全 文 ：第 32 卷 第 7 期
2 0 1 4 年 7 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 32 No． 7
Jul． 2 0 1 4
中
药
研
究
扫
描
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华
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学
刊
DOI:10． 13193 / j． issn． 1673-7717． 2014． 07． 076
大孔树脂纯化金钱草总黄酮的工艺优选
宋少辉1，王玉霞2，吴华1，林泉松1，周在富1
(1．重庆科瑞制药(集团)有限公司，重庆 400060;2．重庆医药高等专科学校，重庆 400030)
摘 要:目的:研究大孔吸附树脂分离纯化金钱草中总黄酮的最佳工艺条件。方法:以金钱草总黄酮、槲皮素
和山奈素质量浓度为指标，筛选出合适的大孔树脂型号和最佳工艺条件。结果:NKA － 9 型大孔树脂对金钱草总
黄酮纯化效果最好。最佳分离条件是:树脂柱径高比 1 ∶ 9 ～ 1 ∶ 15，药液质量浓度 0． 5 g 生药 /mL，上样速度 2
BV /h，最大上样量 1． 8 BV，洗脱剂为 70%乙醇溶液，洗脱用量 4 BV。结论:所筛选出的工艺操作简便、方法可靠，
并能得到高纯度的产品。
关键词:金钱草;黄酮;大孔树脂
中图分类号:Ｒ284． 2 文献标志码:A 文章编号:1673-7717(2014)07-1770-04
Study on Technology for Extracting Flavonoids in Lysimachia
Christinae Hance by Macroporous Ｒesin
SONG Shaohui1，WANG Yuxia2，WU Hua1，LIN Quansong1，ZHOU Zaifu1
(1． Chongqing Kerui Pharmaceutical (Group)Co．，Ltd．，Chongqing 400060，China;
2． Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing 400030，China)
Abstract:Objective:To investigate the enrichment and purification of flavones from the extracts of Lysimachia christi-
nae Hance by macroporous resins． Methods:The most suitable type of macroporous resin and the optimal conditions were
investigated with quercetin，kaempferide and the total flavonoids were as the evaluation factors． Ｒesults:NKA － 9 was the
most suitable type of macroporous resin and the optimal conditions were as follows:the ratio of diameter and height of
loading column was 1 ∶ 9 ～ 1 ∶ 15 and the concentration of sample was 0． 5 g·mL － 1 and the speed that sample flowed
through macroporous resin was 2 BV ·h － 1 ． The maximum load was 1． 8 BV and the eluting reagent was 70% ethanol
and 4 BV of the eluent was collected． Conclusion:This method was simple and reliable and can be used to obtain fla-
vonoeds product with high purity．
Key words:Lysimachia christinae;flavones;macroporous resins
收稿日期:2014 － 02 － 04
作者简介:宋少辉(1984 －) ，男，天津人，工程师，硕士，研究方向:
中药新药开发与研究。
