全 文 ：第 38 卷 第 3 期
2X ( )7年 6 月
东 北 农 业 大 学 学 报
Jo u m al o f N o r t h eas tAg n
u el tu ral U
niv e路 i ty
38 (3 )
:
3 25
一
3 9 2
J u n eZX ( )7
文章编号 lX ( ) 5一 9 3 6 9 ( 2X ( )7 )0 3一0 3 2 5一0 5
草地早熟禾种质资源遗传多样性的 ARP D 鉴定与分类研究
高丽娜`· 2, 陈雅君 ` ’ , 高丽娟3 , 申凤娟`
(l
. 东北农业大学园艺学院 , 哈尔滨 巧0 3 0 ; 2 . 黑龙江东方学院艺术学部 , 哈尔滨 150 86 :
3
. 大庆师范学院初等教育系 , 黑龙江 大庆 16 3 71 2 )
摘 要 : 采用随机扩增多态性 D N (A RA P )D 标记 , 筛选出 69 个随机引物对犯份草地早熟禾品种遗传讲带进
行分析 , 46 个引物共扩增出了 197 条扩增片断 , 其中多态性带数为 195 条 , 每个引物扩增出 1一 9 条多态性带 , 平
均每条引物扩增出 .4 3条 。 根据 Jac c adr 相似 系数分析 R A PD 结果 , 并利用 NST Y S 软件 , 按 U P G M A 平均法进行聚
类 。 结果表明 , 第一大组群包括 18 个品种 , 第二大组群包括 3 个品种 , 第三大组群包括 2 个品种 , 第四大组群包
括 8 个品种 , 第五大组群仅 1 个品种 , 为 C : 。
关键词 : 草地早熟禾 ; 遗传多样性 ; R A P;D 聚类分析
中图分类号 : 5 51 文献标识码 : A
草地早熟禾 (oP a 尸art e ns is L ) , 英文名为 K e n t u e k y
bl ue gr as
s , 别名有六月禾 、 多年生早熟禾 、 肯塔基
兰草等 , 是 目前世界最为广泛使用的冷季型草坪
草之一 , 原产欧洲 、 亚洲北部及非洲北部 , 后引
人北美洲 , 美国从上个世纪 50 年代开始 , 对草地
早熟禾进行引种驯化 、 培育和改良 , 并逐渐形成
产业化 。 我国近 20 年从国外引进大量草地早熟禾
草种 , 在丰富国内草坪品种资源的同时 , 由于有
些品种的盲 目引进 , 对其遗传背景和生物学特性
不了解 , 造成某些品种不适宜当地的气候条件而
退化 , 从而造成严重经济损失 。 鉴于此 , 目前迫
切需要对引进的草地早熟禾品种进行分类学研究 ,
了解各品种之间的亲缘关系和遗传背景 。
本研究选用了从欧美引进及国内野生的草地早
熟禾品种为材料 , 进行 R A P D遗传多样性分析 , 目
的在于利用 R A P D 技术对收集的草地早熟禾品种进
行分类 ; 估计早熟禾属的遗传多样性及变异幅度 ;
检测草地早熟禾不同品种间的亲缘关系 , 为进一步
合理利用草地早熟禾引进的品种 , 以及为今后国内
的草地早熟禾资源开发和育种工作提供理论依据 。
收稿日期 : 2X( 场~ 0 3一 24
` 金项目: 农业部草地资源生态重点实验室 2《X抖 年资助项目
作者简介 : 高丽娜 ( 19 7 9一 ) , 女 , 黑龙江人 , 硕士 , 研究方向为
国林植物资源 , E - m a il: ga iol n a-l et e rs 卿ah o . c o m . 。 n
. 通讯作者 E一二 l : e h e n y aj u n 6 2 2@ 16 3. e o m
1 材料与方法
1
.
1 材料
本研究材料选 自欧美引进的草地早熟禾草种及
黑龙江省野生的 32 个品种进行试验 , 品种代码 、
名称 、 产地见表 1。
L Z 方法
1
.
