全 文 ：收稿日期:2006 -04 - 18;修回日期:2006 -06 - 14
作者简介:马方放(1981 - ) ,女 ,硕士研究生 ,研究方向:果树生理与分子生物学。 *通讯作者
　山 东 农 业 科 学 Shandong Ag ricultural Sciences 2006年　第 4期
磷对平邑甜茶根系质膜 H +-ATPase活性的调控
马方放 ,杨洪强*
(山东农业大学园艺与工程技术学院 , 山东 泰安　271018)
　　摘　要:用含 NaH 2PO4 浓度分别为 0、0. 2、0. 4、0. 6 、0. 8 、1. 0 、1. 2 mmol /L 的营养液处理后 , 平邑甜茶根
系质膜 H + - ATPase的活性随着根区磷浓度的升高而升高 , 并在 1. 0 mmo l /L 处达到峰值;该酶的对硝基苯
磷酸(PNPP)水解活性也明显升高 ,其 Km 值由 3. 48 mmo l /L 下降至 0. 97 mmol / L;同时结合抑制剂试验 , 钒
酸钠对幼苗根系质膜 H +- ATPase的抑制效应也得到了加强。
关键词:磷;质膜 H + - ATPase;对硝基苯磷酸(PNPP);钒酸钠
中图分类号:S571. 101　　文献标识号:A　　文章编号:1001 -4942(2006)04 - 0017 -03
Regulation of Phosphor on the Activity of Root Plasma
Membrane H
+
-ATPase in Malus Hupehensis (Pamp)Rehd.
MA Fang-fang , YANG Hong-qiang*
(Department o f Horticulture , S handong A gricultural University , Taian 271018 , China)
　　Abstract 　After t reated w ith the nutrient so lution containing 0 、0. 2 、0. 4 、0. 6 、0. 8 、1. 0 、1. 2
mmo l /L NaH 2PO 4 respectively , the act ivity of roo t plasma membrane H+ -A TPase in Malus hupehen-
sis(Pamp)Rehd.was obviously enhanced and reached the peak value at 1. 0 mmol /L. PNPP hydro lysis
activi ty w as also promo ted by phospho r , and its Km value decreased from 3. 48 to 0. 97 mmol /L.And it
w as also found that 1. 0 mmo l /L NaH 2PO 4 could raise the inhibit ion of H +- AT Pase activity by sodi-
um vanadate. These results indicated that phosphor might regulate the activity of H + - A TPase by
means of af fecting the pho sphatase domain of this enzyme.
Key words　Phosphor;Plasma M embrane H+ -A TPase;PNPP;Sodium vanadate
　　根系是果树吸收营养的重要器官 ,其质膜
H
+
- HT5A TPase 有植物主宰酶之称 ,由它所建
立的跨膜质子推动力可用于 ATP 的形成 ,并驱
动次级离子或溶质的跨膜运输等[ 1] 。而关于质膜
H +-A TPase的研究主要集中在分子机制方面 ,
很少与生产问题相联系。近来有研究发现磷饥饿
可以提高番茄根系质膜 H+ - A TPase 活性[ 2] ,但
人们对磷以何种方式参与质膜 H+ - A TPase 活
性的调控还不甚清楚 。本试验拟用具有高度无融
合生殖能力的平邑甜茶为试材 ,研究磷对根系质