通讯作者:王玉霞(1977 －) ，女，甘肃人，高级工程师，硕士，研究方
向:天然药物化学和中药新药。E-mail:axawyx@ 163．
com。
金钱草来源于报春花科珍珠菜属植物过路黄 Lysima-
chia christinae Hance．的干燥全草，主要分布于长江流域，以
四川省为主产区，有效成分以黄酮类为主，主要用于治疗湿
热黄疸、肝胆结石、尿路结石、细菌感染等疾病，研究表明黄
酮类成分药理活性显著，有很高的药用价值［1 － 10］，作者对
金钱草总黄酮纯化工艺进行了研究，以金钱草总黄酮、槲皮
素和山奈素质量浓度为指标，考察了金钱草总黄酮大孔树
脂纯化的最佳工艺，为金钱草总黄酮的工业化生产提供了
依据。
1 材 料
1． 1 材料
金钱草药材(购自四川新荷花中药饮片股份有限公
司，批 号 1204046) ;芦 丁 对 照 品 ( 批 号:MUST －
11040302)、槲皮素对照品 (批号:MUST － 12020101 ) ，均
购于成都曼斯特生物科技有限公司，山奈素对照品 (批
号:0773 － 9910，购于中国药品生物制品检定所) ;实验用各
型号大孔树脂均购自南开大学树脂厂;HPLC 用试剂为色
谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司) ，其它试剂均为分
析纯。
其中金钱草药材按照《中华人民共和国药典》2010 年
版“金钱草”项下相关规定进行全检，均符合规定;总黄酮
质量分数测定方法自拟，暂定金钱草总黄酮质量分数不低
于 1． 30%。
1． 2 仪器
UV －1700 紫外分光光度计(购买于日本岛津公司) ;
Agilent 1100 型高效液相色谱仪;BP211D 型电子分析天平
(购买于德国 Sartorius 公司 ) ;KQ － 400DB 型数控超声波
清洗器(购买于昆山市超声仪器有限公司)。
2 方法和结果
2． 1 金钱草总黄酮质量浓度测定方法的建立
2． 1． 1 测定波长的选择 分别取空白样品溶液、对照品溶
液、供试品溶液进行全波长扫描，确定测定波长。
对照品溶液、供试品溶液均在 500 nm 处有较大吸收，
而空白对照在此位置上没有干扰，选 500 nm为测定波长。
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2． 1． 2 对照品溶液配制 精密称取 12． 77 mg 芦丁对照
品，用乙醇定容至 25 mL 容量瓶中，完全溶解后，取 10 mL
加水定容至 25 mL容量瓶中，摇匀，即得对照品溶液(0． 20
mg /mL )。
2． 1． 3 供试品溶液配制 取金钱草乙醇提取液 2 mL (药
液质量浓度 0． 5 g生药 / mL ) ，水浴挥干溶剂，加乙醇约 50
mL超声溶解，转移置 100 mL 容量瓶中，用乙醇定容至刻
度，摇匀，即得。
2． 1． 4 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液 1、2、3、
4、5、6 mL于 25 mL量瓶中，加水至 6 mL，加 5%的亚硝酸
钠溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min 后加 10%的硝酸铝溶液 1
mL，摇匀，放置 6 min 后再加入氢氧化钠试液 10 mL，加水
至刻度，摇匀，放置 30 min 后，于 500 nm 处测定吸光度。
以所测得的对照品质量浓度(C)为横坐标，吸收度(A)为
纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。结果回归方程为 Y
=12． 0925X － 0． 0068，(r = 0． 9999)。结果表明，黄酮显色
后在 0． 008 ～ 0． 049 mg /mL吸收值与质量浓度成线性相关，
见图 1。
图 1 对照品标准曲线图
2． 2 指标成分槲皮素、山奈素质量分数测定方法的建立
2． 2． 1 HPLC 色谱条件 色谱柱:Agilent Eclipse C － 18
(150 mm ×4． 6 mm，5 μm) ;柱温:30 ℃;检测波长:360 nm;
流速:1 mL· min －1;流动相:甲醇 － 0． 4%磷酸(50 ∶ 50 ) ;
进样量:10 μL。
2． 2． 2 对照品溶液的配制 分别取槲皮素、山奈素对照品
适量，用 80%甲醇溶解，配制成槲皮素质量浓度为 4． 07 μg /
mL、山奈素质量浓度为 21． 96 μg /mL的混合溶液，即得。
