全 文 ：糙叶败酱提取物的体外抗肿瘤活性比较
陈 　茹 1　赵健雄 2 　王学习 2
1.广西中医学院护理学院 (广西 南宁 530022)　2.兰州大学中西医结合研究所 (甘肃 兰州 730000)
　　摘要:目的:比较糙叶败酱提取物糙叶败酱粗多糖 、 糙叶败酱总木脂素 、 糙叶败酱总皂苷的体外抗肿瘤活性 , 初
步筛选糙叶败酱抗癌作用有效成分。方法:采用四甲基偶氮唑盐比色法 (monotetrazoliumtest, MTT)测定不同浓度糙
叶败酱粗多糖 、 糙叶败酱总木脂素 、 糙叶败酱总皂苷分别对人肺源腺癌细胞 SPCA-1、 人肝癌细胞系 HepG2、 和人慢
性髓系白血病细胞 K562生长的影响。结果:糙叶败酱总木脂素 、 总皂苷对体外培养的肿瘤细胞 SPCA-1、 HepG2、
K562均有抑制作用 , 且抑制作用与药物浓度及作用时间有相关性;糙叶败酱总木脂素对 K562细胞生长的抑制作用尤
为显著 , 400μg/ml, 作用 96h, IC50为 21.16μg/ml;糙叶败酱粗多糖对 SPCA-1细胞的增殖有抑制作用。结论:糙叶
败酱不同成分有不同的抗肿瘤作用 , 糙叶败酱总木脂素对人慢性髓系白血病细胞生长有明显的抑制作用。
　　关键词:糙叶败酱　多糖　总木脂素　总皂苷　MTT法
　　中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1000-3649 (2011)01-0050-03
　　ComparingtheDifferencesamongPatriniascabraBunge.ExtractionsGrowth-inhibitingEffectsofonTumor
CelinVitro/ChenRu　Zhaojianxiong　WangXuexi∥1.GuangxiCollegeofNursingofTraditionalChineseMedicine(Guan-
gxiNanni530022, China)　2.InstituteoftheCombinationofTraditionalChineseMedicineandWesternMedicineinLanzhou
University(LanzhouGansu730000, China)
　　Abstract:Objective:ComparingthedifferencesamongPatriniascabraBunge.extractionsongrowth-inhibitengeffectsof
tumorcellinvitroandtestinganti-tumoreffectsofdiferentPatriniascabtraBunge.extractions.Methods:TheSPCA-1、
HepG2、 K562cellsgrowthwasmeasuredbyMTT-microculturetetrazoliuassay.Results:PatriniascabraBunge.lignanoid、
saponininhibitedtheSPCA-1、 HepG2、 K562 celgrowthinconcentration-andtime-dependentmanners.Andtheefectof
PatriniascabraBunge.lignanoidismoresignificant.IC50 is21.16μg/mlafterinterventionin400μg/mlPatriniascabra
Bunge.lignanoidfor96h, Butpolysaccharidehasdiferentefectondifferenttumorcel.Conclusions:Theanti-tumoreffectof
differentPatriniascabraBunge.extractionsaredistinguishedfromtreatingdiferenttumorcel.TheeffectofPatriniascabra
Bungeliynanoidismoresignificant.
　　Keywords:PatriniascabraBunge.　lignanoid　saponin　polysaccharidemonotetraliumtest(MTT)
　　败酱科多年生草本植物糙叶败酱 (Patriniascabra
Bunge.)和异叶败酱 (PatriniaheterophylaBunge.)