膜 H +- A TPase 活性的影响 ,并对其作用机制作
初步探索 ,为指导苹果栽培中的根系管理提供一
定理论依据。
1　材料与方法
1. 1　植物材料
平邑甜茶(Malus hupehensis Rhed.)当年生
实生苗。
1. 2　试验设计
试验于 2005年在山东农业大学果树激素实
验室中进行。平邑甜茶种子经低温层积后播种 ,
待幼苗长至三片真叶时 ,选长势相近的实生苗进
行砂培(基质为石英砂 ,培养液为 Hoag land完全
营养液 , pH6. 5);自然光照 ,温度 20 ～ 25℃。当
第六片真叶长成后选留长势一致的植株于去离子
水中饥饿 24 h ,分别置于含 NaH 2PO 4 为 0 、0. 2 、
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DOI牶牨牥牣牨牬牥牳牫牤j牣issn牣牨牥牥牨牠牬牴牬牪牣牪牥牥牰牣牥牬牣牥牥牱
0. 4 、0. 6 、0. 8 、1. 0 、1. 2 mmo l /L 的 Hoag land 营
养液中 ,每个梯度放 10 株 ,处理 24 h 后 ,取出幼
苗 ,分离纯化根系质膜并测定 H+ - A TPase 活
性。每处理重复 3次 。
后选取 H + - A TPase 活性达到峰值的梯度
处理幼苗 ,并用 100 μmol /L 的钒酸钠进行蘸根
处理 ,测定根系质膜 H +- A TPase 和 PNPP 水解
活性的变化 ,重复 3次。
1. 3　测定方法
1. 3. 1　根系质膜的提取纯化　取适量根系加入
2倍(W /V)体积预冷的研磨缓冲液:Hepes(N - 2
-羟乙基哌嗪 - N - 2 -乙磺酸)- T ris 25 mmo l /L
(pH 7. 6),甘露醇 250 mmo l /L , EG TA [ 乙二醇
双(α-氨基乙基)醚四乙酸] 5 mmo l /L ,EDTA(乙
二胺四乙酸)5 mmol /L , KCl 10 mmo l /L ,PMSF
(苯甲基磺酰氯)2 mmo l /L , PVP(聚乙烯吡咯啉
酮)1. 5%, BSA 0. 5%,BHT(2 , 6-二叔丁基对甲
酚)5 μg /L , K2 S2O5 5 mmol /L , DT T(二巯基苏糖
醇)1 mmol /L(用前加入),在 0 ～ 4℃下研磨。匀
浆 ,经 2层纱布过滤 ,560×g 离心 12 min ,上清液
在10 000×g 离心 15 min 后 ,再经 60 000×g 离
心30 min ,沉淀悬浮于 1 ml悬浮缓冲液[ Hepes-
T ris 2. 5 mmo l /L (pH 7. 6), 甘 露 醇 250
mmo l /L ,EDTA 1 mmol /L ,DT T 1 mmol /L]中 ,
置于不连续蔗糖梯度[含 45%, 36%和 22%(W /
V)蔗糖溶液] ,经70 000×g 离心 2 h 。取 36%和
45%间带 ,再加入悬浮液 ,经 80 000×g 离心 40
min ,弃上清 ,沉淀重新悬浮 ,即得质膜微囊。
1. 3. 2　H+ -A TPase活性测定　采用Wang 和
Wze[ 3] 的方法 。无机磷的测定采用略加改动的
Ohnishi[ 4] 的方法。
1. 3. 3　膜蛋白质浓度的测定　采用考马斯亮蓝
染色法 ,以牛血清蛋白为标准蛋白[ 5] 。
1. 3. 4　PNPP 水解活性的测定 　反应体系为
0. 5 ml , 含(mmol /L):250 Hepes - Tris (pH
7. 0), 3. 0 ATP - N a2 , 0. 1 (NH4)2MoO4 , 1. 0
NaN 3 ,50 NaNO3 ,0. 01% Triton X - 100(V /V),
50 KCl ,加入合适浓度的 PNPP(0 ～ 30 mmol /L)
及膜微囊制剂 10 ～ 30 μg[ 7] 。37℃下反应 30
min ,用 50 μl 55%的 TCA终止反应 ,参照略加改
动的Ohnishi[ 4] 的方法测定释放的无机磷量 ,活性
单位为 10- 4mmol Pi /h g pro tein。
根据米氏方程在双倒数曲线中 ,曲线与 X轴
