全 文 ：1.2.4　微波炉法提取基因组 DNA(参照徐平等人的方法[ 7])
用无菌竹签从固体培养基上挑取单菌落或少些菌苔于无
菌 Eppendorf 管 , 加入洗涤液(50mmol/L Tris , pH7.7 , 25mmol/ L
EDTA , 0.1% PVP)1mL ,在旋涡混合器上振荡 5s;5700 r min;放弃
上清;加入 35μl裂解液(50mmol L Tris , pH8 , 25mmol L EDTA , 3%
SDS , 1.2% PVP), 振荡悬浮 , 并于功率为 600W 微波炉中处理
60s;加入 400μl 65℃预热的抽提液(10mmol L Tris , pH8 , 1mmol L
EDTA , 0.3mol L NaAc , 1.2%PVP),振荡 5s;加入等体积的Tris饱
和酚 氯仿溶液抽提 , 10000 r min离心 5min;上清以异丙醇沉淀 ,
70%乙醇洗涤 , 37℃干燥后溶于 20μl mmol L TE 溶液中 , -20℃
保存备用。
1.2.5　Chelex-100 法
用无菌竹签从固体培养基上挑取单菌落于无菌 Eppendorf
管 ,加入 50μl 5%(W V)的 Chelex-100 , 在旋涡混合器上振荡
5s ,沸水浴 5min;冷却至室温后 10000r min 离心 5min , -20℃保
存备用(上清即可作为 PCR的模板)。
1.2.6　体外扩增 23S rRNA基因
PCR中所使用的引物由 TaKaRa公司合成 , 序列为:23Ins V ,
5` -MADGCGTAGNCGAWGG-3 ;23Ins R, 5` -GTGWCGGTTTN-
BGGTA-3 (Roller C , 1992)[ 2] 。 25μl 反应体系中含有 1×Taq
DNA聚合酶(TaKaRa), 100 mmol dNTP , 1.5mmol MgCl2 , 1μl模板
DNA , 100 pmol引物和 1 单位 Taq DNA 聚合酶 , PCR程序如下:
94℃变性 5min;94℃变性 30s , 63℃退火 45s , 72℃延伸 1min ,共 30
个循环;最后 72℃延伸 5min。
PCR产物用 2%(W V)的琼脂糖凝胶电泳分析。
2　结果和讨论
16S 和 23S rRNA分子普遍存在于各种生物细胞中 , 在基因
中存在高度保守区域的同时 , 也存在局部的可变区。 在 23S
rRNA分子的特定区域还存在着插入和缺失。 这为设计特异性
引物用 PCR方法快速鉴别不同的菌群提供了条件。
对 1株革兰氏阴性细菌(Escherichia coli IFO 12734T)、2 株革
兰氏阳性低 G+C 含量细菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538T 、
Bacillus subtilis ATCC 6633T)和 3 株革兰氏阳性高 G+C 含量的
菌株(Micrococcus luteus IFO 3242T 、Marinococcus halophilus DSM
20480T 、Rhodococcus fascians DSM20669T)进行了比较研究。结果
表明(参见图 1),用 Chelex-100法提取基因组DNA作为模板可
进行有效扩增 ,扩增产物特异(第 1、2 、3、4 、5、6 号泳道)。 E.co-
li 、Staphylococcus aureus、Bacillus subtilis均得到 270bp 特异扩增带 ,
而 Micrococcus luteus 、Marinococcus halophilus和Rhodococcus fascians
得到 380bp 特异扩增带 , 与理论预期完全相符[8] 。用超声波法
所提取的 DNA 为模板的 PCR 产物中(7、9、10 、11、12、13 号泳
道), Bacillus subtilis得到了 380bp 条带(10 号泳道), 而它却是低
G+C 含量的菌株 ,但 Micrococcus luteus 、Marinococcus halophilus和
Rhodococcus fascians无扩增产物。在冻融法制得各个样品中(第
14 、15、16、18 、19、20 号泳道), 有 E.coli 、Bacillus subtilis 、Staphylo-
coccus aureus 三个菌得到了特异扩增产物;而 Micrococcus luteus 、
Marinococcus halophilus和 Rhodococcus fascians 无扩增产物。表明
