全 文 ：第 27卷 第 5期
2008 年　10 月
华　中　农　业　大　学　学　报
Journal of H uazhong Ag ricultur al Univ ersity
Vo l.27　No.5
Oct.2008 , 573～ 577
收稿日期:2008-02-22
＊广东省科技计划项目(2006B0101039)、国家科技支撑计划项目(2006BAD01A06-4-1)和农业部“ 948”项目(2006-G37)资助
＊＊通讯作者.E-mai l:laofangye@21cn.com
何慧怡 ,女 , 1981年生 ,学士 ,助理农艺师.工作单位:广州甘蔗糖业研究所 ,广州 510316
斑茅蔗后代杂种的分子标记分析
何慧怡　劳方业＊＊　刘　睿　陈健文
(广州甘蔗糖业研究所/广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室 ,广州 510316)
摘要　对斑茅蔗 BC1和BC2两个群体的 397 个无性系进行 SS R和 A lu-like 分子标记分析 ,发现其中 23 个品
系疑为假杂种 , 5 个品系不具有斑茅血缘。结果表明 SSR 分子标记是鉴定杂交后代真实性的较好的方法 , 而引
物 SC597CS 、SMC1527cl 、SSCIR36 鉴定出疑似假杂种总个数较多且互补性好 ,是鉴定斑茅蔗后代杂种真假的一
组较好的引物。与 Alu-like标记结合使用能较好地检测杂交后代是否含有斑茅血缘。
关键词　甘蔗;斑茅;杂种鉴定;SSR;A lu-like
中图法分类号　TS 261.1+5 　　文献标识码　A　　　文章编号　1000-2421(2008)05-0573-05
　　虽然现代糖料甘蔗品种至少含有热带种 、细茎
野生种和印度种的血缘 ,有的还含有中国种和大茎
野生种的血缘 ,但基本上都是少数早期育成品种的
品种间杂交后代 。长期近亲繁殖使甘蔗栽培品种的
遗传基础趋于单一化 。如果不引入新的种质 ,甘蔗
育种难有突破性进展 。斑茅 Erianthus arundina-
ceus(Re tz)Jesw ie t是甘蔗的近缘属植物 ,它具有
广泛的适应性和良好的抗旱 、抗虫 、抗寒 、抗病特性 ,
生长势旺盛 ,宿根性好。将斑茅的优良基因引入甘
蔗 ,是数十年来甘蔗育种研究的热点之一。广州甘
蔗糖业研究所是迄今在斑茅利用方面研究比较深
入[ 1-7] 、保育斑茅杂交后代最多的育种机构 ,然而如
何在早期鉴别杂交后代的真实性和检测斑茅血缘的
有无 ,则是加快斑茅研究利用的关键[ 3 , 8] 。鉴别杂
交后代真实性主要有形态学 、同工酶[ 6-7] 和 DNA 分
子标记等方法。其中 DNA 分子标记技术能排除外
部环境对甘蔗的影响因素 ,更客观和直观地反映供
试材料在 DNA 分子水平上的真实差异 ,因此在鉴
定杂交后代真实性和斑茅血缘有无的过程中具有其
它方法所不能比拟的优点 。分子鉴定杂交后代真实
性的方法有很多 ,如 RAPD[ 9] 、SSR[ 3 , 10] 、ISS R[ 8 , 11] 、
5S rDNA[ 10 , 12] 等 , 其中 SSR 分子标记具有含量丰
富 、多态性高 、共显性和检测操作方法较为简单等优
点 ,是目前用于鉴定真假杂种的最有效的方法之一 。
A lu-like标记是鉴别杂交后代是否具有斑茅血缘的
较好的方法 ,它具有操作简便 、重复性好 、稳定性高
等优点 ,而且标记与后代分离关系不大 ,只要含有斑
茅血缘就能扩增出斑茅特征带 ,且强弱变化不会很
明显 ,但 A lu-like 标记不能鉴别杂交后代的真实
性[ 3 , 13] 。通过 SSR与 A lu-like 标记结合 ,就能在育
种的早期 ,根据需要从实生苗开始剔除假杂种和不
含有斑茅血缘的后代材料 ,从而加快育种进程及加
快斑茅种质资源的有效利用。
　材料与方法
　试验材料
斑茅蔗 BC1和 BC2后代群体共 397个无性系 ,
杂交组合及其后代数目见表 1。YC96-40(崖城 96-
40)是 Badila(热带种)为母本与斑茅杂交的 F1杂
种 , 已被鉴定为真杂种[ 3 , 14] 。 YCE01-116 是以
YC96-40为母本与 CP84-1198 杂交的后代(BC1),
也被确认为含有斑茅血缘的真杂种[ 3] 。
表 1　杂交组合及其后代
Table 1　Crossing combination and their progenies
杂交组合 C rossing combinat ion
母本 Female 父本 Male
子代 Progenies
类型 Type 个数 Number
YC96-40 CP84-1198 BC1 204
YCE01-116 NJ57-416 BC2 193
　 提取
CTAB法 ,参照文献[ 15] 并略加改进 。将约
DOI :10.13300/j.cnki.hnlkxb.2008.05.014
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 27 卷　