2． 2． 3 供试品溶液的配制 取金钱草提取液适量，水浴
挥干溶剂，80%甲醇溶解，转移至 50 mL 容量瓶中，加 80%
甲醇至刻度，摇匀，取续滤液 25 mL，加盐酸 5 mL，90 ℃水
浴 1 h，转移至 50 mL容量瓶中，加 80%甲醇至刻度，摇匀，
即得。以 80%甲醇溶液为空白溶液。
2． 2． 4 专属性考察 分别精密量取配制好的对照品、供
试品、空白溶液各 10 μL，注入高效液相色谱仪，按“2． 2． 1
HPLC色谱条件”测定，记录谱图。由图 2 ～ 4 可知，对照
品、供试品溶液各有效成分分离度、对称性良好，空白对照
溶液无干扰，表明系统专属性良好，可用于金钱草槲皮素、
山奈素成分的测定。
2． 2． 5 线性关系考察 取配制好的对照品溶液，分别精密
吸取 2、4、6、8、10、20 μL，进样，记录色谱图。分别以槲皮素
峰面积(Y1)对质量浓度(X1)、山奈素峰面积(Y2)对质量浓
度(X2)进行线性回归，得回归方程:Y1 = 2835． 8 X1 +
图 2 对照品溶液 HPLC图
图 3 供试品溶液 HPLC图
图 4 空白溶液 HPLC图
0． 7705，r =0． 9996;Y2 =3730． 4X2 +8． 3339，r =0． 9996。表明
槲皮素在 0． 008 ～ 0． 081 μg /mL呈良好的线性关系;山奈素
在 0． 044 ～0． 439 μg /mL呈良好的线性关系，见图 5 ～6。
图 5 槲皮素标准曲线图
2． 3 金钱草提取液的制备
取金钱草适量，加 12 倍 80%乙醇溶液，提取次数 2 次，
每次 1． 5 h，合并醇提取液，浓缩至 0． 5 g 生药 /mL 备用。
测定槲皮素含量为 9． 88 μg /mL，山奈素质量浓度为 18． 05
μg /mL，总黄酮质量浓度为 7． 45 mg /mL。
2． 4 不同型号大孔树脂的筛选
分别精密称取 AB － 8、NKA － 9、D101、DHP – 20，这 4
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图 6 山奈素标准曲线图
种预处理好的大孔树脂，每份相当于相应干树脂 10 g，平行
3 份，分别精密量取 100 mL金钱草提取液浸泡各型号大孔
树脂 12 h，时时振摇，待吸附饱和后，滤去多余药液，测定多
余药液中的槲皮素、山奈素以及总黄酮质量浓度;收集吸附
饱和的大孔树脂，以 70%乙醇溶液充分浸泡 12 h，时时振
摇，收集洗脱液，浓缩并定容至 100 mL容量瓶中，分别测定
其中槲皮素、山奈素以及总黄酮的质量浓度，计算吸附率和
洗脱率。由图 7 可知，NKA －9 型大孔树脂对槲皮素、山奈
素和总黄酮的吸附率和洗脱率均较高，因此选择 NKA － 9
型大孔树脂对金钱草醇提液进行纯化。
图 7 大孔树脂型号考察结果
2． 5 动态吸附曲线
取金钱草提取液 200 mL，通过预处理好的 NKA － 9 型
大孔树脂柱(柱体积 50 mL) ，按照 2 BV /h 速度上样，收集
过柱后的液体，每 15 mL收集 1 次，分别测定过柱液中槲皮
素、山奈素和总黄酮的质量浓度，以流出液份数为横坐标，
槲皮素、山奈素质量浓度总和以及总黄酮质量浓度为纵坐
标，分别绘制动态吸附曲线。由图 8 ～ 9 可知，过柱后的溶
液中槲皮素、山奈素质量浓度在第 7 份时明显增加，总黄酮
在第 13 份时增加明显，综合考虑，选择 90 mL 作为最大上
样量，即 1． 8 BV，此时，槲皮素、山奈素以及总黄酮吸附较
完全。
表 1 药液质量浓度考察结果
药液质量浓度
(g生药 /mL)
槲皮素、山奈素吸附率
(%)
总黄酮吸附率
(%)
0． 3 66． 67 80． 75
0． 5 78． 76 85． 13
0． 7 76． 93 82． 24
2． 6 药液质量浓度的选择
取药液 90 mL，分别调节药液质量浓度为 0． 3、0． 5、0． 7
g 生药 / mL，以 2 BV / h速度通过预处理好的 NKA － 9 型
大孔树脂柱(柱体积 50mL) ，收集各洗脱液，定容至 250
图 8 槲皮素、山奈素动态吸附曲线
图 9 总黄酮动态吸附曲线
mL，测定其中槲皮素、山奈素及总黄酮质量浓度，计算吸附
率。由表 1 可知，选择 0． 5 g 生药 /mL 为上样药液质量浓
度较好。
2． 7 上样速度考察
按实验确定的最大上样量，分别以 1、2、3 BV /h的速度
通过预处理好的 NKA － 9 型大孔树脂柱(柱体积 50 mL) ，
收集各流出液，定容至 250 mL，测定其中槲皮素、山奈素及
