全 文 ：［收稿日期］ 20120830(010)
［基金项目］ 云南省应用基础研究项目(2010ZC136) ;大理州科技项目 2011 年州院共建洱海污染矣江实验基地建设项目;大理学院 2011
年中青年学术带头人培养项目
［通讯作者］ * 李海峰，硕士，副教授，从事药用植物生物技术研究，Tel:0872-2251475，E-mail:lihfzh888@ sina． com
·资源与鉴定·
滇重楼种子休眠破除及植株形态发生的研究
李海峰* ，赵昱，袁朗白，胡侃
( 云南省大理学院药学与化学学院，云南 大理 671000)
［摘要］ 目的:在无菌培养条件下探讨植物激素对滇重楼种子休眠破除及植株形态发生的影响。方法:以滇重楼成熟种
子为试验材料，在无菌培养条件下采用正交试验设计研究赤霉素(GA3)、玉米素核苷(ZR)、吲哚乙酸(IAA)及活性炭(AC)对
滇重楼种子休眠破除的影响，并对无菌萌发过程中植株形态发生进行观察。结果:滇重楼种子无菌培养过程中种子萌动的最
佳配比是 GA3-ZR-IAA-AC(1. 0 mg·L
－1 ∶ 1. 0 mg·L －1 ∶ 0. 1 mg·L －1 ∶ 0. 5 g·L －1) ，种子萌动率达 80. 00%，4 种因子对滇重楼种子
萌动率作用大小为 IAA ＞ GA3 ＞ ZR ＞ AC;滇重楼种子无菌培养过程中种子萌发的最佳配比是 GA3-ZR-IAA-AC(1. 0 mg·L
－1 ∶
1. 0 mg·L －1 ∶ 0. 1 mg·L －1 ∶ 0. 5 g·L －1) ，种子萌发率达 66. 66%，4 种因子对滇种楼种子发芽率作用大小为 AC ＞ IAA ＞ ZR ＞
GA3。结论:培养基添加植物激素 GA，ZR，IAA，AC对滇重楼种子休眠破除、种子萌动及萌发有重要影响。
［关键词］ 滇重楼;种子休眠;植物激素;形态发生
［中图分类号］ R282 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2013)05-0161-04
Study on Breaking Seed Dormancy and Plant Morphogenesis
of Paris polyphylla var． yunnanensis
LI Hai-feng* ，ZHAO Yu，YUAN Lang-bai，HU Kan
(College of Pharmacy and Chemistry Yannan Dali University，Dali 671000，China)
［Abstract］ Objective:To explore the effect of phytohormone on the breaking seed dormancy and plant
morphogenesis of Paris polyphylla var． yunnanensis under aseptic culture condition． Method:The mature seeds of
P． polyphylla var． yunnanensis were used for the experimental materials． The effects of gibberellic acid (GA3) ，
trans-zeatin-riboside (ZR) ，3-indolyl-acetic acid (IAA) ，and active carbon (AC)on the breaking seed dormancy
of P． polyphylla var． yunnanensis were investigated under aseptic culture condition by orthogonal experimental
design，at the same time，during the aseptic germination process the plant morphogenesis was observed． Result:
The best ratio for the seed protrusion of P． polyphylla var． yunnanensis was GA3-ZR-IAA-AC 1. 0 mg·L
－1 ∶ 1. 0
mg·L －1 ∶ 0. 1 mg·L －1 ∶ 0. 5 g·L －1，and seed protrusion rate is up to 80. 00% ． The role sequence of four factors on
the seed protrusion rate of P． polyphylla var． yunnanensis has been found to decrease in the order:IAA ＞ GA3 ＞
ZR ＞ AC． The best ratio for the seed germination of P． polyphylla var． yunnanensis is:GA3-ZR-IAA-AC 1. 0 mg·