超声波法和冻融法并非对所有菌株都有效 ,且可能有非特异扩
增的危险。酶法(21 、22、23 、24、25、27)、微波炉法(28-33)和
Chelex-100法的效果相当 , 但酶法和微波炉法耗时 、费力。酶
法单是消化 、抽提也需 2h 以上 , 微波炉法也要 1h 以上才能完
成。而应用Chelex-100法 ,则“一管一步” 10min 内即可完成 ,大
大提高了工作效率。
PCR实验中首先应考虑的是 DNA模板的完整性 , 对其纯度
要求并不高 ,对于放线细菌来说用 Chelex-100 法破坏细胞壁 、
细胞膜结构 ,使 DNA 释放出来 , 即可作为模板。 Chelex-100法
仅需很少量的样品 ,可直接从分离平板或斜面培养物上挑取单
菌落进行基因组 DNA 提取 , 不需专门用液体摇瓶培养大量菌
体。由于该法无须反复用苯酚 氯仿抽提 ,因此在制备过程中样
品几乎没有损失。而经典的方法步骤较繁琐 , DNA经常转管 ,
且还要使用多种试剂 ,这都增加了 PCR污染的可能性。所以使
用该方法大大简化了 PCR模板 DNA 的制备过程(沸水浴 5min ,
离心 5min), 可以用较短的时间完成大量的 PCR 实验 ,“一管一步”即可完成模板制备过程 , 使操作中各样品交叉污染的几率
大大降低 , 保证了 DNA 模板的完整性。从实验结果来看 , 用
Chelex-100 法提取 DNA 所扩增的条带特异性强 、较明亮清晰 ,
效果满意。而且 , Chelex-100 法制备 PCR模板 DNA 不需特殊
仪器(台式离心机为一般实验室的常备仪器), 所用试剂便宜 ,
操作方便。所以 Chelex-100 法提取基因组 DNA使 PCR技术的
应用更加简便 ,在大量筛选 、鉴定放线细菌方面具有重要意义。
参考文献:[ 1] Stackebrandt E , Ra iney F A ,Ward-rainey N.Proprosal for new hierarchic
classifi cation system , Actinsbacteriaclassis nov[ J] .Int J Syst Bacterial , 1997,
47:479-491.
[ 2] Roller C , Ludwig W ,Schleifer K H.Gram-positive bacteria with a high DNA
G+C contant are characterized by a common insertion within their 23S rRNA
genes[ J] .J GenMicrobiol , 1992 ,138:1167.[ 3] Hopfl P , Ludwig W , Schleifer K H , et al.The 23S ribosomal rRNA higher or-
der structure of Pseudomomas cepacin and other prokaryotes[ J] .Eur J Bio-
chem , 1989 , 185:355.
[ 4] Ludwig W , Kirchhof G , Klugbaner , et al.Complete 23S ribosomal RNA se-
quences of gram-postive bacteria with a low DNA G+C content[ J] .Syst Appl
Microbiol , 1993 ,15:487.[ 5] Rompre A , Servais P , Baudart J , et al.Detection and enumeration of coliforms
in drinking water:current methods and emerging approaches[ J] .J Microbiol
Methods, 2002 , 49:31-54.
[ 6] Orisini M , Romano-Spica V.A microwave-based method for nucleic acid
isolation from enviroment samples[ J] .Letters in Applied Microbiology , 2001,
35:17-20.[ 7] 徐平 ,李文均 ,徐丽华 ,等.微波法快速提取放线菌基因组 DNA[ J] .微
生物学通报 , 2003 ,30:82-84.
[ 8] 余利岩 ,李秋萍 ,姚天爵.两种 Actinobacteria 鉴定方法的比较[ J] .中
国抗生素杂志 , 2001 ,26(1):10-14.