总黄酮的质量浓度，由表 2 可知，2 BV /h 为较理想的上样
速度。
表 2 上样速度考察结果
流速
(BV /h)
槲皮素、山奈素吸附率
(%)
总黄酮吸附率
(%)
1 96． 24 96． 38
2 96． 70 96． 25
3 95． 26 94． 33
表 3 径高比考察结果
径高比 槲皮素、山奈素吸附率(%) 总黄酮吸附率(%)
1 ∶ 3 93． 09 92． 82
1 :6 94． 68 93． 15
1 ∶ 9 96． 56 94． 71
1 ∶ 12 96． 94 94． 47
1 ∶ 15 96． 44 94． 50
2． 8 树脂柱径高比筛选
设置径高比分别为 1 ∶ 3、1 ∶ 6、1 ∶ 9、1 ∶ 12、1 ∶ 15 进行考
察，取药液一定量，按实验确定的最大上样量，按 2 BV /h速
度通过预处理好的 NKA － 9 型大孔树脂柱(柱体积 100
mL) ，收集各洗脱液，定容至 250 mL，测定其中槲皮素、山
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奈素及总黄酮质量浓度，计算吸附率。表 3 显示，树脂柱径
高比 1 ∶ 9 ～ 1 ∶ 15 时槲皮素、山奈素及总黄酮吸附率均较
高* 。
2． 9 洗脱溶媒的选择
分别取金钱草提取液一定量，按最大上样量以 2 BV /
h速度上样于预处理好的 NKA － 9 型大孔树脂柱(柱体积
50 mL) ，适量水洗，Molish 反应阴性后，分别以 5 倍柱体积
的 10%、30%、50%、70%、90%乙醇洗脱树脂柱，收集各洗
脱液，定容至 250 mL，分别测定其中槲皮素、山奈素及总黄
酮的质量浓度，计算洗脱率，由表 4 可知，70% * 乙醇洗脱
率较高。
表 4 洗脱溶媒考察结果
溶媒 槲皮素、山奈素洗脱率 (%) 总黄酮洗脱率(%)
10%乙醇 19． 44 20． 14
30%乙醇 38． 19 32． 09
50%乙醇 77． 08 62． 54
70%乙醇 82． 20 89． 06
90%乙醇 67． 51 81． 89
2． 10 洗脱溶剂用量的选择
按实验确定的最大上样量，取金钱草提取液适量上样
于预处理好的 NKA － 9 型大孔树脂柱(柱体积 72 mL) ，适
量水洗，直至 Molish反应阴性，用 70%乙醇洗脱树脂柱，洗
脱流速为 2 BV /h，收集洗脱液，每 45 mL收集一份，共收集
8 份，分别测定各洗脱液中有效成分及总黄酮的质量浓度。
由表 5 及图 10 ～ 11 可知，当洗脱至第 6 份溶液，即 4 倍柱
体积时，可洗脱 94． 11%的槲皮素、山奈素及 92． 20%的总
黄酮，继续增加洗脱剂量，洗脱率变化不大，从工业生产节
约成本考虑，故选择洗脱剂量为 4 倍柱体积。
表 5 洗脱剂量考察结果
洗脱液编号 槲皮素、山奈素洗脱率(%) 总黄酮洗脱率(%)
1 26． 22 22． 29
2 51． 04 31． 22
3 11． 67 28． 34
4 3． 16 7． 33
5 1． 33 2． 74
6 0． 69 0． 28
7 0． 42 0． 31
8 0． 14 0． 45
图 10 槲皮素、山奈素洗脱曲线
2． 11 验证实验
取预处理好的 NKA － 9 型大孔树脂湿法装柱，调节径
高比为 1 ∶ 10，柱体积 100 mL，将 0． 5 g 生药 /mL 浓度的金
图 11 总黄酮洗脱曲线
钱草提取液以 2 BV /h的速度上柱吸附，最大上样量为 1． 8
BV，水洗至 Molish反应阴性(约 3 ～ 4 BV) ，用 4 BV的 70%
乙醇溶液洗脱树脂柱，收集洗脱液，测定槲皮素、山奈素及
总黄酮转移率，同时测定出膏率，实验平行进行 3 次，表 6
结果表明实验所选大孔树脂纯化工艺稳定可行。
表 6 验证试验结果
编号
槲皮素、山奈素转移率
(%)
总黄酮转移率
(%)
出膏率
(%)
1 85． 51 87． 35 1． 93
2 85． 16 86． 93 1． 95
3 85． 98 87． 25 1． 94
3 讨 论
综合考虑树脂对槲皮素、山奈素和总黄酮的吸附率和
洗脱率，NKA －9 型大孔树脂对金钱草总黄酮纯化效果较
好。通过本实验的考察，选择树脂柱径高比为 1 ∶ 9 ～ 1 ∶
15，药液质量浓度为 0． 5 g生药 /mL以 2 BV /h的速度上柱
吸附，最大上样量 1． 8 BV，用 4 BV的 70%乙醇溶液洗脱树
脂柱作为金钱草总黄酮的分离纯化工艺。
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