全 文 ：收稿日期:2007-03-13
作者简介:刘洋(1981-), 男(汉族),辽宁鞍山人 , 硕士研究生;吴立军(1945-),男(汉族), 黑龙江肇东人 , 教授 ,主要从
事中药和天然产物活性物质的研究以及采用生物技术进行有效活性成分生产的研究 , E-mail w ulijun-111@hot-
mail.com。
文章编号:1006-2858(2008)04-0282-04
金钱草多糖的分离纯化与结构研究
刘　洋1 , 吴兆华2 , 高慧媛1 , 吴立军1
(1.沈阳药科大学 中药学院 ,辽宁 沈阳 110016;2.牡丹江医学院 药学系 , 黑龙江 牡丹江 157001)
摘要:目的 提取分离金钱草多糖 , 并研究其结构性质。方法 采用 Sephacryl S-300 HR色谱法分离
纯化金钱草多糖 ,HPGPC 、IR、TLC 和 GC 测定多糖 Fb 的结构。结果 从金钱草分离得到 6 种多糖
Fa、Fb 、 Fc、Fd、Fe、Ff , 其中 Fb 的相对重均分子质量为 26 372 ,由木糖 、半乳糖 、甘露糖 、鼠李糖和半
乳糖醛酸组成 ,红外光谱数据显示 Fb具有多糖的特征吸收峰 ,是一种酸性多糖。结论 6 种多糖均
为首次从金钱草中分离得到。
关键词:金钱草;多糖;成分分离;结构鉴定
中图分类号:R 284.2　　　文献标志码:A
　　金钱草为报春花科植物过路黄(Lysimachia
christ inae Hance)的干燥全草 ,具有清热利湿 、通
淋 、消肿之功效 ,是治疗肝胆结石 、尿路结石等症
的常用中药[ 1] 。其化学成分已有报道 ,主要为黄
酮类化合物[ 2] ,但有关其多糖分离纯化方面的研
究尚未见报道 。大量的药理和临床研究表明 ,多
糖类化合物是一种免疫调节剂 ,它能激活免疫细
胞 ,调节机体的免疫功能 ,而对正常细胞没有毒副
作用 。到目前为此 ,已有 300 多种多糖类化合物
从天然产物中被分离提取出来 ,其中从植物中提
取的水溶性多糖最为重要 。本文作者主要对金钱
草的多糖进行分离纯化及结构研究 ,为进一步开
发和利用金钱草提供理论依据 。
1　仪器与材料
101 2 真空干燥厢(天津鑫洲科技有限公
司), UV 1200 紫外光谱仪(日本 Shimadzn 公
司), LD5 2A 型低速离心机(北京医用离心机
厂),HH 2型数显恒温水浴锅(江苏省常州国华
电器有限公司),Brucker Is 55型红外光谱仪(瑞
士Bruker 公司), HL 2 恒流泵(上海沪西仪器
厂), RE 52A 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器
厂), JD60 4多功能电子天平(沈阳龙腾电子有限
公司),Z 系列层析柱(16 cm ×100 cm ,上海锦华
层析设备厂), LGJ 18型冻干机(北京四环科学仪
器厂),Waters 510高效液相色谱仪 、Waters 401
示差折光检测器(美国 Waters 公司), TSKG3
000SWXL 多糖专用凝胶柱(日本 TOSOH 公司),
Agilent毛细管气相色谱仪(附 FID检测器 ,美国
Agilent公司)。
DB1301石英毛细管柱(30 m ×0.53 mm ,美
国 Pharmacia公司),Dm 透析袋(北京经科宏达公
司 , 截 留 相 对 分子 质 量 3 500), Sephacryl
S 300 HR 填 料 (美 国 Armerasham 公 司),
0.45 μm微孔滤膜(杭州科诺过滤器材有限公
司),单糖对照品(美国 Sigma 公司:D 葡萄糖 、
D 半乳糖 、D 岩藻糖 、L 鼠李糖 、D 阿拉伯糖 、
D 木糖 、D 果糖 、葡萄糖醛酸 、半乳糖醛酸),不
同相对分子质量的右旋糖苷对照品(中国药品生
物制品检定所 ,相对分子质量分别为:133 800 、84
400 、41 100 、21 400 、4 600),氯仿 、甲醇 、乙醇 、正
丁醇 、氯仿 、苯酚 、浓硫酸 、三氟乙酸 、硼氢化钠 、无