RAPD早期鉴定平邑甜茶与 B9 的杂交群体
石琰 1 ,沙广利2 , 3 ,黄粤3 ,孙仲序2 ,束怀瑞2＊(1.青岛科技大学化工学院 ,山东 青岛 266042;2.山东农业大学园艺学院 ,山东 泰安 271018;
3.青岛市农业科学研究院 ,山东 青岛 266100)
摘要:应用 RAPD技术寻找平邑甜茶与B9 的差异引物 ,用于早期筛选以平邑甜茶为母本 B9 为父本的杂交群体。在用于筛选
的72个引物中找到符合要求的 4 个随机引物共 7 个特异位点 ,用这 4 个随机引物筛选杂交群体的 25 株个体 ,鉴定出 5 个杂交个
体:307、308、319 、322、324。
关键词:RAPD;早期鉴定;平邑甜茶;B9
中图分类号:523.8　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2004)05-0039-03
Early Hybrid Identification in Apomictic“Malus hupehesis”and “Malus cv.B9”
Seedings using RAPD Markers
SHI Yan-jing1 ,SHA Guang-li2, 3 ,HUANG Yue3 ,SUN Zhong-xu2 ,SHU Huai-rui2
(1.Chemical Engineering College ,Qingdao University of Science &Technology ,Qingdao 266042;2.Horticulture College , Shandong Agricultural University ,Tai an 271018;
3.Qingdao Agricultural Science Academy ,Qingdao 266100 ,P.R.China)
Abstract:By using RAPD techniques , 72 random primers(from S301-S372)were screened and fourprimers were found amplified difference bands
between “Malus hupehesis Rehd.”and “ Malus cv B9” parents of the progeny group need to identify.And these four primers were used , 5 hybrid in
a 25 progenies group were obtained———307 , 308 , 319 , 322 , 324.
Key words:RAPD;early hybrid identification;“Malus hupehesis Rehd”;“Malus cv.B9”　　杂交育种是一种常规 、有效的育种手段 , 大多数农作物品
种是由这种方法育成的。大多数果树实生苗童期长 ,因而 ,育
种周期漫长 , 大大制约了果树杂交育种的进程。近年来 , 分子
标记技术发展迅速 ,使得利用 DNA标记在苗期对实生苗进行早
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2004 年 10 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.14 , No.5:39
Oct.2004
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2004.05.020
期鉴定成为可能。 RAPD技术快捷方便 、需要的样品少 , 赵姝华
报道用半粒种子进行种质鉴定[1] ,另外半粒种子发芽的检测方
法。 RAPD技术在葡萄抗病育种[2] 、远缘杂种鉴定[3] 、无融合生
殖后代鉴定[ 7-9]上都有应用。
平邑甜茶(Malus hupehesis Rehd.)抗旱 、耐涝 、耐盐 、抗白粉
病 、嫁接苹果亲和力强 , 在苹果生产中应用广泛。平邑甜茶具
有兼性无融合生殖特性 , 无融合生殖率 90%以上 , 实生繁殖的
苗木具高度的遗传一致性。育种学家们希望以此为育种资源 ,
在保留无融合生殖特性的同时 , 选育出具有矮化特性的砧木 ,
克服现行苹果无性系矮化砧木存在的立地性不好 ,苗木繁殖困
难等缺点。本文以平邑甜茶作为母本 , 俄罗斯耐寒矮化砧木品
种 B9(Malus cv.B9)为父本 , 旨在选育矮化 、抗寒的无融合生殖
型砧木。因为平邑甜茶具有的兼性无融合生殖特性[ 6] , 实生繁
殖后代大多数仍与母本基因型一致 , 只有少部分为与父本结合
的杂种后代。因此 ,从杂交后代中选出这少量的“真正”杂种后
代 ,成为减少育种成本 , 提高育种效率的关键。 RAPD 是显性标
记 ,而果树是遗传上高度杂合的植物 ,在每个基因位点都可能
是杂合的 ,因此本文在实验设计上使用具有父本特异带的多个
引物 ,同时筛选 , 以增加选择的可靠度。
收稿日期:2004-03-20;修回日期:2004-06-06
基金项目:山东省自然科学基金项目(Y96D22075);青岛市自然科学基
金项目(03-2-jz-06)
作者简介:石琰 (1974-),女 ,博士 ,研究方向:植物分子生物学 , E-
