全 文 ：书收稿日期:2012-03-09; 修订日期:2012-09-18
作者简介:王加文( 1980-) ，男( 汉族) ，江西永丰人，现任广西中医学院讲
师，硕士学位，主要从事中药资源相关教学科研工作．
* 通讯作者简介:张寿文( 1972-) ，男( 汉族) ，江西吉安人，现任江西中医
学院教授，博士学位，主要从事中药资源开发利用教学研究工作．
紫花羊耳蒜原球茎诱导与分化研究
王加文1，2，高 丹1，李风琴1，毛志珍1，毛金娣1，张寿文1*
(1．江西中医学院，江西 南昌 330004; 2．江西省医药学校，江西 南昌 330200)
摘要:目的 研究基本培养基与添加物及植物激素对紫花羊耳蒜种子原球茎诱导与分化。方法 比较不同培养基与添加
物对原球茎生长分化的作用，用正交实验探索不同激素对原球茎生长分化最佳浓度配比。结果 在 1 /2MS、MS、KC 培养
基中，1 /2MS最适于紫花羊耳蒜种子萌发; 添加椰乳 100 ml /L、AC 0． 05%对萌发及分化均有促进作用; 植物激素 6 － BA、
NAA对原球茎生长分化有显著影响，KT无明显效果。结论 紫花羊耳蒜种子原球茎诱导分化适宜基本培养基为 1 /2MS，
最佳激素组合为 6 － BA3． 0 mg /L + NAA0． 5mg /L。
关键词:羊耳蒜; 种子萌发; 原球茎; 分化
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 12． 096
中图分类号:S567 文献标识码:B 文章编号:1008-0805( 2012) 12-3157-02
紫花羊耳蒜 Liparis nigra Seidenf．为兰科羊耳蒜属植物，全草
具有破瘀活血、除湿、清热解毒的功效，用于风湿痹痛、皮炎、跌打
损伤、疮疡肿毒［1］。由于生态的破坏和过度的采掘，现已在全球
处于濒危阶段，成为国际贸易公约规定的保护野生兰科植物的一
种。兰科植物的组织培养始于 20 世纪 60 年代，Morel［2］采用大
花蕙兰的茎尖，在含有细胞分裂素的 KC 培养基上进行培养，茎
尖分生组织膨大形成原球茎，并分化出根和叶，首次获得兰花无
病毒小植株。目前，兰科植物中，组织培养方法多用于大花蕙兰、
蝴蝶兰以及其它杂交观赏兰花的生产，国内外尚无关于紫花羊耳
蒜的任何报道。为此，本文对紫花羊耳蒜种子无菌萌发及原球茎
分化进行了研究，旨在为其快速繁殖体系的建立打下基础。
1 材料
植物材料采自江西宜丰官山自然保护区紫花羊耳蒜 Liparis
nigra Seidenf．(经江西中医学院赖学文教授鉴定) ，于 2010 年 11
月份采集成熟未开裂的果实，置于冰箱 4℃保存。
2 方法
2． 1 种子无菌萌发
2． 1． 1 培养基筛选 1 /2MS(大量元素减半)、MS、KC培养基。
2． 1． 2 添加物比较 以 1 /2MS 为基本培养基，分别附加香蕉匀
浆物 100 g /L、马铃薯匀浆物 100 g /L、椰乳 100 ml /L、AC(活性
炭)0． 05%。培养基均添加蔗糖 20 g /L、琼脂粉 5． 6 g /L，pH5． 8。
2． 2 原球茎分化
2． 2． 1 激素处理 以 MS为基本培养基，选用正交表 L9(3
4)前 3
列安排 6 － BA、NAA、KT 的 3 因素 3 水平实验，共 9 个处理(见
表 1)。
2． 2． 2 添加物比较 以 MS 培养基，激素用量为 6 － BA 3． 0 mg /
L、NAA 0． 5 mg /L，添加物同“种子无菌萌发”。
2． 3 材料处理 选择成熟未开裂的蒴果，流水冲洗 10 min 后，在
超净工作台上用 75%酒精浸泡 30 s，无菌水冲洗 1 ～ 2 遍，再用
0． 1%HgCl2 浸泡 8 ～ 10min，用无菌水将材料冲洗 4 ～ 5 遍，放置