水吡啶 、乙酸酐 、氨水 、双氧水等均为国产分析纯
试剂 。
金钱草 、金钱草多糖浸膏由辽宁金丹药业提
供。金钱草由沈阳药科大学中药学院孙启时教授
鉴定为 Lysimachia christ inae Hance 。
2　方法与结果
2.1　蛋白质的去除
称取金钱草多糖浸膏 100 g 溶于 10 L 蒸馏
水中 ,加入氯仿和体积分数为 80 %的 Sevag 试剂
第 25 卷 第 4 期
2 0 0 8 年 4 月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
Journal of Shenyang Pharmaceutical University
Vol.25 　No.4　
Apr.2008 p.282　
DOI :10.14066/j.cnki.cn21-1349/r.2008.04.007
溶液 2 L ,剧烈振荡 20 ～ 30 min ,1 500 r·min-1离
心 10 min ,分去水层与溶剂层交界处的变性蛋
白 ,如此重复 10 次以上 ,直至紫外扫描没有出现
核酸(260 nm)和蛋白质(280 nm)的特征吸收峰
为止(见图 1)[ 3] 。
Fig.1　The UV spectrum of polysaccharides
2.2　色素的去除
向脱蛋白后的多糖液中加入氨水 ,调节 pH
值至 8 ,缓慢滴加体积分数为 30%的 H2O2 至浅
黄色 ,在 50 ℃水浴中放置 2 h 后放入透析袋中 ,
对自来水透析 48 h , 对蒸馏水透析 24 h[ 4] 。浓
缩 ,冷冻干燥 ,得白色金钱草粗多糖 200 mg 。
2.3　Sephacryl S 300 HR 凝胶柱层析纯化
取 150 mg 金钱草粗 多糖溶 于 20 mL
0.2 mol·L-1的 NaCl溶液中 , 0.45 μm 微孔滤膜
过滤 ,上 Sephacryl S 300 HR(100 cm ×1.6 cm)
层析柱 ,用 0.2 mol·L -1的 Nacl溶液进行洗脱 ,
10 mL/管 ,流速 3 mL·min-1 。苯酚 硫酸法在
490 nm 检测[ 5] ,以洗脱管数对吸光度值作图(见
图 2), 合并相 同组分 , 再分别 经 Sephacryl
S 300HR层析柱反复层析至洗脱曲线为单一对
称峰 ,各组分透析除盐 ,浓缩 ,冷冻干燥得金钱草
多糖 Fa 、Fb 、Fc 、Fd 、Fe、Ff。
Fig.2　Elution curve of polysaccharides with Sephacryl S-
300 HR chromatography eluant(0.2 mol·L-1NaCl , Flow
rate 3 mL·min-1)
2.4　多糖纯度及分子质量测定
取1 mg Fb加 1 mL 超纯水配制成 1 g·L-1
的样品液 , 采用 HPGPC[ 6] 法测试 。色谱条件:
waters 510高效液相色谱仪 ,Waters 401示差折
光检测器 ,TSKG3 000SWXL 多糖专用凝胶柱 ,流
动相为超纯水 ,流速为 1 mL·min-1 ,柱温 25 ℃,
进样量 20μL。经过 HPGPC检测显示 Fb为单一
对称峰(见图 3),表明其为单一组分。
Fig.3　HPLC spectrum of Fb
　　取不同相对分子质量的右旋糖苷对照品(相
对分子质量分别为:133 800 、84 400 、41 100 、21
400 、4 600)各 2 mg 加2 mL流动相配制成 1 g·
L
-1的标准溶液 ,采用同样色谱条件进样测定。
用GPC 软件系统进行数据处理 ,得不同相对分子
质量的右旋糖苷对照品标准曲线 ,回归方程:log
(M W)=-0.003 4t R +11.43 , 相关系数 r=
0.996 7。金钱草多糖 Fb的相对重均分子质量为
26 372 ,相对数均分子质量为 13 841 ,相对 Z 均分
子质量为 68 341 ,相对黏均分子质量为 22 649 。
2.5　红外光谱分析
