全 文 ：⒇文章编号: 1008 3464 ( 2004) 01 0057 06
斑茅杂种后代分子检测
杨荣仲1 , 谭裕模1 , 黎焕光1 , 何为中1 , 李松1 , 谭芳1 , 陈廷速2 , 李杨瑞2
(广西农业科学院 1 甘蔗研究所 , 2 广西作物改良与生物技术重点实验室 , 广西 南宁 530007)
摘要: 利用 RAPD随机引物和斑茅 5S rRN A间隔序列 ( IT S)引物对斑茅与甘蔗的杂种 F1、 F2代进行了
分子鉴定 , 获得了与含有斑茅血缘有关的 RAPD分子标记 3个及 5S rRNA间隔序列标记 1个 ;其中 ,
5S rRN A间隔序列标记可用于斑茅杂种后代碱法 DN A模板的快速检测。
关键词: 甘蔗 ; 斑茅 ; 分子检测
中图分类号: S566 文献标识码: A
The molecular identif ication among the F1 and F2
progenies of Erianthus arundinaceus
YANG Rong zhong
1 , TAN Yu mo
1 , L I Huan guang
1 , HE Wei zhong
1
LI Shong
1 , T AN Fang
1 , CHEN Ting xu
2 , L I Yang rui
2
( 1 Guangxi Sugarcane Resea rch Insti tute; 2 Guangxi Crop Genetic Improvement and
Bio technolog y Lab. , Guangxi Academy o f Ag ricul tural Science, Nanning 530007, China)
Abstract: The F1 and F2 progenies of Erianthus arundinaceus were detected w ith RAPD primers
and 5S rRN A IT S primers of E. arundinaceus . Three RAPD markers and one 5S rRN A ITS marker
w ere especially rela ted to E. arundinaceus. The 5S rRN A ITS marker is useful for the rapid
identi fica tion of the progenies o f E . arundinaceus with alkali ex t ractions templa tes.
Key words: sug arcane; Erianthus arundinaceus; molecula r identification
斑茅 [Erianthus arundinaceus ( Retzs. ) Jeswiet ]是甘蔗近缘属植物 , 因具有抗干旱、 抗寒、 抗病
虫、耐瘦瘠及宿根性强等特点 , 在甘蔗育种中有较为特殊的育种价值和应用潜力 [1～ 3 ] ,曾为甘蔗育种家
所关注 , 利用斑茅获得杂种后代并育成新品种 [1～ 5 ]。但随着检测水平的提高 , 其真实性受到质疑。在斑
茅及其后代与热带种或甘蔗品种杂交过程中 ,因甘蔗开花特点决定了后代实生苗中有较多的自交后代。
在斑茅杂交组合配制和杂交后代的鉴定工作中 , 可以通过植物学形态特征、 细胞的染色体分析和同功
酶等方法来鉴定 , 这些方法在某种程度上是有效的 , 但存在着一些难以克服的缺陷 , 如可用的鉴定标
记较少且易受环境影响 , 要求育种者拥有丰富的甘蔗常规杂种育种选择经验等。 因此准确获得斑茅真
实杂种后代是斑茅能否用于甘蔗育种的关键技术环节。
DNA分子标记技术 , 因具有快速、 有效、 灵敏度高 , 可客观地反映供试材料在 DNA分子水平上
的真实差异 , 在甘蔗遗传图谱绘制、 品种鉴定、 杂交后代自交鉴定及亲缘关系鉴定等方面有较为广泛
第 23卷 第 1期
Vol. 23, No . 1
广 西 农 业 生 物 科 学
Journal o f Guangx i Ag ric. and Bio l. Science
2004年 3月
Mar. , 2004
⒇ 收稿日期: 2003 06 30
基金项目: 国家 “ 863” 资助项目 ( 2001AA241191) ; 广西农科院科技发展基金资助项目 ( 2002020)