L －1 ∶ 1. 0 mg·L －1 ∶ 0. 1 mg·L －1 ∶ 0. 5 g·L －1，and seed germination rate is up to 66. 66% ． The role sequence of four
factors on the seed germination rate of P． polyphylla var． yunnanensis was found to decrease in the order:AC ＞
IAA ＞ ZR ＞ GA3. Conclusion:Adding the phytohormone GA，ZR，IAA，and AC into the culture medium has very
important influence on the breaking seed dormancy，seed protrusion and germination of P． polyphylla var．
yunnanensis．
［Key words］ Paris polyphylla var． yunnanensis;seed dormancy;phytohormone;morphogenesis
·161·
第 19 卷第 5 期
2013 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 5
Mar．，2013
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2013.05.010
滇重楼为延龄草科多年生草本植物，别名云南
重楼、草河车、独脚莲，主要分布在云南、贵州、四川
等地，以根状茎入药，具有抗肿瘤、止血、免疫调节和
镇静镇痛等作用［1］。滇重楼为云南道地药材，是云
南白药系列、宫血宁、热毒清等中成药的主要原料
之一［2］。
滇重楼野生资源是药厂原料的主要来源，随着
药厂对药材需求量增加，经过长期的采挖给滇重楼
野生种质资源带来毁灭性破坏，野生种质资源濒临
灭绝。滇重楼已经被列为国家重点保护野生药材濒
危物种［3］，是云南 30 个重要濒危药用植物之
一［4-5］。通过人工栽培是解决药材资源紧缺、实现
资源可持续利用的有效途径，但在如何缩短滇重
楼种胚形态学后熟和生理学后熟期、提高种子萌
发率、缩短育苗周期等方面研究没有取得突破性
进展，成为人工种植滇重楼的主要限制因素。因
此，本项目拟以滇重楼成熟种子为实验材料，在离
体培养条件下采用正交试验设计研究赤霉素
(GA3)、玉米素核苷(ZR)、吲哚乙酸(IAA)及活性
炭(AC)对滇重楼种子无菌萌发的影响，并对无菌
萌发过程中植株形态发生进行观察，以期能在无
菌培养条件下解除滇重楼种休眠、提高种子萌发
率，为滇重楼种子育苗、组织培养快速繁殖等研究
提供理论依据。
1 材料
1. 1 仪器 AIRTECH 型超净工作台(苏净集团安
泰公司制造) ，MGC-300H 型智能型人工气候箱(上
海一恒科技有限公司) ，SPX-250B-G 型微电脑光照
培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂) ，YXQ-
LS-30SⅡ型立式压力蒸气灭菌器(上海博讯实业有
限公司医疗设备厂) ，BCD-276AK4KELON 型冰箱
(广东科龙电器股份有限公司) ，AB104 型电子天平
(瑞士 Mettletoledo 公司) ，pHS-4CT 型精密酸度计，
Canon EOS600D型数码相机。
1. 2 试药 CA3，ZR，IAA，AC 及其他无机试剂均
为国药集团化学试剂有限公司生产的分析纯，琼脂
(日本进口分装)。
试验材料为 2011 年采自云南省云龙县关坪镇
滇重楼种植基地的滇重楼成熟果实，并经云南省大
理学院药学与化学学院李海峰副教授鉴定为延龄草
科滇重楼 Paris polyphylla Smith var． yunnanensis
(Franch．)Hand． -Mazz果实，果实搓去果皮，自来水
充分漂洗后自然晒干，备用。
2 方法
2. 1 外植体的灭菌 外植体为在 4 ℃下湿沙层积
60 d 的滇重楼种子，外植体用自来水洗净，在无菌
操作台上用 70%的乙醇浸泡 60 s，0. 1% HgCl2 加聚
山梨酯(吐温 80)数滴溶液消毒杀菌 8 ～ 10. 0 min，
无菌水洗涤 5 次，用无菌滤纸吸干水分备用。
2. 2 试验设计 滇重楼种子离体条件下培养基中
GA3，ZR，IAA，AC设为 4 种不同配比，每个因子取 3
个水平，因子水平设计见表 1，采用 L9(3
4)正交表;
以培养基中不添加 GA3，ZR，IAA，AC 为对照。通过
综合各因子得出滇重楼种子无菌培养种子萌动的最
佳组合并用此方法进行验证性实验，对实验结果的
正确性进行验证。
表 1 培养基中 4 种成分配比 L9(34)因子水平
因子水平
A
GA3
/mg·L －1
B