200 mg 的甘蔗叶片在液氮中磨碎 ,加入 1 mL 65 ℃
预热的 CTAB 提取液(100 mmol/ L T ris-HCl pH
8.0 , 1.4 mol/ L NaCl , 20 mmol/ L EDTA , 2%
CTAB ,1%β-巯基乙醇),65 ℃保温 60 min 后冷却
至室温 ,加入 1 mL 体积比为 24∶1的氯仿/异戊醇
溶液 ,室温条件下 9 800 r/min 离心 10 min ,取上清
液并加入等体积 4 ℃预冷的异丙醇 , -20 ℃静置 60
min后于室温条件下 9 800 r/min 离心 2 min ,弃上
清液并加入1 mL 4 ℃预冷的 70%乙醇溶液 , 静置
30 min后于室温条件下 9 800 r/min 离心 1 min ,弃
上清液并加入1 mL 4 ℃预冷的无水乙醇 ,静置 30
min后于室温条件下 9 800 r/min 离心 1 min 沉淀
DNA ,经真空抽干离心机抽干纯化后获得 DNA 样
品。DNA 样品加入 200 μL 0.1× TE于 -20 ℃下
保存 。
　 标记分析
采用 CIRAD 提供的 SC597CS , SSCIR34 , SS-
CIR77 ,SSCIR36 ,SMC1527cl ,SM2055fc等引物 。PCR
反应总体积为 20 μL , 含模板 DNA 25 ng , 引物
6μmol/ L ,dNTP 0.2 mmol/L , MgCl2 3.0 mmol/L ,
Taq 酶 0.4 U 和匹配的缓冲液。扩增程序为:94 ℃
1 min;然后 , 94 ℃30 s , 50～ 60 ℃1 min ,72 ℃30 s ,
共 35个循环;最后 ,72 ℃5 m in。扩增产物经 95 ℃
变性 10 min 后 ,在 5%聚丙烯酰胺凝胶上电泳(功
率 100 W)2.5 ～ 3 h 。凝胶经银染显带后 ,拍照保
存。
　 - 标记分析
采用 PROLIGO 提供的引物 。PCR 反应体系
为 20 μL , 包括模板 DNA 25 ng ,引物 6 μmol/ L ,
dN TP 0.2 mmol/L , MgCl2 3.0 mmol/ L , Taq 酶
0.4 U和匹配的缓冲液 。扩增程序为:94 ℃预变性
1 m in;94 ℃30 s , 55 ℃1 min , 72 ℃30 s , 35个循
环;72 ℃延伸 5 min , 。扩增产物在 2%琼脂糖凝胶
上电泳(4 ～ 5 V/cm)1.5 ～ 2 h 。然后经凝胶成像系
统照相并保存 。
　结果与分析
　 标记
选择分布在主带区 、清晰可辨的父本和母本的
特征条带(标记),记录每个后代品系中每个父本或
母本特征条带的出现情况 ,出现时记作“1” ,不出现
记作“0” 。综合分析杂交后代 6对 SSR引物的多态
性标记数据 ,发现其中 374个无性系同时出现双亲
的特征条带 ,但有 23个无性系除了出现单亲或双
亲的特征条带外 ,还出现了双亲均没有的条带 ,即
非双亲条带。这些出现非双亲条带的无性系可能
是杂交过程中串粉或其它原因产生的后代 ,为疑
似假杂种 。
图 1　部分 BC1群体 SSCIR34 扩增图谱
Fig.1　Results of SSR using primer SSCIR34 for some BC1 progenies
　a.YC96-40(母本)YC96-40(f em ale);b.CP84-1198(父本)CP84-1198(male);49～ 80.BC1的无性系 , S1为品系编号 53 、58 、67样品出现
的非双亲条带 Clones of BC 1 , the band S1 could be found in No.53 , 58 , 67 , w hich w as not the speci fic bands of male and female
　　从图 1可看出 ,品系编号为 53 、58 、67的样品出
现了非双亲条带 S1 ,是疑似假杂种 。在这 23 个疑
似假杂种里 ,品系编号为 6 , 33 , 53 , 109 ,152 , 373 的
样品只具有母本的特征条带 , 8 和 291只具有父本
的特征条带 ,而其余则具有双亲或部分亲本的特征
条带(表 2)。
574
　第 5 期 何慧怡等:斑茅蔗后代杂种的分子标记分析 　
表 2　疑似假杂种 SSR标记的鉴定结果
Table 2　Results of false hybrids identification using microsatell ite markers
品系编号
N o.of clones
类型
Type
引物 Primer
SC597CS SSCIR34 SM C1527cl SM 2055fc S SCIR77 SSCIR36
5 BC1 √1) √♂♀4) √
6 BC1 √♀2)
8 BC1 √ √♂3) √♂ √♂ √♂ √♂
33 BC1 √♀
35 BC1 √♂♀ √♂ √♀
45 BC1 √♂♀