取1 mg Fb用溴化钾压片 ,在 Brucker Is 55
型红外光谱仪上测定。3 419 cm-1处宽峰 ,是-
OH的伸缩振动 , 2 928 cm-1是多糖分子C H 的
伸缩振动 ,是多糖类的特征峰 ,1 730 cm-1是糖醛
酸的特征吸收峰 ,1 632 cm-1是 C=O 伸缩振动 ,
1 384 cm-1 是 C H 的变 角 运 动引 起 的 ,
1 139 cm-1为多糖分子中 C —O —C 环醚键的吸
收峰 ,870 cm-1处为甘露糖的特征吸收峰 。
2.6　纸色谱分析
取 20 mg Fb放在安瓿中 ,加入 2 mol·L-1三
氟乙酸(TFA)1 mL ,封管后 110 ℃下水解 2 h ,冷
却后减压抽去 TFA ,再加入 2 mL 甲醇溶解后减
压蒸干 ,重复 5次。取 5 mg 水解物加 1 mL 水配
成样品液 ,将标准单糖(D 葡萄糖 、D 半乳糖 、
D 岩藻糖 、L 鼠李糖 、D 阿拉伯糖 、D 木糖 、
D 果糖 、葡萄糖醛酸 、半乳糖醛酸)配置成
5 g·L-1对照品液 ,分别点样。采用新华 1号滤纸
283第 4 期 刘　洋等:金钱草多糖的分离纯化与结构研究　　　
速(30 cm ×20 cm),展开剂为乙酸乙酯 吡啶 醋
酸 水(体积比为 5∶5∶1∶3),展开 10 h ,苯胺 邻苯
二甲酸为显色剂 , 110 ℃显色 5 min。对照 Fb和
标准单糖的 Rf 值 , Fb 的 Rf 值分别与半乳糖 、鼠
李糖 、甘露糖 、木糖 、半乳糖醛酸相一致 ,因此可以
判断金钱草多糖 Fb 是由半乳糖 、鼠李糖 、甘露
糖 、木糖 、半乳糖醛酸组成[ 7] 。
2.7　气相色谱分析
糖醇乙酸酯衍生物的制备[ 8] :Fb 水解物
15 mg ,加入 30 mg 硼氢化钠(NaBH4)和 2 mL
水 ,振荡后在室温下放置 2 h。滴入醋酸分解过量
的硼氢化钠 ,至无气泡产生为止 ,溶液在 60 ℃减
压浓缩至干 ,加入体积分数为 0.1 %的盐酸甲醇
溶液 2 mL ,振荡后减压蒸干 ,重复 5次以除去硼
酸根。剩余物在 105 ℃烘箱中加热 15 min除去
水分 ,加入 0.5 mL 吡啶和 0.5 mL 醋酸酐 ,封管
后在100 ℃反应 1 h ,减压蒸干 ,用 l mL 丙酮溶
解 ,进行气相色谱分析。称取L 鼠李糖 、D 阿拉
伯糖 、D 木糖 、D 甘露糖 、D 果糖和半乳糖醛酸
各 2.0 mg ,混合后采用同法衍生化 ,采用相同条
件进行气相色谱(GC)分析。GC工作条件:DB1301
石英毛细管柱(30 m ×0.53 mm),进样口温度
150 ℃,进样量 1 μL ,载气 N2 ,流速5 mL·min-1 。
对比多糖 Fb 单糖乙酸衍生物的气相色谱图(图
4)和标准单糖乙酸衍生物的气相色谱图(图 5),
Fb中 4个峰分别与标准单糖中峰 1 、2 、3 、4的保
留时间基本一致(见表 1),表明 Fb的中性多糖由
鼠李糖 、木糖 、甘露糖和半乳糖组成 ,进一步证明
纸色谱的结论 。半乳糖醛酸在气相色谱中未能检
出 ,是由于半乳糖醛酸的羧基不能被硼氢化钠还
原 ,而不是由于被还原成半乳糖醇无法与半乳糖
区别而未能检出。
1—Rha;2—Xyl;3—Man;4—Gal
Fig.4　GC of Fb
1—Rha;2—Xyl;3—Man;4—Gal;5—Fru
Fig.5　GC of acetylated standard monosaccharides
Table 1　GCdata of acetylated monosaccharides derived from Fb and standards
No. Acetylated
monosaccharide
tretention/ min
Standards Ace ty lated monosaccharide(Fb)
1 Rha 4.280 4.312
2 Xy l 4.578 4.630
3 Man 4.939 4.984
4 Gal 9.037 9.156
5 F ru 9.573 -
3　结论与讨论