mail:syj99@163.com;＊束怀瑞(1929-),男 ,博导 ,院士 , E-mai l:hrshu
@sdau.edu.cn ,研究方向:果树学。
1　材料与方法
1.1　植物材料
母本平邑甜茶 , 为实生繁殖树 , 树龄 15 年。父本 B9 , 为嫁
接繁殖树 ,树龄 8年。 1999 年杂交 ,杂交群体共25 株 ,分别编码
为301-325 , 2001年做该实验时 2年生。以上材料均定植于青
岛市农科院果树砧木资源圃。
随机引物S301-S372 、Taq酶 、dNTPs 均为上海生物工程公
司制品。
图 1　引物筛选
Fig.1　Primer selection;从左到右分别为DL-2000Marker ,
S358-B9 ;S358-平邑甜茶;S341-B9;S341-平邑甜茶;
S344-B9 ;S344-平邑甜茶;S370-B9;S370-平邑甜茶
1.2　方法
1.2.1　DNA提取方法
植株的基因组 DNA 提取的方法按参考文献[ 4] 略做修改提
取。取 0.1g 叶片材料于 Eppendorf 管中 ,加液氮后 , 用特制的与
管嵌合的磨棒研磨成细粉。加 500μl CTAB 提取缓冲液 , 65℃水
浴15min , 下面完全按文献[ 4] 操作。
1.2.2　RAPD反应体系及条件
采用 20μl 体系:Taq 1U , Mg2+ 2mmol L , dNTP 100μmol L ,
10mmol L Tris-Cl pH8.3 , 50 mmol L KCl , 随机引物 10 pmol ,模板
DNA 20-100ng。
反应条件为:94℃预变性 2min , 94℃变性 30s , 36℃退火
40s , 72℃延伸 1min共 45 个循环 , 最后 72℃延伸 5min。每个扩
增反应重复 3次。
RAPD扩增产物在 1ⅸTAE 电泳缓冲液用 1.2%琼脂糖上电
泳分离。电泳结果在英国 UVP凝胶成像系统中观察拍照。
2　结果分析
2.1　引物筛选的结果
在此次引物筛选中获得很多差异引物 ,但由于平邑甜茶只
能作为母本 ,只能采用在父本能扩增出特异带而在母本中无带
的特异引物。故筛选到以下几个引物:S341 、S358 、S344 、S370(图
1)。
2.2　群体筛选结果
经过3 个引物的检测后 ,只有用 S341 引物扩增所得父本 B9
的三条特异带:S341-1200、S341-100、S341-700 筛选到了杂合
子307、308 、319、322和 324。如图所示:
从图中可以看出在 S341 引物扩增中 , B9 中有 1200bp 和
1000bp两条平邑甜茶所没有的。 307 中出现了 1000bp 和 700bp
的B9 特异带;在 308、319 、322 中出现了 1200bp 的 B9 特异带 ,
324 中出现了 1000bp 的 B9 特异带。在308 和 319中平邑甜茶特
异带 1250没有出现 , 说明在子代中发生了分离。 B9 的特异带
在子代中也发生了分离。
3　讨论
在此次引物筛选中获得很多差异引物 ,但由于平邑甜茶只
能作为母本 ,作者只能采用在父本能扩增出特异带而在母本中
无带的特异引物。
由于苹果是基因高度杂合的物种 , 每个基因位点上都有可
能是杂合的 , 因此其杂交后代在 F1 代就发生性状分离。 而
RAPD标记是显性标记 ,即它所找到的标记在 F1 代也会发生分
离。因此单纯一个位点没能杂交上不能认为该个体不是杂合
子。刘孟军[ 5]等在利用 RAPD标记研究苹果属间杂交一代的分
离方式时发现特异带在 F1 带发生 1:1分离的(AA×aa , Aa×aa)
几率可达40%和 43.3%(分别为富士和山定子)特异带在后代
不分离(AA×Aa, Aa×AA , AA×AA)的几率只有74.4%。
在本次实验中使用了 4 个引物的 7 个差异带;这 7 个差异
带可以认为是 7个基因位点。假使每个位点都是杂合的 , 那么
每个差异带在F1 代出现的几率为 1 2 , 所筛选过7 个差异带后 ,
在杂交群体内漏选杂合子的几率(7 个基因位点都杂交不上的
几率)为 1 27 ,即 1 128 ,而待检测的杂交群体只有 25个个体 , 因
此认为这次检测没有漏选的个体。
由于 B9 与平邑甜茶的形态学有些差异可以在苗期表现出
来 ,目测中发现 307 和 314具有明显的父本特征 , 即紫叶。但是
只有 307可以用分子标记的方法可以检测 , 314 却不能从
图 2　S341筛选杂交群体
Fig.2　Selection with primer S341(Marker i s DL2000)
分子标记中表现出来 , 而 RAPD 标记筛出 322、324 在苗期没有
表现出紫叶的形态特征 , 说明形态学鉴定只能部分地说明问
题 ,由于它受环境和发育的影响不能真实反映个体的基因型。
在果树杂交群体的早期筛选中使用 RAPD技术将大大减少环境
因素造成的影响。
参考文献:
40　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 14 卷第 5期
[ 1] 赵姝华 ,李文利 ,谭海东.农作物种子及半粒种子DNA RAPD 扩增研
究[ J] .国外农学-杂粮作物, 1999 , 19(3):22-25.
