全 文 ：蝴蝶兰原球茎诱导因素初探
范树国1 ,2 , 李应安1 , 邱 璐1 ,2＊ , 杨海艳1 , 李国树1 ,2 , 梁晓华1 ,2 , 李易洲1 , 谢美华1 , 胡 超1
(1.楚雄师范学院化学与生命科学系 ,云南楚雄 675000;2.滇中高原生物资源开发与利用研究所 ,云南楚雄 675000)
摘要　[目的] 探讨不同培养基配方诱导蝴蝶兰原球茎的效果及其诱导因素。[方法] 以蝴蝶兰(f001和 f006)试管苗根尖和叶为外植体 ,
以MS 和KC为基本培养基 ,分别添加不同浓度的6-BA、NAA和活性炭 ,各设置 16个处理组进行原球茎诱导 ,研究其对诱导蝴蝶兰原球茎
效果的影响。[结果] 在KC+6-BA 1.0 mg/ L+NAA 0.3 mg/L+AC 0.3%的培养基中 ,蝴蝶兰 f006根段原球茎状体的诱导率可达 20%;
f001根段的诱导培养基配方采用KC+6-BA 1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+AC 0.2%,其原球茎的诱导率达17%, f001叶片的诱导培养基配方
采用KC+6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/ L+AC 0.1%,其原球茎的诱导率达 10%。[结论]该研究中所用的 6-BA和NAA激素和活性炭浓
度在MS和KC培养基上对蝴蝶兰原球茎的诱导影响均不显著;不同外植体在不同培养基中其适宜的外源激素浓度与组合也不同。
关键词　蝴蝶兰;根段;叶片;原球茎;诱导
中图分类号　S603.6　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)03-00976-03
Preliminary Study on Influential Factors on Induction of Phalaenopsis Protocorm
FAN Shu-guo et al　(Department of Chemistry and Life Science , Chuxiong Normal University ,Chuxiong ,Yunnan 675000)
Abstract　[ Objective] The study aimed to discuss the effects of different media formulas for inducing Phalaenopsis protocorm and their inducing factors.
[Method] With the root tip and leaf of Phalaenopsis(f001and f006)test-tube shoots as explants , the MS and KC were taken as the basic medium adding
different concn.of 6-BA and NAA and activated carbon resp.to set up the 16 treatments for protocorm induction and their effect on inducing Phalaenopsis
protocorm were studied.[ Result] In the medium of KC+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/ L+AC 0.3%, the protocorm induction rate of Phalaenopsis
f006 root segment was 20%.When the induction mediums for f001 root segment was KC+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/ L+AC 0.2%, the protocorm
induction ratewas 17%.When the induction mediums for leaves was KC+6-BA 4.0 mg/ L+NAA 0.2 mg/L+AC 0.1%, the protocorm induction rate
was 10%.[ Conclusion] Therewas no significant effect of 6-BA and NAAhormones and the activated carbon concn.on the induction of Phalaenopsis proto-
corm on MS and KC medium.The different explants on different medium had different exogenous hormone concn.and matching.