在灭菌的附加滤纸的培养皿上吸干水备用。将灭过菌的果实在
无菌状态下切开，将种子均匀撒于无菌萌发培养基中，共 7 个处
理，每处理 5 瓶，每瓶接种约 500 粒种子。当原球茎长至相当大
小，在无菌状态下转接至分化培养基中进行继代培养，共 13 个处
理，每个处理接种 5 瓶，每瓶 10 个原球茎。
2． 4 培养条件 种子接种到萌发培养基上后，暗培养一段时间，
其余阶段均为温度(24 ± 2)℃，光照 10 ～ 12 h /d，光照强度为
1200 ～ 1600 Lx，培养室湿度 60% ～70%。
2． 5 数据统计 接种后观察种子萌发过程，6 个月后统计萌发率
(种子萌发率 =原球茎数 /接种种子数 × 100%) ;分化培养 3 个
月后在数字显微镜下观察原球茎形成的不定芽，记录其直径、长
度。数据经整理后用 SPSS统计分析软件对试验数据进行分析。
表 1 正交实验因素水平表
水平 Level
A
6 － BA
B
NAA
C
KT
1 1． 0 0 0
2 2． 0 0． 5 0． 1
3 3． 0 1． 0 0． 2
3 结果
3． 1 基本培养基对紫花羊耳蒜种子萌发的影响 紫花羊耳蒜种
子极为细小，白色至黄白色，长约 0． 075 mm，宽约 0． 022 mm，呈
纺锤体，一端较尖，闭合，另一端微钝，具种孔。接种后的培养基
表面播种的种子开始变白，有些透明感，并逐渐膨大，约 2 个月
后，白色的种子开始转为黄绿色、绿色。其中的球形胚生长突破
种皮，成为原球茎，但这时的原球茎很小，使其在培养基上继续生
长，约 4 个月后，原球茎大多长到 0． 5 ～ 1 mm，进行转接培养。紫
花羊耳蒜种子在 1 /2MS 培养基上萌发率最高，约为 78． 03%(因
种子为粉末状，非常细小，无法精确统计其数量)。详见表 2;与
MS、KC培养基相比 1 /2MS培养基启动萌发最快，接种后 60 天便
开始萌发;MS培养基是三种培养基中启动萌发最慢，且萌发率最
低的，KC 培养基虽启动萌发慢，但其萌发率相对较高达到了
76． 78%。由此得出，1 /2MS 培养基、KC 培养基都较适于紫花羊
耳蒜的无菌萌发，并且其萌发受培养基中无机盐浓度的影响，较
低的无机盐浓度适合其萌发，这与前人对兰科植物种子无菌萌发
的研究结果相符［3，4］。
3． 2 添加物对紫花羊耳蒜种子萌发的影响 试验中，用四种培养
基添加物作比较，结果表明，培养基不同添加物对羊耳蒜种子萌
发的效果依次为椰乳 ＞活性炭 ＞马铃薯汁 ＞香蕉汁，一定量的
AC和椰乳均促进羊耳蒜种子的萌发，萌发率约达到了 80%，高
于其他添加物培养基及对照(表 2 中 1 /2MS) ，添加椰乳的培养
基启动萌发及萌发率都稍优于 AC处理，且萌发的原球茎长势较
好，生长比较整齐;从启动萌发的时间及萌发率(表 2)来看，添加
了马铃薯和香蕉匀浆物的培养基在一定程度上抑制了羊耳蒜种
子的萌发，且种子萌发比较分散。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 12 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 12 期
书表 2 基本培养基对种子萌发的影响
培养基 接种数 /粒 萌发数 /粒 萌发率(%)开始萌发时间 t /d
1 /2MS 519 405 78． 03 60
MS 487 83 17． 04 75
KC 491 377 76． 78 68
表 3 添加物对种子萌发的影响
培养基 接种数(粒) 萌发数(粒) 萌发率(%)开始萌发时间 t /d
AC 475 377 79． 37 52
马铃薯 507 136 26． 82 73
椰乳 527 426 80． 83 50
香蕉 489 104 21． 27 75