的根及根茎 , 中药称为墓头回 , 明 《本草纲目》 谓:
“山谷处处有之 , 根如地榆 , 长条黑色 , 闻之极臭 ,
俗呼鸡粪草。” 主要分布于华北、 东北地区 、 性微寒、
凉 , 味苦 、 涩 , 具有清热解毒、 消痈排脓、 祛瘀止
痛等功效。 《名医别录》 记载其:“祛除癌肿、 浮肿、
热邪壅盛、 风痹不能行走 、 产后腹痛。” 其抗肿瘤作
用国内外均有报道 [ 1] 。为了明确糙叶败酱抗癌有效
成分 , 我们采用糙叶败酱 , 提取分离出粗多糖 、 总
木脂素 、 总皂苷 , 进行了抗肿瘤作用的初步研究 ,
现报告如下。
1　材　料
1.1　药材　墓头回兰州市药材供应站提供 , 经甘肃
省医科院石长栓研究员鉴定为糙叶败酱。
1.2　培养液　RPMI-1640 (Gibco), 灭活的 10%新
生小牛血清 , 每毫升含青霉素和链霉素各 100单位。
过滤除菌 , 4℃冰箱避光保存。十二烷基硫酸钠
(SDS, 南京医药公司洪声化工厂)溶于 0.01mol/L
盐酸溶液 , 终浓度为 100g/L;二甲基亚砜 (南京医
药公司洪声化工厂);小牛血清 (四季青公司);阿
霉素 (上海华联制药有限公司 , 批号 031102A);提
取分离糙叶败酱的试剂均为分析醇 (西安化学试剂
厂)。
1.4　肿瘤细胞株　人肺源腺癌细胞 SPCA-1、 人肝
癌细胞系 HepG2、 和人慢性髓系白血病细胞 K562,
均引自中国科学院上海细胞生物研究所的细胞库。
用 RPMI-1649培养液 , 37℃, 5%CO2, 相对湿度
100%培养 , 贴壁细胞 0.25%胰蛋白酶消化传代。
2　方　法
2.1　糙叶败酱粗多糖、 总木脂素 、 总皂苷的提取分
离　糙叶败酱 (甘肃省肿瘤医院药剂科购买) 30kg,
粗制 , 水洗 , 水提 2次 , 3h/次 , 浓缩 2次水提液 ,
醇沉 3次 , 乙醇终浓度 60% ～ 70%, 收集沉淀 , 自
然晾干 , 得粗多糖 2.5kg。过滤上清液 , 浓缩 , 浓缩
液先经石油醚萃取 , 再经氯仿萃取 , 取氯仿萃取层 ,
回收氯仿后 , 得黑褐色总木脂素。母液继续经乙酸
乙酯 , 正丁醇萃取 , 收集正丁醇萃取层 , 回收正丁
醇 , 得皂甙液 30ml, 加乙醚 , 得絮状沉淀 , 回收乙
醚 , 得总皂甙。总木脂素经二甲基亚砜溶解 , 蒸馏
水稀释 20倍 , 0.22μ微孔滤膜过滤除菌 , 备用。粗
多糖 , 总皂甙 , 蒸馏水溶解 , 0.22μm微孔滤膜过滤
除菌 , 备用。
2.2　MTT比色法测定提取物对肿瘤细胞生长的抑制
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四　川　中　医
JournalofSichuanofTraditionalChineseMedicine
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作用
2.2.1　原理　该法利用活细胞内线粒体琥珀酸脱氢
酶能将 MTT还原为蓝色不溶解的甲臜结晶 , 甲臜可
以用有机溶剂 SDS溶解 , 因此 , 甲臜溶解后颜色的
深浅 (用 OD光密度值表示)可以代表活细胞的数
量和功能状态 , 从而可以在自动酶标读数仪上读出
OD值。同理 , 测定抗癌药物作用后 OD值的变化 ,
并计算出肿瘤细胞的存活率 , 即可预测患者体内肿
瘤细胞对抗癌药物的敏感程度。
2.2.2　方法　取对数生长期细胞 , 用新鲜的 RPMI
-1640培养液配制成细胞悬液 , 悬浮细胞 1×105个
/ml, 贴壁细胞 0.8×105个 /ml。悬浮细胞分别加入
不同浓度实验药物后接种于 96孔培养板中;贴壁细
胞先接种于 96孔培养板中 , 每孔 90μl, 24h后分别
加入不同浓度实验药物。终体积为每孔 100μl, 且每
组设 3个平行孔 , 共设 5组:受试药组 T(培养液 +
细胞悬液 +不同浓度受试药)、 阳性对照组 P(培养
液 +细胞悬液 +不同浓度阿霉素)、 阴性对照组 N
(培养液 +细胞悬液)、 药物颜色对照组 TC(培养液
+不同浓度受试药)、 空白对照组 B(培养液 +生理
盐水)。 受试药浓度依次为 12.5μg/ml、 25μg/ml、
50μg/ml、 100μg/ml、 200μg/ml、 400μg/ml, 阿霉素
浓度依次为 0.3125μg/ml、 0.625μg/ml、 1.25μg/
ml、 2.5μg/ml、 5μg/ml、 10μg/ml。 置 37℃, 5%
CO2培养箱中培养 24h、 48h、 72h、 96h后 , 向每孔