46 BC1 √♀ √♂ √♂ √♀
53 BC1 √♀ √♀ √♀
55 BC1 √♂♀ √♂♀ √♀ √♀
58 BC1 √♀ √♀ √♂♀ √♀
67 BC1 √ √♂ √♂ √♂ √♀
83 BC1 √♀ √♂♀
109 BC1 √♀ √♀ √
137 BC1 √♀ √♀ √♀
152 BC1 √♀ √♀
177 BC1 √♀ √♂ √♂♀ √♀
200 BC1 √♀ √♂♀ √♂♀ √♀
270 BC2 √♀ √♀ √♂
291 BC2 √♂
343 BC2 √♀ √♂ √♀
373 BC2 √♀
378 BC2 √♂♀ √♂ √♀
395 BC2 √♂♀ √
　1)鉴定为疑似假杂种 ,不具有双亲的特征条带 Ident ifi ed as false hyb rid s , and did not had the specif ic bands of m ale or female;2)鉴定为疑
似假杂种 ,且只具有母本的特征条带 Iden tif ied as false hyb rids , and only had th e specif ic bands of female;3)鉴定为疑似假杂种 ,且只具有父
本的特征条带 Identif ied as false hybrids , and only had the speci fic bands of male;4)鉴定为疑似假杂种 ,同时具有父本和母本的特征条带
Ident ified as fal se hyb rid s , an d had th e specifi c band s of b oth male and female
　　不同引物除了鉴定出来的疑似假杂种不尽相
同 ,鉴定出疑似假杂种的个数也有差异(表 3),其中
引物 SC597CS 、SMC1527cl 、SSCIR36 鉴定出来的
疑似假杂种个数较多而且互补性好 ,23 个疑似假杂
种都可通过这 3对引物全部鉴定出来 ,是一组鉴定
斑茅蔗后代杂种真假的较好的引物 。
表 3　不同 SSR引物鉴定疑似假杂种的个数
Table 3　The number of false hybrids identified with di fferent SSR primers
引物
Primer
疑似假杂种的个数 Number of fal se hybrids
BC1 群体
BC 1 group
BC2 群体
BC2 group
总和
Total
SC597CS 16 0 16
SSCIR34 8 0 8
SM C1527cl 9 6 15
SM2055fc 3 1 4
SSCIR77 5 4 9
SSCIR36 12 2 14
　 - 标记
　　已有研究结果表明 ,凡有斑茅血缘的品系(品
种)均可扩增出 1条约 270 bp 的特征条带 ,反之则
没有[ 3 , 13](图 2)。在这 397个杂交后代中 ,有5个样
没有扩增出斑茅血缘的特征条带 ,表明这 5个品系
不含有斑茅血缘。其中 BC1群体中有 4个 ,它们的
品系编号为 5 、8 、27 、67 。BC2群体中有 1个 ,品系编
号为 298。在这 5 个不含斑茅血缘的品系中 , 5 、8 、
67经 SSR标记分析为疑似假杂种(表 2),因此应为
假杂种。而 27 、298虽然不含有斑茅血缘 ,但经 6对
SSR引物的扩增条带分析 ,它们没有出现杂带 ,没
有被鉴别为疑似假杂种。导致这种情况出现的原因
可能有两种 ,其一是斑茅血缘的丢失 ,甘蔗为高度异
源多倍体的作物[ 16] ,在减数分裂形成配子的时候 ,
来源于斑茅的染色体没有被分配到受精的配子中 ,
因此导致杂交后代即使为真实杂种也不含有斑茅血
缘;其二是 27 、298是假杂种 ,只是所用的 6 对 SSR
引物均没有把它们鉴别出来而已。
575
　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 27 卷　
图 2　Alu-like扩增图谱
Fig.2　Alu-like PCR ampl ification patterns of 31 clones
　62～ 92.品系编号 ,除 67外 ,其它品系均能扩增出 1条约 270 bp的特征条带 No.of clones , a characteri sti c band about 270 bp in am plifi ed
products of all th e clones except 67
　讨　论
试验材料中 ,BC1和BC2两个群体共397个无性
系都是经过形态学特点进行目选的 ,但通过 SSR和
A lu-like分子标记鉴别 ,仍然发现 23个疑似假杂种
和 5个不具有斑茅血缘的品系 。这表明形态学标记
虽然具有直观 、具体 、简单易行 、成本较低等优点 ,但
易受环境因素和人为因素等的影响 ,可能导致错选
或误选 ,所以根据形态学特点进行目选的结果难以
让人信服 。
在 SSR标记分析中 ,本试验所使用的 6对引物
是从 24对引物中根据扩增图谱条带的清晰度及是