3． 3 不同激素配比对原球茎生长分化的影响 试验发现，接种后
不同处理的原球茎均能分化成不定芽，但不定芽的生长状况存在
差异，正交试验结果(表 4)表明，不同配比植物激素 6 － BA、
NAA、KT对羊耳蒜不定芽直径及长度均有不同程度的影响。从
表 5 方差分析结果可知，NAA对羊耳蒜不定芽直径影响最大，三
种激素作用效果依次为:NAA ＞ 6 － BA ＞ KT，其他物质相同的情
况下，不定芽直径随 NAA、6 － BA浓度的升高先增大后减小。为
进一步反映各因素之间的差异，差异性检测结果表明(表 5) ，本
实验条件下 6 － BA(P = 0． 042 ＜ 0． 05)和 NAA(P = 0． 026 ＜ 0． 05)
对不定芽直径影响存在显著差异，KT 水平对不定芽直径的影响
不明显。因此，可初步判断激素配比最优组合是 A3B2C3。
表 4 原球茎分化正交实验结果
试验
号
因素 C /mg·L －1
A B C 空白 Blank
不定芽
直径 l /μm 长度 l /mm
1 1． 0 0 0 1 1320． 49 2． 68
2 1． 0 0． 5 0． 1 2 1969． 09 3． 84
3 1． 0 1． 0 0． 2 3 1535． 5 3． 42
4 2． 0 0 0． 1 3 1775． 41 3． 92
5 2． 0 0． 5 0． 2 1 2054． 69 4． 74
6 2． 0 1． 0 0 2 1359． 65 3． 66
7 3． 0 0 0． 2 3 1450． 65 4． 54
8 3． 0 0． 5 0． 1 2 1592． 01 6． 26
9 3． 0 1． 0 0 1 1407． 75 5． 78
表 5 不定芽直径方差分析结果
源 III 型平方和 自由度 df 均方 F Sig．
校正模型 451776． 760a 6 75296． 127 21． 411 ． 045
截距 2． 383E7 1 2． 383E7 6776． 504 ． 000
NAA 262974． 995 2 131487． 497 37． 389 0． 026
6 － BA 158904． 788 2 79452． 394 22． 592 ． 042
KT 29896． 977 2 14948． 488 4． 251 0． 190
误差 Error 7033． 533 2 3516． 776
从各处理中不定芽长度可知，激素配比对羊耳蒜不定芽长度
影响较大，三种激素的作用强弱依次为:6 － BA ＞ NAA ＞ KT，根据
不定芽长度极差分析结果(表 6) ，最佳试验组合应为 A3B2C2，而
方差分析结果表明，本实验条件下 KT水平对试验结果影响不显
著，6 － BA 对不定芽长度的影响存在极显著差异(P = 0． 006 ＜
0． 01) ，NAA具有显著差异(P = 0． 045 ＜ 0． 05)。综合不同激素配
比组合对羊耳蒜不定芽直径、长度的作用结果，本着经济、节约的
原则，最佳试验方案定为 A3B2C1，即 6 － BA3． 0mg /L + NAA0．
5mg /L。此试验中，KT试验效果不显著可能系水平设计不合理
导致，在以后的实验中应注意选择合适的激素的浓度配比，从而
获得最有利于羊耳蒜原球茎分化的最佳效果。
3． 4 添加物对原球茎分化的影响 表 7 结果表明，不同附加物中
椰乳和 AC对紫花羊耳蒜原球茎生长分化的效果最好，香蕉汁和
马铃薯没有明显效果。从形成的不定芽的直径来看，加椰乳和活
性炭处理不定芽直径分别为 1718． 17 μm;为 1718． 13 μm，显著大
于香蕉匀浆物中不定芽直径，极显著大于加马铃薯匀浆物培养基
中生长的不定芽直径;从不定芽的长度来看，加椰乳的培养基生
长的紫花羊耳蒜的长度最长为 5． 42 mm，加活性炭为 5． 40 mm，