金钱草多糖 Fa、Fb 、Fc、Fd 、Fe、Ff 均为首次
从金钱草中分离得到 ,金钱草多糖 Fb 的相对重
均分子量为 26 372 ,单糖组成为木糖 、半乳糖 、甘
露糖 、鼠李糖和半乳糖醛酸 ,具有多糖的红外特征
吸收峰特征吸收峰 ,是一种酸性多糖。
　　Sevag 法反应条件温和 ,除蛋白效果好 ,多糖
的损失较小。金钱草多糖中存在结合型色素和游
离型色素 ,用活性碳脱色只能除去游离型色素 ,对
结合型色素效果不明显。用 H2O2 法脱色 ,既可
以脱去结合型色素又可以脱去游离型色素 ,脱色
效果较好 ,但在实验过程中要注意控制温度 、pH
值 、脱色时间等条件 ,以防止多糖降解 。Sephacryl
284 　　　沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 25卷
S 300HR法分离多糖快速 、高分辨 、重现性好 ,对
样品吸附较少。Sephacry l S 300HR柱效每米大
于 6 000 ,用该法测多糖纯度可以与 HPGPC 法得
到一致的结论 。HPGPC 法测金钱草多糖的分子
量操作简便 、灵敏度高 、重现性好。糖醇乙酸酯法
分析多糖的单糖组成 ,每种单糖得到单一的色谱
峰 ,适合金钱草多糖单糖组成的定性分析。
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100.
Isolation , purification and the structure study of
polysaccharide from Lysimachia christane Hance
LIU Yang1 , WU Zhao-hua2 , GAO Hui-yuan1 , WU Li-jun1
(1.School of Tradit ional Chinese Materia Medica , Shenyang Pharmaceut ical Universi ty , Shenyang
110016 , China;2.School of Pharmacy , Mudanj iang Medical University , Mudanj iang 157001 , China)
Abstract:Objective To study the poly saccharide f rom Lysimachia christane Hance.Methods The polysac-
charides of Lysimachia christane Hance were isolated and purif ied by Sephacry l S-300 HR chromato-
g raphy , and the st ructure of polysaccharide Fb w as determined by HPGPC , IR , PC and GC.Results Six
kinds of poly saccharides:Fa , Fb , Fc , Fd , Fe , Ff contained in Lysimachia christane Hance were obtained.
The average molecular w eight of Fb w as 26 372.Xy l ,Gal ,Man ,Rha and Gal A were identif ied as the basic
sugars of Fb.Conclusions Six poly saccharides w ere obtained for the first time from Lysimachia christinae
Hance.
Key words:Lysimachia christinae Hance;polysaccharide;constituent isolation;st ructure ident if ication
285第 4 期 刘　洋等:金钱草多糖的分离纯化与结构研究