加入 MTT溶液 10μl, 震荡混匀后 , 继续培养 4h, 加
入 SDS90μl终止培养 , 37℃过夜 , 然后室温下在微
量振荡器上震荡 10min, 酶标仪测定 570nm波长处的
吸光度 (OD值), 实验重复 3次。生长抑制率 (In-
hibitionRate, IR)计算公式如下:
生长抑制率 (%) =
(N组OD均值 -B组 OD均值)— (T组 OD均值 -TC组 OD均值)
N组 OD均值-B组 OD均值
×100%
半数抑制浓度 IC50, 根据 OD, IR值 , 采用统计
软件 SPSS10.0计算得出。
2.3　统计学处理　实验结果均来自 3组平行并经 3
次重复实验 , 所有实验数据经 SPSS10.0软件处理 ,
进行多因素方差分析的组间差异比较。检验对照组
与各实验组之间的差异 , 以 P<0.01或 P<0.05为
有统计学意义。
3　结　果
3.1　糙叶败酱粗多糖、 总木脂素 、 总皂苷作用于不
同细胞 IC
50
(表 1、 2)　糙叶败酱粗多糖、 总木脂
素 、 总皂苷分别作用于 SPCA-1、 HepG2、 K562细
胞 , 在 24h、 48h、 72h、 96h的 IC50结果表明 , 糙叶
败酱总木脂素对 SPCA-1、 HepG2、 K562细胞的增殖
均有抑制作用 , 对 K562细胞的增殖抑制作用最为明
显 , 400μg/ml, 作用 96h, IC50为 21.16μg/ml。糙叶
败酱总皂苷对 SPCA-1、 HepG2、 K562细胞的增殖均
有抑制作用 , 对 SPCA-1细胞的增殖抑制作用略优
于 HepG2、 K562。糙叶败酱粗多糖对 SPCA-1细胞
的增殖有抑制作用 , 而对 HepG2、 K562细胞的增殖
略有促进作用 , 其抑瘤曲线呈负相关。
表 1　糙叶败酱粗多糖 、 总木脂素 、 总皂甙分别作用于 K562、 HepG2 、 SPCA-1细胞在不同时间的 IC50 (mg/ml)
细胞株作用时间 K562 HepG2 SPCA-1
24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h 24h 48h 72h 96h
总木脂素 65.0 56.4 31.7 21.16 442.0 126.0 108.7 100.6 4213.7 3686.1 3174.8 300.2
总皂苷 446.7 435.7 412.1 378.9 399.7 389.5 352.9 336.7 334.8 321.7 244.0 235.1
粗多糖 -＊ -＊ -＊ -＊ -＊ -＊ -＊ -＊ 436.0 410.7 149.4 137.7
　　注:-＊表示 OD值大于阴性对照组
3.2　糙叶败酱总木脂素对 K562细胞抑制率及 IC50的
影响 (表 2)　结果表明 , 糙叶败酱总木脂素对
K562细胞增殖有显著抑制作用 , 抑制作用随药物浓
度增高及作用时间延长而有加强趋势 , 最高抑制率
达 99.38%。但体外抗肿瘤活性均低于阳性对照组 ,
与对照组比较 , P<0.01, 且 6个剂量组间比较 ,
P<0.05, 差异有显著性。
表 2　糙叶败酱总木脂素对 K562细胞抑制率%及 IC50 (μg/ml)的影响
浓度(μg/ml)
糙叶败酱总木脂素 阿霉素
12.5 25 50 100 200 400 IC50 0.3125 0.625 1.25 2.5 5 10 IC50
24h 24.68 39.73 49.24 53.71 61.18 78.50 65.02 58.77 67.90 87.78 88.76 90.76 90.90 20.33
48h 20.47 37.52 40.86 52.03 80.09 98.72 56.39 67.54 70.56 76.98 89.90 90.86 91.34 19.73
72h 33.41 48.05 55.26 66.07 90.69 99.25 31.74 75.80 87.68 88.76 90.67 91.87 92.90 18.57
96h 40.05 56.89 62.55 70.81 99.27 99.38 21.16 86.70 89.34 90.43 91.23 96.67 97.02 17.32
4　讨　论
　　由于环境污染的加剧 , 营养失衡 , 人口老龄化
以及激烈竞争下生活压力增大等因素 , 肿瘤的发病
率正在逐年增加 , 目前已成为严重威胁人类健康的
主要疾病。 20世纪 90年代 , 有 1/10的人死于肿瘤 ,
据估计 , 21世纪初全世界每年新发肿瘤病例数将高