显著长于马铃薯和香蕉汁中原球茎长度。
表 6 不定芽长度方差分析表
源 III 型平方和 自由度 df 均方 F Sig．
校正模型 9． 830a 4 2． 458 15． 974 ． 010
截距 167． 616 1 167． 616 1089． 517 ． 000
NAA 2． 285 2 1． 143 7． 428 0． 045
6 － BA 7． 545 2 3． 772 24． 520 ． 006
误差 Error 0． 615 4 0． 154
表 7 添加物对原球茎生长的影响
添加物 不定芽直径 l /mm 不定芽长度 l /μm
AC 5． 40 Aa 1718． 13 Aa
椰乳 5． 42 Aa 1718． 17 Aa
对照 4． 26 Ab 1692． 01 Aa
香蕉 3． 44 Bc 1673． 11 Ab
马铃薯 3． 58 Bc 1546． 57 Bc
表中大写字母表示，P ＜ 0． 01;小写字母表示 P ＜ 0． 05
实验结果表明加了椰乳的培养基最有利于紫花羊耳蒜原球
茎的生长，其次是加活性炭的培养基，加马铃薯匀浆物和香蕉匀
浆物的培养基不利于紫花羊耳蒜原球茎的生长。可能是椰乳中
含有丰富的营养和生长素类物质，而活性炭的添加降低了生长素
的分解，从而促进原球茎的生长分化。
4 讨论
在培养过程中发现，同一培养基小密度区域种子萌发相对较
为迟缓，播种较密集的种子萌发比较迅速，这可能是因为发挥了
种子的群体效应。不同的基本培养基及附加物的选择对紫花羊
耳蒜种子的萌发效果不同。试验中 1 /2MS培养基最适宜紫花羊
耳蒜种子的萌发，不同附加物对种子萌发及原球茎生长分化效果
不一样，100 ml /L椰乳及 0． 05% AC对紫花羊耳蒜无菌萌发及原
球茎生长分化都具有促进作用，香蕉和马铃薯添加物抑制了种子
萌发，但对原球茎生长分化无明显影响。
对于紫花羊耳蒜原球茎分化阶段激素种类及浓度的探索，本
试验只研究了 6 － BA、NAA、KT 三水平所起的作用，而更多激素
及不同水平的组合对原球茎分化的影响还有待进一步研究。在
组织培养中，外植体原球茎生长分化与外源激素的作用密不可
分，其中适当浓度配比的细胞分裂素和生长素最为重要。实验表
明，6 － BA和 NAA配合使用可以对原球茎的分化造成影响，对原
球茎后期形成的不定芽直径和长度均有影响，6 － BA、NAA 的浓
度的改变均有利于羊耳蒜原球茎形成健壮的不定芽，而实验中
KT3个水平对紫花羊耳蒜原球茎的生长无显著影响，可能为水平
设计不合理所致，有待于开展进一步的研究。综合上述因素，得
到紫花羊羊耳蒜组培原球茎分化的最优激素组合为 6 － BA3． 0
mg /L + NAA0． 5mg /L。
参考文献:
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［2］ Morel G． Producing Virus － free Cymbidiuns［J］． Am Orchid Soc Bull，
1960(29) :495．
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培养基筛选［J］．西北农业学报，2010，19(1) :136．
［4］ 孙 叶，包建忠，刘春贵，等．影响春兰、蕙兰杂交种子无菌萌发的
若干因素［J］．江苏农业科学，2010(2) :187．
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时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 12 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 12