否出现非亲本条带而挑选得到的。使用不同的引物
进行鉴别 ,不但鉴别出的疑似假杂种有所不一样 ,而
且能鉴别出疑似假杂种的个数也有很大的差异。这
表明 SSR虽然是目前用于鉴定真假杂种的最有效
的方法之一 ,但是能否鉴别出所有杂交后代的真实
性很大程度上取决于引物的使用 。虽然 SSR 位点
贯穿于整个甘蔗基因组 ,但其两翼的碱基序列差异
很大 ,某 1对专一引物的使用只能检测到整个基因
组中极少的一部分 ,所以如果只通过 1对引物去鉴
定杂交后代是否为真实杂种会存在非常大的缺漏或
误差 ,因此多对有效引物结合使用是弥补这一缺陷
的较好的方法。在本次试验中 , 引物 SC597CS 、
SMC1527cl 、SSCIR36鉴定出来的疑似假杂种个数
较多 ,而且互补性好 ,是一组鉴定斑茅蔗后代杂种真
假的较好的引物 。
从杂交后代出现非亲本条带的情况看 ,如果只
具有母本的特征条带而又出现非双亲条带 ,则可能
是串粉所致的假杂种;如果只具有父本的特征条带
而又出现杂带 ,则可能是种子混杂的结果;如果同时
出现双亲的特征条带而又出现杂带则原因就较为复
杂了 ,例如可能是串粉的父本与杂交组合中的父本
基因型极为相像所致 ,又或者可能是亲本在形成配
子的过程中同源染色体之间发生互换 ,或发生缺失 、
重复 、易位 、倒位等染色体结构的改变或发生基因突
变而导致杂交后代即使为真杂种也有可能出现非双
亲的杂带 。因此用 SSR标记鉴定杂交后代的真实
性时 ,应尽可能使用多对有效引物 ,综合结果进行判
断。在本试验中有 18个品系是经 2对或以上的引
物鉴定为疑似假杂种 ,因此它们应该为假杂种 ,而剩
下的品系编号为 6 、33 、45 、291 、373的品系则需进一
步鉴别才能作出判断 。
在 Alu-like标记分析中发现有 5个品系不具有
斑茅血缘 ,其中编号为 5 、8 、67的品系在 SSR分析
中均经 3个或以上的引物鉴别为假杂种 ,而编号为
27和 298的品系虽没有出现杂带但其真实性还不
能完全确定 ,因此在育种过程中这 5个编号的品系
利用价值均不大 ,可剔除 。
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Molecular Marker Analysis of the Progenies Derived from Intergeneric
Cross of Saccharum with Erianthus arundinaceus
HE Hui-yi　LAO Fang-ye　LIU Rui　CHEN Jian-wen
(Guangz hou S ugarcane Industry Research Insti tute/Guangdong K ey Laboratory o f
S ugarcane Improvement &Biore f inery ,Guangz hou 510316 , China)
Abstract　SSR and Alu-like marke rs we re employed to identify the BC1 and BC2 progenies derived
f rom intergeneric cross of Saccharumin w ith Erianthus arundinaceus.The results indicated tha t among
397 clones of the progenies analy sed ,23 clones w ere suspected as the false hybrids and 5 clones did no t
had the E .arundinaceus-specified Alu-like marker.Micro satellite marker analy sis w as one of the reliable
method for the progeny identification , and SC597CS ,SMC1527cl and SSCIR36 made a good primer com-
bina tion since they could identi fy relatively more false hybrids and compensated w ell w ith each o ther.
A lu-like PCR me thod w as ef ficient in ve rifying w hether the pedig ree o f E.arundinaceus existed in puta-
tive hybrids.
Key words　sugarcane;Erianthus arund inaceus;hybrid identification;SSR;Alu-like
(责任编辑:张志钰)
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