[ 2] 王跃进 ,王西平 ,周鹏 ,等.中国野生葡萄抗黑痘病基因的 RAPD标
记[ J] .园艺学报 ,2000 , 27(5):321-325.
[ 3] 王跃进 ,卢江.用 RAPD分析鉴定葡萄属远缘杂种[ J] .西北农业大
学学报 , 1997 ,25(3):16-20.
[ 4] Haymemes K M.Mini -prep method suitable for plant breeding program
[ J] .Plant Molecular Biology Report , 1996 , 14(3):280-284.
[ 5] 刘孟军 , Shin-Yong-uk , Yae Byeong-Woo.RAPD 标记在苹果属种件
杂交一代的分离方式[ J] .园艺学报 , 1998 ,25(3):214-219.
[ 6] 刘悍中 ,薄富慎.无融合生殖苹果属植物的某些特性[ J] .园艺学报 ,
1989 , 16(1):1-4.
[ 7] H.Ur-Rahman, D J James.The use of RAPD for verifying the apomictic sta-
tus of seedlings of Malus species[ J] .Theor Appl Genet , 1997 ,95:1080-1083.
[ 8] 康传红 ,韩晓云 ,等.利用 RAPD 标记鉴定甜菜无融合生殖的同一性
[ J] .生物技术 , 2002, 12(4):9-11.
[ 9] 亚梅 ,罗琛.雌核发育草鱼同工酶分析[ J] .激光生物学报 , 2004 , 13
(1):74-77.
应用 PCR技术检测串珠镰刀菌
刘金华 ,肖成蕊 ,刘志研 ,牟峻(吉林出入境检验检疫局 ,吉林 长春 130062)
摘要:串珠镰刀菌(Fusarium moniliform)是一种危害严重 、在世界各地广泛流行的植物病原真菌 , 当前对串珠镰刀菌的鉴定主
要根据其菌丝体及再生菌丝的形态结构学特征及染病作物的病害症状来进行鉴定。这些鉴定方法相对简单并在很大程度上依
赖于经验 ,受主观因素影响较大。采用串珠镰刀菌种特异性的寡聚核苷酸为引物 , 运用 PCR技术对串珠镰刀菌进行检测是一种
快速可靠的检测鉴定方法 ,它无需病原菌的分离培养纯化 ,能从感病的玉米组织中直接实现对串珠镰刀菌的快速检测。经对霉
变玉米样品和玉米穗腐病组织的检测 ,证明该方法是一种快速 、有效的方法 , 具有重要的实际应用价值。
关键词:串珠镰刀菌;PCR技术;玉米
中图分类号:S435.131　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2004)05-0041-02
Use Species-specific PCR Technology Identify Fusarium moniliform
LIU Jin-hua ,XIAO Cheng-rui ,LIU Zhi-yan ,MU Jun
(Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Jilin , Changchun 130062 , P.R.China)
Abstract:Fusarium moniliform is an important pathogen of many cultivated crops.In maize , it causes seeding blight and stalk , ear rots.PCR tech-
nique as a rapid and reliable method for the detection and differentiation of F.moniliform species has been developed.In this study , based on the
specific nucleotide sequence of F.moniliform , the specificity and suitability of the PCR technique has been tested with different infected maize
samples.The result shows the PCR technique has definitive advantages in terms of specificity and technical simplicity.