ZR
/mg·L －1
C
IAA
/mg·L －1
D
AC
/g·L －1
1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 5
2 1. 0 1. 0 1. 0 1. 0
3 2. 0 2. 0 2. 0 2. 0
2. 3 培养基制备及培养条件 培养基以 B5(1968)
培养基［6］作为基本培养基，培养基中分别添加蔗糖
30 g·L －1、琼脂 8. 0 g·L －1，按试验设计加入 AC，120
℃高压灭菌 15 min，在无菌操作台上将经过高压灭
菌的培养基冷却到约 80 ℃，再在无菌操作条件下按
试验设计将不同组合质量浓度的 GA3，ZR，IAA 溶
液用细菌过滤器过滤灭菌后加入到培养基中混匀，
培养基冷却凝固，每瓶接种 3 粒种子，每个处理接种
10 瓶，每个试验重复 3 次。
培养条件为 20 ℃ /25 ℃变温培养，相对湿度
70%，光照强度 1 500 lx，光周期 16 h·d －1。
2. 4 结果统计与分析 每周按时观察种子萌发情
况 1 次，并用 Canon EOS600D 数码相机拍照，记录
种子萌发情况。培养 60 d统计种子萌动数，以胚根
(或胚芽)开始膨大突破种皮视为萌动，种子萌动率
(%)为胚根突破种皮种子数占接种种子数的质量
分数。培养 90 d统计种子萌发数，以胚根(或胚芽)
长度≥5 mm 视为萌发，种子萌发率(%)为萌发种
子数占接种种子数的质量分数。
所得数据用正交设计助手Ⅱ进行相关分析。
3 结果
3. 1 试验设计对滇重楼种子无菌培养种子萌动率
的影响 如表 2 所示，培养 60 d 统计萌动率，当
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第 19 卷第 5 期
2013 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 5
Mar．，2013
GA3-ZR-IAA-AC(1. 0 mg·L
－1 ∶ 1. 0 mg·L －1 ∶ 0. 1 mg·
L －1 ∶ 0. 5 g·L －1)时，滇重楼种子萌动率最高，达到
76. 66%。如表 3 所示，对滇重楼种子无菌培养种子
萌动率进行极差分析可知，IAA 是滇重楼种子无菌
培养种子萌动的主要影响因素，对种子萌动率影响
较大，从 K 值大小分析各因子对滇重楼种子无菌培
养种子萌动率影响的主次顺序是:C ＞ A ＞ B ＞ D，
IAA对滇重楼种子无菌培养种子萌动影响最大，
GA3 次之，ZR较小，AC最小。综合各因子得出滇重
楼种子无菌培养种子萌动的最佳组合是 A2B2C1D1，
即 GA3-ZR-IAA-AC(1. 0 mg·L
－1 ∶ 1. 0 mg·L －1 ∶ 0. 1
mg·L －1 ∶ 0. 5 g·L －1) ，用此方法进行验证性实验，种
子萌动率达 80. 00%，与实验结果相近，证明实验结
果的正确性，可以作为滇重楼种子离体培养种子萌
发的处理方法。
表 2 试验设计对滇重楼种子无菌培养种子萌发的影响
No． A B C D 萌动率 /% 萌发率 /% 形态发生
1 1 1 1 1 70. 00 50. 00 胚根生成
2 1 2 2 2 53. 33 36. 66 胚根生成
3 1 3 3 3 56. 66 26. 66 胚芽生成
4 2 1 2 3 46. 66 30. 00 胚根生成
5 2 2 3 1 76. 66 56. 66 胚根生成
6 2 3 1 2 66. 66 40. 00 胚芽生成
7 3 1 3 2 53. 33 26. 66 胚根生成
8 3 2 1 3 56. 33 43. 33 胚根生成
9 3 3 2 1 33. 33 33. 33 胚根生成
CK(对照) 0. 0 0. 0 0. 0 0. 0 0. 0 0. 0 －
表 3 滇重楼种子无菌培养种子萌动率 L9(34)极差分析
No． A B C D
K1 60. 00 56. 66 64. 33 59. 99
K2 63. 33 62. 11 44. 44 57. 77
K3 47. 66 52. 22 62. 22 53. 22
R4 15. 66 9. 89 19. 89 6. 78
优良水平 A2 B2 C1 D1
因素序列 CABD
优良水平 A2B2C1D1
3. 2 试验设计对滇重楼种子无菌培养种子萌发率
的影响 如表 3 所示，培养 90 d 统计种子萌发率，
当 GA3-ZR-IAA-AC(1. 0 mg·L
－1 ∶ 1. 0 mg·L －1 ∶ 0. 1
mg·L －1 ∶ 0. 5 g·L －1)时，滇重楼种子萌发率最高，达
到 56. 66%。如表 4 所示，对滇重楼种子无菌培养
种子萌发率进行极差分析可知，AC是滇重楼种子无
菌培养种子萌发率的主要影响因素，对种子萌发率
影响较大，从 K 值大小分析各因子对滇重楼种子无
菌萌发率影响的主次顺序是:D ＞ B ＞ C ＞ A，AC 对滇
重楼种子无菌培养种子萌发影响最大，IAA 次之，
