的研究对进一步从分子细胞遗传学水平研究姜属的基
因组及物种间的进化关系具有重要意义.
姜属植物的细胞遗传研究材料常取自室外培养的
植物 , 较难获得理想的染色体装片 , 这也是姜属植物
染色体研究进展缓慢的原因之一 .本实验的染色体制
备方法对其他姜属植物的细胞遗传学研究也具有重要
的参考价值.
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Analysis of Mitotic Metaphase Chromosomes of Zingiber flavo-maculatum
using CPD Staining and FISH with 45S rDNA Probe
ZHAO Li-juan1, 2 , 3 , 　　GUO Min1
(1.Department of Life Sciences;　2.Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province;
3.Key Laboratory of Xiangxi Medicinal Plants and Ethnobotany of Hunan Higher Education , Huaihua University , Huaihua , Hunan 418008)
Abstract:In order to identify the chromosomes of Zingiber flavo -maculatum S.Q.Tong.and reveal preliminarily the
genome organization , CPD (combined PI and DAPI)staining and FISH with 45S rDNA probe were applied to analyze the mitotic
metaphase chromosomes.Two pairs of 45S rDNA sites were detected on the short arms of the chromosome 3 and 4 , respectively ,
corresponding to the prominent red CPD bands.Themolecular cytogenetic karyotypes of Zingiber flavo-maculatumwas constructed
based on the data of rDNA and chromosome measurements.The karyotype formula is 2n=2X=22=12m+6sm+4st (SAT)and
the karyotype asymmetry belongs to 2B type.
Key words:Zingiber flavo -maculatum ;　karyotype;　CPD staining;　45S rDNA;　 fluorescence in situ
hybridization (FISH)
·47·第 30 卷第 2 期　　　　赵丽娟 , 郭 敏:黄斑姜中期染色体 CPD染色和 45S rDNA 荧光原位杂交分析