Key words　Phalaenopsis;Root segment;Leaf;Protocorm;Induction
基金项目　国家自然科学基金项目(30660091);云南省应用基础研究
计划(2006C0084M , 2006C0086M);云南省中青年学术技术
带头人后备人才培养计划(2006PY01-61);楚雄州学术技术
带头人项目(200401);楚雄师范学院重点学科建设项目
(05YJJSXK03);楚雄师范学院学术带头人专项(05Y-
JDTR08)。
作者简介　范树国(1965-),男 ,河北青县人 ,博士 ,教授 ,从事生物化
学及分子生物学研究。 ＊通讯作者。
收稿日期　2008-11-10
　　蝴蝶兰(Phalaenopsis)为兰科蝴蝶兰属植物 ,为单轴型兰
花 ,很少有侧芽萌发 ,自然靠无性花梗繁殖率极低。应用植
物组织培养技术进行蝴蝶兰快速繁殖可以缩短繁育周期 ,获
得大量成株 ,并且可以保持优良性状 ,保护种质资源[ 1] 。目
前 ,蝴蝶兰快繁途径主要有:利用各种外植体诱导类原球茎 ,
进而诱导分生苗实现快繁[ 2-3] ,不经愈伤组织直接诱导丛生
芽[ 2, 4] ;近年来 ,也出现通过诱导愈伤组织途径进行植株再生
的研究[ 5-9]以及花葶培养[ 10] 、试管分株[ 11]等方法 。
蝴蝶兰人工繁殖主要通过种子无菌发芽和组织离体培
养两条途径进行 ,离体茎尖 、叶片等经培养后产生原球茎
(PLB)。PLB的发生途径可通过愈伤组织[ 12] 或由茎尖[ 13-14] 、
幼叶[ 3, 6 , 14]等器官直接产生[ 2, 1 5 ] ,再通过 PLB 的增殖 、分化
培养而得到大量幼苗[ 13 , 15] 。由于蝴蝶兰是一种杂交品系 ,因
此前者虽然简单易行 ,短期内可获得大量幼苗 ,但是有性后
代变异率高 ,除了少数白花系列较稳定以外 ,难以形成品质
划一的大规模栽培。而通过离体器官诱导原球茎快繁法获
得试管苗品质基本一致 ,增殖系数较高 ,变异型较少 ,适合大
规模繁殖[ 6 , 13-14] ,并形成所谓“兰花工业” 。以上 2种快繁方
法都有不少报道 ,但以不同激素 、培养基和添加物组合进行
蝴蝶兰茎尖诱导PLB的系统研究却不多见[ 16] 。该研究旨在
筛选出适合于研究中所用的蝴蝶兰PLB的诱导方案 ,为蝴蝶
兰的快速繁殖及转基因研究提供好的再生系统。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　材料。蝴蝶兰无菌苗 Dtps.coral Gleam ×P.zuma
Rose-Samson D×f001(1296);P .firedance “SFIL”f006(1294)。
1.1.2　培养基。MS和KC培养基。
1.1.3　培养条件。温度(25±1)℃;光照强度 1 000 ～ 1500
lx;光照时间 15 h/d。
1.2　方法
(1)以MS 为基本培养基诱导 PLB ,分别添加不同浓度
6-BA(2.0 、3.0 、4.0 、5.0mg/L)、NAA(0、0.1、0.5、1.0mg/L)、新
鲜椰汁(15.0%)和活性炭(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%),形成
16个处理组 ,每个处理组 10瓶 ,接种 f006 ,叶和根各接种 5
瓶 ,每组 40个外植体。
(2)以KC 为基本培养基诱导 PLB ,分别添加不同浓度
6-BA(1.0 、2.0 、3.0 、4.0 mg/L)、NAA (0、0.1、0.2 、0.3 mg/L)和
活性炭(0、0.1%、0.2%、0.3%),形成 16个处理组 ,每个处理
组 4瓶 ,接种 f006和 f001的叶和根 ,每组 30个外植体。
2　结果与分析
PLB是兰科植物组织培养中所产生的特有现象 ,也是兰
花快繁技术中的一个重要形式。在蝴蝶兰组织培养研究中 ,
PLB的诱导是在基础培养基内添加一定种类及浓度的植物
生长调节剂 ,由幼叶 、根 、茎尖等外植体脱分化而产生胚性愈