的交点坐标值即为 Km 值的负倒数。
2　结果与分析
2. 1　磷对平邑甜茶根系质膜 H+ - ATPase 活性
的影响
如图 1所示 ,随根区磷浓度的升高 ,根系质膜
H
+
- ATPase 活性也随之升高。在 0 ～ 0. 6
mmo l /L的范围内 ,变化平缓 ,增幅较小;当磷浓
度上升至 1. 0 mmol /L 时 ,活力达到峰值 ,约为对
照的 4. 27倍;当磷浓度继续升高至 1. 2 mmo l /L
时 ,活性又有急剧降低但仍高于对照。
图 1　磷对根系质膜 H +- ATPase活性的影响
2. 2　磷对平邑甜茶质膜 H+ - A TPase PNPP 水
解活性的影响
质膜 H + -A TPase 具有 PNPP 水解活性 ,且
此水解反应是由该酶的磷酸酶结构域催化进行
的[ 3] 。本试验发现 , 1. 0 mmol /L 的NaH 2PO4 处
理后 , 平邑甜茶幼苗根系质膜 H+ - AT Pase
PNPP水解活性明显升高 ,如图2所示 。动力学
图 2　1. 0 mmo l /L 的 NaH2PO 4 处理对
质膜 H + -ATPase PNPP 水解活性的影响
图 3　1. 0 mmo l/ L的 NaH2PO 4 处理下 ,质膜
H + - ATPase PNPP水解活性变化的双倒数曲线
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分析(图 3)表明 , PN PP 水解的 Km 值由 3. 48
mmo l /L 下降至 0. 97 mmol /L。
2. 3　磷对钒酸钠抑制平邑甜茶根系质膜 H + -
ATPase活性效应的影响
钒酸钠是 P 型 A TPases的特异抑制剂 ,已证
实它是通过结合于质膜 H + - A TPase 的磷酸酶
结构域来起作用的[ 7] 。实验中将对照和用 1
mmo l /L的 NaH2 PO 4 处理后的两类幼苗均用 100
μmol /L的钒酸钠进行蘸根处理 ,测定发现根系质
膜 H +- A TPase 的活性均被钒酸钠强烈抑制:如
图 4所示 ,未经 NaH 2PO4 处理的幼苗经抑制试
验后 , 质膜 H + - AT Pase 活性是对照活性的
61. 67%;而经 NaH 2PO 4 处理后 ,抑制后的质膜
H + - A TPase 活性为对照的 24. 16%。表明
NaH2 PO 4处理使根系质膜 H + -A TPase对钒酸
钠的抑制反应更加敏感 ,钒酸钠的抑制效应得到
了强化。
图 4　钒酸钠对 1 mmol / L NaH2PO 4
处理后根系质膜 H +- ATPase活性的影响
3　讨论
很多研究表明 ,植物质膜 H + -A TPase可在
不同水平上被多种因素调控[ 8] 。营养元素对质膜
ATPase 的调控多集中在钾上 , 关于磷与质膜
ATPase活性的关系 ,相关研究还不是很多:宋克
敏等人发现磷饥饿可以使质膜 H+ - A TPase 活
性升高并提高其与底物的亲和力 ,这一现象也可
由孙海国等人的试验结果间接证明:缺磷的根系
环境可增加植物地上部锌的含量 , 促进地上部
IAA 的合成并通过极性运输使根系中的生长素
浓度升高[ 9] ,从而激活了根系 A TPases的活性。
本试验则是建立在根系充分供磷的基础上 ,发现
适量的磷可以促进质膜 H +- A TPase 的活性 ,而
1 mmol /L的 NaH 2PO 4 将其活性提高 4倍左右。
另外 , NaH 2PO 4 处理能显著提高 A TPase 对
PNPP 的水解活性 ,且大大降低了其水解 Km 值 ,
说明底物 PNPP 与 H + - ATPase 结合的更为紧
密;磷还使钒酸钠对质膜 H + -A TPase活性的抑
制效应得到加强。因为 PN PP 水解活性和钒酸
钠效应部位均受 H + - A TPase 的磷酸酶结构域
的调控 , 推测磷很可能通过作用于该酶的磷酸酶
结构域而影响其活性 ,而这一作用方式与质膜
H +-A TPase的 C -末端调节以及蛋白磷酸化调
控方式有何关系还需进一步的验证 。
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