Key words:Fusarium moniliform ;PCR technique;maize
收稿日期:2004-04-21;修回日期:2004-07-12
攻关项目:科技部资助项目(编号:2002EE550021)
作者简介:刘金华(1975-),男 ,硕士生 ,工程师 ,从事转基因产品的检
测研究。
　　串珠镰刀菌(Fusarium moniliform)是一种重要的农作物病
原真菌 , 能引起禾本科作物的根腐 、茎腐和穗腐 , 是玉米青枯
病和穗腐病的主要病原真菌之一[ 1 , 2] 。此外 , 串珠镰刀菌也是
玉米贮存过程中污染程度最严重的真菌菌群之一 ,由串珠镰
刀菌产生的次生代谢物霉菌毒素—伏马毒素(Fumonisins)能引
起人畜中毒并具有致癌作用[ 3 ,4] 。实现对串珠镰刀菌有效快
速的检测无论是对病害的监控与防治上还是对仓储玉米的质
量监测上都具有重要意义[5] 。
当前鉴定串珠镰刀菌主要依靠其菌丝体及再生菌丝的形
态结构学特征或对寄主植物进行接种根据其病害症状特征来
进行判定。这些鉴定检验方法相对简单但需要较长的时间且
要求具有较高的专业水平 ,并在很大程度上依赖于经验 , 受主
观因素影响较大。建立一种简单快速可信的检测鉴定方法是
十分必要的 , 应用 PCR技术对植物病原进行检测具有高度的
灵敏性及特异性 , 是新发展起来的一种有效检测方法[6] 。国
内这方面研究起步较晚 , 主要针对串珠镰刀菌素-伏马毒素
做过一些研究 ,而运用 PCR 技术检测串珠镰刀菌的研究还未
见报道。本实验通过对串珠镰刀菌基因组中种特异序列的扩
增[ 7] , 分别以霉变玉米 、玉米穗腐病组织为样品 , 通过 DNA 的
提取并运用 PCR技术检测 , 结果均扩增出相同大小的特异片
段 ,经酶切验证为同一片段 , 证明该方法是一种简便高效切实
可行的方法。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　供试材料
串珠镰刀菌(Fusarium moniliform)标准菌株由吉林省农科
院植保所惠赠 , -20℃冷藏保存 , 使用前活化后接种于察氏培
养基 27℃培养 10d ,收获菌丝体。霉变玉米样品 2003 年 10 月
抽样于长春粮库 ,样品-20℃冷藏保存 ,玉米穗腐病组织为吉
林出入境检验检疫局植检实验室 2002 年采集于吉林农业大学
实验农场的标本。
图 1　PCR扩增产物凝胶电泳结果
M.分子量标准;1.串珠镰刀菌(阳性对照);2.空白对照;3.玉米
穗腐病组织;4.霉变玉米样品;5.健康植物组织(阴性对照)
Fig.1　PCR amplification map of Fusarium moniliform Species-specific
fragment M.DNA molecular weight standard;Line1.Fusarium moniliform
standard strain(positive control);Line2.Blank control;Line3.Ear rot
tissue of maize;Line 4.Fusarium moniliform infected maize;Line5.Health
tissue of maize(negative control).
图 2　ClaⅠ酶切反应物凝胶电泳结果
M.分子量标准;1.玉米穗腐病组织;2.霉变玉米
样品;3.串珠镰刀菌
Fig.2　Fusarium moniliform Species-specific fragment digested
with ClaⅠ ;M.DNA molecular weight standard;Line 1.Ear rot tissue
of maize;Line 2.Fusarium moniliform infected maize;Line3.Fusarium
moniliform standard strain
1.1.2　仪器与试剂
第 14卷第 5 期:41
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BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.14 , No.5:41
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