伤组织 ,进而形成 PLB 。诱导PLB需要较长的时间 ,该研究
是在接种 2个月后 ,对实验结果进行统计。
2.1　f006根切段在MS培养基上诱导PLB结果　实验结果
见表 1。方差分析表明 , 6-BA 、NAA和 AC浓度对蝴蝶兰 f006
根切段在MS培养基上 PLB诱导率的影响不显著。
2.2　f006叶片在MS培养基上诱导 PLB结果　实验结果见
表 2。研究表明 ,实验组没有诱导出PLB。
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2009, 37(3):976-978　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　孙红忠　责任校对　傅真治
表1　f006根切段在MS培养基上诱导 PLB结果
Table 1　Result of PLB induction from f006 root segment inMS medium
处理
Treatment
6-BA
mg/L
NAA
mg/ L
AC
mg/ L
CM
%
产生PLB数量
PLB number
诱导率∥%
Induction rate
Ⅰ-1 2 　0 0.1 15 0 0
Ⅰ-2 2 0.1 0.2 15 0 0
Ⅰ-3 2 0.5 0.3 15 1 2Ⅰ-4 2 1.0 0.4 15 2 5
Ⅰ-5 3 0 0.2 15 0 0
Ⅰ-6 3 0.1 0.1 15 0 0
Ⅰ-7 3 0.5 0.4 15 0 0
Ⅰ-8 3 1.0 0.3 15 0 0
Ⅰ-9 4 0 0.3 15 1 2
Ⅰ-10 4 0.1 0.4 15 0 0
Ⅰ-11 4 0.5 0.1 15 2 5
Ⅰ-12 4 1.0 0.2 15 0 0
Ⅰ-13 5 0 0.4 15 0 0Ⅰ-14 5 0.1 0.3 15 0 0
Ⅰ-15 5 0.5 0.2 15 0 0
Ⅰ-16 5 1.0 0.1 15 0 0
表2　f006叶片在MS培养基上诱导PLB结果
Table 2　Result of PLB induction from f006 leaf in MSmedium
处理
Treatment
6-BA
mg/L
NAA
mg/ L
AC
mg/ L
CM
%
产生PLB数量
PLB number
诱导率∥%
Induction rate
Ⅰ-1 2 　0 0.1 15 0 0
Ⅰ-2 2 0.1 0.2 15 0 0
Ⅰ-3 2 0.5 0.3 15 0 0
Ⅰ-4 2 1.0 0.4 15 0 0
Ⅰ-5 3 0 0.2 15 0 0
Ⅰ-6 3 0.1 0.1 15 0 0
Ⅰ-7 3 0.5 0.4 15 0 0
Ⅰ-8 3 1.0 0.3 15 0 0
Ⅰ-9 4 0 0.3 15 0 0Ⅰ-10 4 0.1 0.4 15 0 0
Ⅰ-11 4 0.5 0.1 15 0 0
Ⅰ-12 4 1.0 0.2 15 0 0
Ⅰ-13 5 0 0.4 15 0 0
Ⅰ-14 5 0.1 0.3 15 0 0
Ⅰ-15 5 0.5 0.2 15 0 0
Ⅰ-16 5 1.0 0.1 15 0 0
2.3　f006根切段在 KC培养基上诱导PLB结果　实验结果
见表 3。方差分析表明 , 6-BA 、NAA和AC浓度对蝴蝶兰 f006
根切段在KC培养基上PLB诱导率的影响不显著。
表3　f006根切段在 KC培养基上诱导 PLB结果
Table 3　Result of PLB induction from f006 root segment in KC medium
处理
Treatment
6-BA
mg/L
NAA
mg/ L
AC
mg/ L
产生PLB数量
PLB number
诱导率∥%
Induction rate
Ⅱ-1 1 　0 　0 0 　　0
Ⅱ-2 1 0.1 0.1 0 0Ⅱ-3 1 0.2 0.2 0 0
Ⅱ-4 1 0.3 0.3 6 20Ⅱ-5 2 0 0.1 0 0