ZR较小，GA3 最小。综合各因子得出滇重楼种子无
菌萌发率的最佳组合是 A2B2C1D1，即 GA3-ZR-IAA-
AC(1. 0 mg·L －1 ∶ 1. 0 mg·L －1 ∶ 0. 1 mg·L －1 ∶ 0. 5 g·
L －1) ，用此方法进行验证实验，无菌萌发率达
66. 66%，接近实验值，验证了实验结果的正确性，可
以作为滇重楼种子无菌培养种子萌发的处理方法。
表 4 滇重楼种子无菌培养种子萌发率 L9(34)极差分析
No． A B C D
K1 37. 77 35. 55 44. 44 46. 66
K2 42. 22 45. 55 33. 33 34. 44
K3 34. 44 33. 33 36. 66 33. 33
R4 7. 780 12. 22 11. 11 13. 33
优良水平 A2 B2 C1 D1
因素序列 DBCA
优良水平 A2B2C1D1
3. 3 试验设计对滇重楼种子无菌萌发过程中植株
形态发生的影响 如表 2 所示，滇重楼种子接种在
添加有 GA3，ZR，IAA 3 种不同质量浓度配比及 AC
的培养基中，经过无菌培养滇重楼种子均能萌发，但
种子萌动和萌发结果差异较大。其中试验编号 1，5
培养基中的种子萌发较快，无菌培养 21 d 种子开始
萌动，胚根生长膨大使种皮一端隆起开始萌动(图
1A) ，再经过 14 ～ 21 d 培养胚根就能突破种皮萌发
·361·
李海峰，等:滇重楼种子休眠破除及植株形态发生的研究
(图 1B)。试验编号 5 培养基中的滇重楼种子胚根
生长较快，随着胚根的生长有少量根毛生成，经过
90 d 培养胚根长达到 3. 0 ～ 4. 0 cm(图 1C) ，但是，
没有观察到胚芽分化。试验编号 3 和 6 培养基中的
种子经过无菌培养 42 d，胚芽突破种皮萌发(图
1D) ，经过 90 d 培养胚芽生长发育成 2. 0 ～ 3. 0 cm
高的单子叶植株(图 1E) ，但是，没有观察到胚根
分化。
A．萌动的种子;B．胚根突破种皮萌发;C．根毛分化及生长中的胚根;
D．胚芽突破种皮萌发;E．胚芽生长发育成子叶
图 1 滇重楼种子无菌培养种子萌发及植株形态发生过程
4 讨论
种子内存在萌发抑制物、种胚发育不完全及生
理学后熟是滇重楼种子休眠的主要原因［7］，降低滇
重楼种子内存在萌发抑制物含量、促进滇重楼种胚
发育完全、缩短种胚生理学后熟时间是破除种子休
眠的关键。本研究结果表明，植物激素 GA3，ZR，
IAA，AC对滇重楼种子无菌萌发及植株形态发生影
响显著，离体培养有利于滇重楼种子完成形态学后
熟和生理学后熟，添加有 GA3，ZR，IAA 不同质量浓
度配比的培养基对滇重楼种子胚根、胚芽发育影响
不相同，试验编号 3，6 培养有利于滇重楼种子内胚
芽的生长、发育，经过培养能观察到胚芽突破种皮萌
发，胚芽进一步生长发育成子叶，经过 90 d 培养没
有观察到胚根分化;其他试验编号培养基有利于滇
重楼种子内胚根的生长、发育，胚根生长突破种皮萌
发，经过 90 d培养没有观察到胚芽分化。本研究结
果与种胚发育不完全的兰科植物种子无菌萌发相
似［8］，接种在添加有植物激素培养基上的滇重楼种
子，能够加快滇重楼胚根、胚芽的生长和发育进程，
促进胚根、胚芽突破种皮萌发，经过离体培养的滇重
楼种子休眠时间比李运昌等［9］研究结果需要两冬
一夏才能完成形态学后熟和生理学后熟时间大大缩
短。同时，结果还证明了孟繁蕴等［10］研究的正确
性，滇重楼种胚休眠和生理后熟期种子内抑制萌发
物质脱落酸(ABA)含量的减少及促进萌发物质
GA3，IAA，ZR的增加是导致种胚休眠解除的主要原
因，AC可能在种子萌发过程中可能吸附种子萌发
抑制物 ABA，促进种子的萌发，因此，AC 是滇重楼
种子无菌培养种子萌发率的主要影响因素。
通过在添加有促进滇重楼种子萌发物质 GA3，
IAA，ZR培养基中进行离体培养，可以促进胚根、胚
芽生长和发育，大大缩短滇重楼种子完成形态学后
熟和生理学后熟时间。因此，用经过离体培养用处
于萌动状态的滇重楼种子育苗是否能缩短种子育苗
时间及提高种子出苗率?同时，在胚根突破种皮萌
发的种子中没有观察到胚芽分化，而有胚芽突破种
皮萌发的种子中又没有观察到胚根的分化，所以在
离体培养条件下，滇重楼胚根的生长是否抑制胚芽
分化，胚芽的生长又是否抑制胚根的分化等问题还
需要进一步研究。
［参考文献］
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过程中内源激素变化的研究［J］．中医药学报，2006，
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［责任编辑 邹晓翠］
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2013 年 3 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 19，No． 5
Mar．，2013