作者简介: 杨荣仲 ( 1963 ) , 男 , 四川乐至人 , 广西农业科学院副研究员 , 博士。
的应用 [1, 4～ 9 ]。利用斑茅 5S rRN A间隔序列 ( ITS) 引物及 RAPD随机引物对斑茅杂种 F1、 F2代进行
分子鉴定 , 为斑茅及其后代材料用于甘蔗育种提供准确可靠的鉴定技术。
1 材料与方法
1. 1 参试种质材料
供试材料为斑茅 ( Erianthus arundinaceus )与热带种 Badi la( Saccharum of f icinarum L. )的杂交 F1代
崖 96 4 1、崖 96 6 6、崖 96 4 0、崖 9 6 4 3(由广州甘蔗研究所海南甘蔗育种场惠赠 )及崖 96 41、
崖 96 66、 崖 96 40、 崖 96 43 (母本 ) 与新台糖 10号、 新台糖 22号、 CP84 1198 (父本 ) 的杂交
后代共 20份材料。
1. 2 引物
RAPD随机引物 S14、 S27、 S14、 S39、 S108、 S111、 S119、 S121、 S138、 S165、 S168、 S349、 S350、
S354、 S364、 S367、 S369、 S371、 S407、 S420、 S431、 S467、 S469购自上海生工公司 ; 斑茅 5S rRN A
间隔序列 ( ITS) 引物参照文献 [9 ]和文献 [10 ]设计两对简并引物 , 由大连宝生物公司合成。
P1: 5- GGAAGAAAGAAAACAAGGGT;
P11: 5- GGGACGGMCMAAACAAAA TT;
P2: 5- T TGGCSGCCGTCCCWTCGTC;
P22: 5- KTMGKGCTGGT ATGATCGCA
1. 3 基因组总 DNA提取
新台糖 10号、 22号 DNA由广西大学硕士研究生李鸣提供 , 其他样品 DNA的提取参照
Del lapo rta[11 ]的方法 , 碱法 DNA模板的制备参照王关琳等 [12 ]的方法。
1. 4 PCR
1. 4. 1 RAPD扩增用两种 PCR反应体系及 PCR反应程序
( 1 ) PCR反 应 程 序 1: 反 应 体 总体 积 2 0 μL , 1× buffer ( 1 0 mmol / L Tirs HCl ,
50 mmol / L KCl , 0. 8% Nodiet P 4 0,下同 ) , M gCl2 1 mmol / L , dN TP混合物 0. 12 mmol /L ,引物
0. 2μmol /L, Taq酶 1U (上海生工 , 下同 ) , DN A 2 ng /μL。 PCR反应为 94℃变性 4 min; 94℃ 1 min,
36℃ 1 min, 72℃ 2 min, 40个循环 , 72℃ 5 min。
( 2 ) PCR反应程序 2: 反应体总体积 2 0μL , 1× buf fer , MgCl2 1mmol / L , dN TP混合物
0. 12 mmol /L ,引物 1. 5μmol /L , Taq酶 1U, DN A 2 ng /μL。PCR反应为 94℃变性 4 min; 94℃ 50 s,
45℃ 1 min, 72℃ 2 min, 12个循环 ; 94℃ 50 s, 38℃ 1 min, 72℃ 2 min, 33个循环。 72℃ 5 min。
1. 4. 2 斑茅 5S rRN A间隔序列 ( IT S) PCR反应的体系与反应程序 1× buf fer , MgCl2 2 mmol / L,
dN TP混合物 0. 15 mmo l / L ,引物 0. 2μmol / L , Taq酶 1U , DN A 2 ng /μL。PCR反应为 94℃变性
4 min; 94℃ 30 s, 57℃ 10 s, 72℃ 40 s, 30个循环 ; 72℃ 5 min。 PCR产物用 1. 5%的琼脂糖凝胶电
泳 ( 3～ 4 V /cm ) , 溴化乙锭染色后在 Imagemaker V DS成仪成像 ; DN A marker为 GeneRuler TM 100
bp DN A Ladder Plus (上海生工 )。
2 结果与分析
2. 1 RAPD鉴定
2 . 1. 1 引物筛选 以新台糖 22号 DNA作模板 ,用 PCR反应程序 1对 23个引物进行扩增都能获得扩