Ⅱ-6 2 0.1 0 0 0Ⅱ-7 2 0.2 0.3 0 0
Ⅱ-8 2 0.3 0.2 3 10Ⅱ-9 3 0 0.2 1 3
Ⅱ-10 3 0.1 0.3 3 10Ⅱ-11 3 0.2 0 0 0
Ⅱ-12 3 0.3 0.1 2 6Ⅱ-13 4 0 0.3 0 0
Ⅱ-14 4 0.1 0.2 0 0Ⅱ-15 4 0.2 0.1 0 0
Ⅱ-16 4 0.3 0 0 0
2.4　f006叶片在 KC培养基上诱导 PLB结果　实验结果见
表 4。方差分析表明 , 6-BA 、NAA和AC浓度对蝴蝶兰 f006叶
片在 KC培养基上PLB诱导率的影响不显著。
表 4　f006叶片在 KC培养基上诱导 PLB结果
Table 4　Result of PLB induction from f006 leaf in KC medium
处理
Treatment
6-BA
mg/ L
NAA
mg/ L
AC
mg/ L
产生PLB数量
PLB number
诱导率∥%
Induction rate
Ⅱ-1 1 　0 　0 0 0Ⅱ-2 1 0.1 0.1 0 0
Ⅱ-3 1 0.2 0.2 0 0Ⅱ-4 1 0.3 0.3 0 0
Ⅱ-5 2 0 0.1 0 0Ⅱ-6 2 0.1 0 0 0
Ⅱ-7 2 0.2 0.3 0 0Ⅱ-8 2 0.3 0.2 0 0
Ⅱ-9 3 0 0.2 0 0Ⅱ-10 3 0.1 0.3 2 6
Ⅱ-11 3 0.2 0 0 0Ⅱ-12 3 0.3 0.1 0 0
Ⅱ-13 4 0 0.3 0 0Ⅱ-14 4 0.1 0.2 0 0
Ⅱ-15 4 0.2 0.1 0 0Ⅱ-16 4 0.3 0 0 0
2.5　f001根切段在 KC培养基上诱导 PLB结果　实验结果
见表 5。方差分析表明 , 6-BA 、NAA和 AC浓度对蝴蝶兰 f001
根切段在KC培养基上 PLB诱导率的影响不显著。
表 5　f001根切段在 KC培养基上诱导 PLB结果
Table 5　Result of PLB induction from f001 root segment in KCmedium
处理
Treatment
6-BA
mg/ L
NAA
mg/ L
AC
mg/ L
产生PLB数量
PLB number
诱导率∥%
Induction rate
Ⅱ-1 1 　0 　0 0 0
Ⅱ-2 1 0.1 0.1 0 0
Ⅱ-3 1 0.2 0.2 5 16
Ⅱ-4 1 0.3 0.3 0 0
Ⅱ-5 2 0 0.1 0 0
Ⅱ-6 2 0.1 0 0 0
Ⅱ-7 2 0.2 0.3 0 0
Ⅱ-8 2 0.3 0.2 0 0
Ⅱ-9 3 0 0.2 0 0
Ⅱ-10 3 0.1 0.3 4 13
Ⅱ-11 3 0.2 0 0 0
Ⅱ-12 3 0.3 0.1 2 6
Ⅱ-13 4 0 0.3 0 0
Ⅱ-14 4 0.1 0.2 0 0
Ⅱ-15 4 0.2 0.1 0 0
Ⅱ-16 4 0.3 0 0 0
2.6　f001叶片在KC培养基上诱导 PLB结果　实验结果见
表 6。方差分析表明 , 6-BA 、NAA和AC浓度对蝴蝶兰 f001叶
片在 KC培养基上PLB诱导率的影响不显著。
3　结论与讨论
蝴蝶兰 PLB诱导是实现工厂化育苗 、保持种苗优良性状
一致的重要环节 ,也是兰花发育生物学 、基因工程等相关研
究的重要技术基础。研究兰花高效的 PLB诱导 、增殖体系不
仅具有重要的应用价值 ,而且在基础理论研究方面也具有重
要意义 。影响蝴蝶兰 PLB诱导 、形成的因素比较多 ,但主要
包括培养基类型 、外源激素的组成及浓度 、外植体种类 、有机
物的添加等方面[ 6 , 14, 16] 。该研究结果表明 ,不同外植体在不
同培养基中适宜的外源激素浓度与组合不同;植物材料不
97737卷 3期　　　　　　　　　　　　　　　　范树国等　蝴蝶兰原球茎诱导因素初探
同 ,诱导率也有一定的差异。
在MS培养基中 ,蝴蝶兰 f006的叶片未诱导出PLB ,而且