达 1500万 [ 2] 。
　　兰州大学中西医结合研究所博士生导师赵健雄
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教授从事中医肿瘤防治的研究 , 其主创的扶正抑瘤
颗粒 (FYG)在临床上取得了很好的疗效 , FYG主
要由红芪、 当归 、 莪术 、 墓头回等组成 , 该药从扶
正 、 祛邪两方面立法组方:红芪、 当归补益气血 ,
提高机体正气;莪术和墓头回行气消积 、 活血止痛、
解毒除湿而祛邪 , 扶正不留滞 , 祛邪不伤正 , 共奏
扶正抑瘤之目的。经动物实验证明 , FYG具有明显
的体内抗肿瘤活性 , 可通过调控肿瘤细胞增殖周期
而诱导细胞凋亡 [ 3] 。对荷瘤小鼠免疫功能影响的动
物实验表明 , FYG能影响肿瘤细胞 NF-κB的表达并
使 IL-2、 TNF、 CD4/CD8呈相关性升高 [ 4] 。临床实
验也证实 , 扶正抑瘤颗粒可影响 T细胞亚群 , 使
CD4/CD8比值明显上升并恢复正常 , 可提高 NK细
胞数 [ 5] , 调节免疫功能 , 改善高血粘状态 [ 6] , 并可
影响患者肿瘤组织 NF-κB的表达率和肿瘤细胞的细
胞周期 [ 7] , 从而发挥抗肿瘤作用。
　　墓头回作为扶正抑瘤颗粒的主要祛邪药物 , 其
主产地之一在甘肃 , 作为传统中药 , 这在治疗肿瘤
疾病中已有广泛临床报道 , 对其提取物的实验研究
也有零星报道 , 但其具体有效抗癌成分和作用机制
尚未见有深入研究报道。赵健雄教授主持的课题旨
在对墓头回 (经甘肃省医科院石长栓研究员鉴定为
糙叶败酱)进行提取分离并全面筛选 , 探究其抗肿
瘤有效成分及其作用机制。
本文所述实验中 , 所采用的MTT比色法 , 简单、
快速、 灵敏 , 现已被广泛用于体外肿瘤药敏的测定。
我们测定了组成糙叶败酱的三大类主要物质:糙叶
败酱粗多糖、 糙叶败酱总木脂素 、 糙叶败酱皂苷分
别对 SPCA-1、 HepG2、 K562等肿瘤细胞生长的抑制
作用 , 比较糙叶败酱不同提取物体外抗肿瘤活性证
实:(1)不同的糙叶败酱提取物对不同肿瘤细胞的
抑制作用有选择性。 (2)糙叶败酱总木脂素对 K562
细胞的生长有显著抑制作用。这为我们进一步探究
糙叶败酱抗肿瘤有效成分及其作用机制打下了坚实
的基础。
近年对于中药不同提取物抗肿瘤研究发现 , 中
药木脂素 [ 8] 、 皂苷 [ 9] 、 多糖 [ 10]对肿瘤细胞有直接抑
制作用。关于糙叶败酱 (墓头回)及其部分提取物
的体内外抗肿瘤作用也有零星文献报道 , 如:陈金
秀报道墓头回总甙对艾氏腹水型腹水癌有较强的抑
制作用;对 S180肉瘤也表现出较好的抑制作用 , 肿瘤
抑制率最高可达 41.12% [ 11] 。张元杏 、 王荫棠等报
道异叶败酱与糙叶败酱水提取物癌内注射 , 对小鼠
S180肉瘤抑制率达 62.5% [ 12 , 13]。本研究进一步验证了
糙叶败酱总木脂素、 总皂苷 、 粗多糖均有体外抗肿
瘤作用 , 且不同的糙叶败酱提取物对不同肿瘤细胞
的抑制作用有选择性。这种选择性近年也有文献报
道 , 王萍等用中药墓头回中所含的皂苷、 多糖 、 萜
类等成份的 4种提取物样品 MS、 JP、 MP、 MT, 对
移植性肿瘤肝癌 (Hep)和艾氏癌 (EC)鼠进行了
体内抗肿瘤实验。结果表明 , 4种样品对 Hep和 EC
均具一定的抑制作用 , 其中 MS对 Hep的作用较强 ,
MT对 EC的作用较强 [ 14] 。而对于这种选择性的进一
步研究 , 有助于抗肿瘤新药物的开发应用。
关于糙叶败酱对白血病的作用 , 陈靖宇、 陈建
民的实验证明墓头回水提液对急性白血病细胞毒作
用非常显著 , 对慢性粒细胞白血病病细胞不明显 [ 15] 。
孙万里等报道 , 体外试验 , 墓头回水提物 (5mg生
药 /mI)对急性粒细胞白血病 MZ、 慢性粒细胞白血
病急粒变 (CML-A)细胞有明显的杀伤作用 , 抑制
率接近 100%, 但对慢性粒细胞白血病细胞作用不明
显 , 抑制率仅为 54% [ 16] 。本实验结果不仅证实 , 糙
叶败酱多种成分对白血病细胞的生长均有抑制作用 ,
而且发现糙叶败酱总木脂素对人慢性髓系白血病细
胞生长有明显的抑制作用 , 其抗肿瘤作用机制 , 有
进一步研究的价值。
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(收稿日期　2010-09-28)
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