增产物 ,用崖 9 6 6 6对随机引物进行 PCR扩增时 ,除 S1 4、 S 27、 S 14、 S 39扩增效果较差外 ,其他
19个随机引物都能获得扩增产物 ; 新台糖 22号和崖 96 66 DN A作模板进一步筛选表明 ,有些随机引
物如 S138在两模板间没有差异 , 有的随机引物如 S111虽然有差异条带产生 ,但差异条带的扩增较弱 ,
不宜进一步用于后代筛选鉴定。在参与筛选的随机引物中 , S469、 S431、 S420、 S407、 S364、 S165、 S121
在两模间差异较为明显 , 可用于杂种后代个体间筛选。
58 广 西 农 业 生 物 科 学 第 23卷
2. 1. 2 斑茅后代的 RADP筛选鉴定 将有明显差异的随机引物用 PCR反应程序 1对所有参试材料
进行扩增 , 结果表明 , 在两亲本间筛选获得的随机引物中 , 除 S469、 S420、 S407三条随机引物在含斑
茅血缘与不含斑茅血缘的两类参试材料间没有出现较为明显的共有差异条带外 ,其他四条随机引物在
两类材料间均产生了明显的差异条带。其中 S364在斑茅 F1代和斑茅 F2中出现一条 1 050 bp的差异扩
增条带 (图 1箭头所示 ) ,而参试材料中不含斑茅血缘的 Badila、新台糖 10号、新台糖 22号、 CP84- 1198
亲本没有相应的条带 ,说明引物 S364用 PCR反应程序 1方法可有效地检测参试材料有无斑茅血缘。用
斑茅后代 F2作模板 , S431引物扩增表明 ,不仅在含斑茅血缘与不含斑茅血缘的两类材料间获得了一条
1 020 bp的差异条带 (图 2 ) , 而且该条带在含斑茅血缘材料中为主要扩增条带 , 在相应的不含斑茅血
缘的 4个亲本不出现此条带。引物 S121扩增含斑茅血缘材料出现一条 2 200 bp的特异条带 ,不含斑茅
血缘的亲本不出该条带 (图 3)。
图 1 随机引物 S364 PCR扩增结果
Fig. 1 The results of RAPD by PCR with primer S364
1. 水 ; 2～ 12. F2代材料 ; 13～ 16 . F1代材料 ; 17～ 21. 亲本 ; 图 3、 图 4相同
1. Water; 2～ 12. F2 progenies; 13～ 16. F1 progenies; 17～ 21. Par ents; The same a s Figure 3 and Figure 4
图 2 随机引物 S431的 PCR扩增结果
Fig. 2 The results of RAPD by PCR with primer S431
1. 水 ; 2～ 12. F2代材料 ; 13～ 16. 亲本
1. Water; 2～ 12. F2 progenies; 13～ 16. Parents
图 3 引物为 S121, PCR反应程序 1的扩增结果
Fig. 3 The results of RAPD by PCR react ion systemⅠ with primer S121
为提高 RAPD检测的可靠性 ,用较高的 RAPD随机引物浓度和较高的退火温度对 PCR反应体系
与程序进行了进一步优化 ,获得可靠的引物浓度、退火温度后 ,用随机引物 S121在含斑茅血缘与不含
斑茅血缘的材料间进行扩增表明 (图 4) ,在含斑茅血缘材料中共获得两条较为清晰的条带 ,其中
620 bp条带为含斑茅血缘材料的差异条带 , 而用 PCR反应程序 1扩增结果中的 2 200 bp差异条带没
59第 1期 杨荣仲等: 斑茅杂种后代分子检测
有出现 , 说明 RAPD扩增时受反应体系与反应条件的影响 , 根据含斑茅血缘材料的检出率来看 , 提高
引物浓度与退火温度能提高检测的可靠性。
图 4 引物为 S121, PCR反应程序Ⅱ的扩增结果
Fig. 4 The results of RAPD by PCR react ion systemⅡ with primer S121
2. 1. 3 RAPD分子标记对含斑茅后代的血缘材料的检测效率评价 S121、 S165、 S364、 S431四个随
机 引物 ,用两种不同的 PCR反应体系与反应程序 ,在含斑茅血缘与不含斑茅血缘的两类间获得了 5个
含斑茅血缘材料的差异条带 (表 1) ,其中随机引物 S431的 1 020 bp差异条带效果最好 ,获得的条带
不仅在两类材料间差异明显 ,而且为含斑茅血缘材料扩增主带 ;随机引物 S364获得的含斑茅血缘材料