接种 40 d后开始变褐死亡 。原因有可能跟蝴蝶兰叶片含有
大量的酚类物质以及培养条件等有关 ,还需进一步研究。
表 6　f001叶片在 KC培养基上诱导PLB结果
Table 6　Result of PLB induction from f001 leaf in KCmedium
处理
Treatment
6-BA
mg/L
NAA
mg/ L
AC
mg/ L
产生PLB数量
PLB number
诱导率∥%
Induction rate
Ⅱ-1 1 　0 　0 0 0
Ⅱ-2 1 0.1 0.1 0 0
Ⅱ-3 1 0.2 0.2 0 0
Ⅱ-4 1 0.3 0.3 1 3
Ⅱ-5 2 0 0.1 0 0
Ⅱ-6 2 0.1 0 0 0
Ⅱ-7 2 0.2 0.3 0 0
Ⅱ-8 2 0.3 0.2 0 0
Ⅱ-9 3 0 0.2 0 0
Ⅱ-10 3 0.1 0.3 0 0
Ⅱ-11 3 0.2 0 0 0
Ⅱ-12 3 0.3 0.1 0 0
Ⅱ-13 4 0 0.3 0 0
Ⅱ-14 4 0.1 0.2 0 0
Ⅱ-15 4 0.2 0.1 2 6
Ⅱ-16 4 0.3 0 0 0
　　从整个实验来看 ,诱导率偏低 ,需要进一步研究以提高
诱导率。前人研究表明 ,不同蝴蝶兰PLB的诱导率在不同环
境条件下各不相同。马杰等在 MS+6-BA 5.0 mg/L +NAA
2.0 mg/L+香蕉泥 10.0%+AC 0.3%的培养基中 ,叶片原球
茎状体的诱导率可达 48.6%;花梗腋芽和茎尖适宜的诱导培
养基配方均为MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 2.0mg/L+CM 15.0
%+AC 0.3%,其原球茎状体的诱导率分别达 72.2 %和
64.3%[ 17] ;崔广荣等利用蝴蝶兰试管苗(品种为条纹花系霍
娅淑女 ,在 1/2MS+NAA 2.0 mg/L+6-BA 4.0mg/L诱导效果
最好 ,诱导率达 65.0%,但是也有诱导不出PLB的[ 18] 。
黑暗预处理对蝴蝶兰组培中外植体褐化有影响 ,赵伶俐
等研究表明 ,黑暗预处理能减轻褐化 ,其中以预处理 10 d 的
褐化最轻[ 19] 。在蝴蝶兰组织培养过程中 ,伤口极易分泌酚
类化合物而造成褐化现象[ 20] ,在培养基中添加 1～ 2 g/L活
性炭 ,适时切除培养物的褐化部分及时更换新鲜培养基 ,能
有效地抑制外植体褐变死亡的发生[ 21] 。在KC培养基中 ,没
有加活性炭的处理组外植体较早死亡 ,可见其重要性。此
外 ,防止褐化还应注意外植体的选取 ,张秀青等发现外植体
切块太小很容易发生褐变[ 3] 。所以 ,在该实验中采取黑暗预
处理 10 d ,在培养基中添加不同浓度活性炭 ,接种时切除培
养物及外植体上的褐化部分 ,有效抑制了外植体的褐化。
组织培养中常用的细胞分裂素有 6-BA 、2-iP 、KT 、ZET等 ,
生长素有 2 ,4-D 、NAA 、IBA 、IAA等 ,而在蝴蝶兰组培中 ,很多
研究者仅用 6-BA和 NAA ,其中 , 6-BA 的浓度在 1.0 ～ 5.0
mg/L之间 ,NAA的浓度在 0～ 1.0 mg/L之间[ 2-3 ,12 , 17] ,故该实
验也仅用了这 2种激素。该研究采用了 6-BA和NAA各 4个
水平 ,另外还添加了不同浓度的活性炭 ,从统计分析结果看:
6-BA 、NAA和AC 浓度对蝴蝶兰 PLB诱导率的影响均不显
著。导致这样的结果 ,原因可能是所选取的激素浓度不合
适 ,在以后的研究中应改变激素浓度梯度;还可考虑增加不
同激素种类 ,设置不同浓度梯度;此外 ,通过延长结果的统计
时间 ,有可能在几个月后PLB会大量诱导出来。
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978 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年