1050 bp差异条带虽然不是主带 ,但检出率高 ,且不含斑茅血缘材料存在一条 1 100 bp扩增条带 ,两类
材料间容易区分 , 因此检测可靠性好。随机引物 S121对是否含有斑茅血缘的检测效果较好 , 在反应程
序 1下获得 2 200 bp的扩增条带 , 在反应程序 2下获得 620 bp差异扩增条带 , 且检出率高。随机引物
S165所获得的含斑茅血缘材料的 950 bp差异条带 (图略 ) ,虽然在不含斑茅血缘材料中不存在此条带 ,
但检出率偏低 , 在检测时出现此条带可认定为含有斑茅血缘 , 不出现则不能确定是否含有斑茅血缘。
表 1 RAPD随机引物对含斑茅血缘材料的检测效率
Table 1 The identification eff ic iency of E . arundinaceus with RAPD primers
引物代号
Primer code
PCR方法
PCR procedure
DN A条带大小
Size o f the DN A
bands
两类材料间多态性
Po lymorphism
betw een the
tw o ma teria ls
含斑茅血缘材料检出率 /%
Identifica tion
percentag e fo r
E . arundinaceus
可靠性
Th e reliability
S364 反应程序 1 Procedure one 1 050 bp 有 Yes 100 好 Very good
S165 反应程序 1 Procedure one 950 bp 有 Yes 81. 25 良好 Good
S121 反应程序 1 Procedure one 2 200 bp 有 Yes 100 良好 Good
反应程序 2 Procedure two 620 bp 有 Yes 100 好 Very good
S431 反应程序 1 Procedure one 1 020 bp 有 Yes 100 好 Very good
2. 2 斑茅 5S rRNA间隔序列 ( ITS) 特异引物检测
2. 2. 1 常规检测 斑茅是甘蔗近缘属植物 ,其 5S rRN A间隔序列具有自身的种属特异性 [ 1, 10] ,因此利
用 5 S rRN A间隔序列设计引物对斑茅杂交后代进行检测 ,其可靠性更好。引物 P1、 P11扩增表明
(图 5) , 在含斑茅血缘 F1材料中出现一条介于 300～ 400 bp的特异扩增条带 , 而不含斑茅血缘四个参
试亲本没有出现该特异扩增条带 ; 据廖兆周等 [2 ]的同功酶分析结果 , 崖 96 40为斑茅真实杂种后代 ,
因此引物 P1、 P11对含斑茅血缘后代杂种的检测结果是真实可靠的。进一步对斑茅杂交 F2代材料检测
表明 (图 6) , 含有斑茅血缘的参试材料出现目标条带 , 但与对 F1检测时的结果不完全相同 , 除获得目
标扩增条带外 , 还有一些含斑茅血缘的参试材料出现 800 bp和 1 200 bp两条非特异扩增条带。
图 5 用引物 P1、 P11对亲本及斑茅扩增结果
Fig. 5 The analysis of the F1 and parents by PCR with primers P1 and P11
1. 水 ; 2～ 5. F1代材料 ; 6. 斑茅 ; 7～ 10. 其他亲本
1. Wate r; 2～ 5. F1 progenies; 6. E . arundinaceus; 7～ 10. Other pa rents
60 广 西 农 业 生 物 科 学 第 23卷
引物 P2、 P22对亲本及斑茅 F1扩增获得的结果除目标片段稍大一些外 , 其他与 P1、 P11的结果基
本一致 , 即含斑茅血缘材料中出现特异扩增条带 , 而不含斑茅血缘四个参试亲本没有出现该特异扩增
条带 (图片略 ) ; 而对 F2代的检测结果则有些不同 ,在 RAPD和 P1、 P11检测呈阳性的部分材料中 ,检
测结果为阴性 (图 7) , 说明引物 P2、 P22对斑茅后代 F1检测是有效的 , 对斑茅后代 F2检测获得阳性
结果远远低于 RAPD和 P1、 P11检测结果 , 不适宜用它对斑茅后代 F2材料进行检测。
图 6 引物 P1、 P11对斑茅 F1、 F2检测结果
Fig. 6 The analysis of the F1 and F2 of E . arundinaceus by PCR with primers P1 and P11
1. 水 ; 2. 斑茅 ; 3～ 6. F1代材料 ; 7～ 17. F2代材料
1. Water; 2. E . arundinaceus; 3～ 6. F1 progenies; 7～ 17. F2 progenies
图 7 引物 P2、 P22对斑茅 F1、 F2检测结果
Fig. 7 The PCR analysis of the F1 and F2 of E . arund inaceus with primer P2、 P22
1. 水 ; 2～ 12. F2代材料 . ; 13～ 16. F1代材料 ; 17斑茅
1. Wa ter; 2～ 12. F2 progenies; 13～ 16. F1 progenies; 17. E . arundinaceu
2. 2. 2 快速检测 对甘蔗育种工作者而言 , 将获得的 RAPD分子标记、 斑茅 5S rRN A间隔序列
( ITS)特异标记用于甘蔗辅助育种是可行的 , 特别是用斑茅 5S rRN A间隔序列 ( ITS)特异标记对斑
茅杂交后代进行筛选获得的结果准确可靠。但将其用于含斑茅血缘材料的杂交后代检测仍有一定的难
度 , 特别是当后代群体较大时 , 繁琐的 DNA提取、 纯化及 PCR扩增工作使其应用受到限制。因此在
引物 P1、 P11对斑茅后代检测获得可靠结果的基础上 , 用简易的碱法处理植物材料获取 DNA模板 [12 ]
进行 PCR扩增 (图 8) ,含有斑茅血缘参试材料出现目标条带 ,而不含斑茅血缘参试材料没有目标条带 ,
说明引物 P1、 P11能用于快速检测参试材料是否含有斑茅血缘 ; 但扩增结果与 SDS法 DNA模板不完
全相同 , 扩增仅出现目标条带 , 没有非特异扩增出现。
图 8 用引物 P1、 P11对部分参试种质材料快速检测结果
Fig. 8 The results of primers P1 and P11 for the partial germplasm materials with alkali extract ion s DNA templates
1～ 4. 其他亲本 ; 5. 斑茅 ; 6～ 14. 碱法 DNA模板 F2代材料 ; 15. SDS法 DN A模板 F2代材料
1～ 4. O th er par ents; 5. E . arundinaceus; 6～ 14. Alkali ex trac tions DN A templates o f F2 progenies; 15. SDS s
DN A templa te of F2 progeny
61第 1期 杨荣仲等: 斑茅杂种后代分子检测
3 讨 论
斑茅是甘蔗近缘属植物 , 因此在 DNA分子水平上与甘蔗存在差异 [2, 6, 9 ] , 通过 RAPD及 5S rRN A
间隔序列 ( IT S)特异引物对斑茅后代检测表明 , 含有斑茅血缘的参试材料存在与甘蔗明显不同的分子
标记 , 用这些分子标记很容易地将是否含有斑茅血缘的参试材料区分开 , 特别是 P1、 P11引物快速检
测对开展斑茅杂交后代分子辅助育种有一定的实用价值。
用两对 5S rRN A间隔序列 ( ITS) 引物对国内斑茅杂交后代进行分子检测时 , 除获得的目标条带
大小与 Pan[ 10]的研究结果一致外 , 还有许多不同之处 , 除在部分参材料中产生非特异扩增条带外 , 两
对引物在检测效率方面相差也较大 , 可能是国内的斑茅与国外的有所不同 , 或是 P2、 P22碱基发生简
并较多 , 在 F1与甘蔗杂交时 , 部分斑茅染色体发生丢失所造成的。进行快速检测时获得的结果 , 与用
SDS法提取的 DNA模板获得的结果也有所不同 , 在检测的材料中仅出现目标条带 , 未出现非特异扩
增 , 这一方面说明用碱法直接处理能够快速 PCR扩增所需的模板 ; 另一方面也表明获得 PCR扩增的
模板分子量比 SDS法提取的 DNA模板片段小。
致谢: 广西甘蔗所生物室和育种室朱俊杰、 刘红坚、 刘海斌、 梁丽琼、 张革民等同志参与了部分工作。
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(责任编辑 裴润梅 )
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