2
.
1 D N A 提取方法
每份材料选 自随机选取的 3 株植株 , 剪取嫩
叶 , 采取 S DS 法提取总基因组 D N A , 并检测 D N A
的完整性和浓度 。
1
.
2
.
2 R A P D 方法
R A p D 的反应体系如下 : l 卜L T e m p l a te D N A
( 10
一20 n g
· 林L , ) , 2 林L 10 x R e a e t i o n b u fe r , 1 . 8 林L
M g C12 ( 25 m m
o l
·
L
一 , )
,
0
.
4 林L d N T p ( 2 . 5 m m o l · L一 , ) ,
0
.
2 林L T a q D NA p o ly m e r a s e ( 5 u n i t s · 林L一 , ) , 1 . 5 林L
R A p D p ir m e r ( 10 p m o l
· 林L刁 ) , 加去离子水到 20 卜L ,
所用 R A PD 引物由 iB ao is a 公司合成 。
R A P D 反应程序如下 : 9 4℃ 预变性 5 m i n ,
9 4 ℃变性 3 0 5 , 3 7 ℃退火 1 m i n , 7 2 ℃延伸 1 m i n
30 5 循环 3 4 个 , 7 2 ℃延伸 7 m i n , 4 ℃保存 。 P C R
产物经澳酚蓝染色后 , 在 1 . 5% ( W脚 )的琼脂糖凝
胶上 电泳 1 . 5 h 左右 。 电泳后用凝胶成相系统照相
并记录数据 , 对电泳结果不理想或出现缺失的引物
和样品进行重新扩增和电泳 。
东 北 农 业 大 学 学 报 第 8 3卷
裹 1 草地早熟禾供试材料与来源
Ta州 e I1 K e. t l x幻 目侧娜门. c川 dv ar, 仙 d t 姆扮 。 d口.
产品名称 英文名字 代码 产地 产品名称 英文名字 代码 产地
P氏 d u e t n
~
E理加曲 n a 口比 C记 e P代d u e ign ~ P r d cu t ~
E
n沙 i心
~
C司 e P找lKcu 坑 g ~自由 n Fm日加山 Z , 美国 抢手股 lB uec ih p Q . 美国
超级伊克利 肠园 cE il附 c : 美国 巴林 B alr in B . 丹麦
美洲王 A此 ir ca M l 美国 公园 P田kr G’ 美国
解放者 U比阁“ J . 美国 兰肯 eK bn lu e 肠 美国
新歌来德 N u Gla d e X . 美国 肯塔基 K , tcu k y K: 美国
奖品 Aw .心 J: 美国 午夜 iM俪 hg t w , 美国
浪潮 1. 卿 . 肠 美国 黑石 B城 k s t o n e H: 美国
纳苏 N
~
N : 美国 超优异 su 伴~ irt q 美国
康尼 CO刊 in 3K 丹麦 欧宝 0伴 1 0 : 美国
优异 M e ir t Y : 美国 抢手股 B lu ec hi p Q: 美国
澳边草坪 Bm闭 a抓 F . 美国 蓝月 lB ue一 肠 美国布朗克 B~ 残 美国 男爵 B帅 n ie N : 美国蓝宝石 、 p p ih 二 肠 美国 百老汇 B明 d w ay B’ 美国
单宁 B~ D
, 美国 内而 u m uP 而 u m 巧 奖国
新星 N o v a X: 美国 索宝 S 止扭 U . 美国
橄榄球二号 R uhgy Z 场 美国 乡土 彻 p映“ ` A 黑龙江
佛特纳 FOrt u an F: 美国 ` 。叭口父 eP ,
1
.
.2 3 数据处理
电泳图谱中的每一条带均代表了引物与模板
D NA互补的一对结合位点 , 可记为一个分子标记 ,
根据分子量标准对照反应产物在胶上的对应位置 ,
又据 D N A 的分子量在其分辨率范围之内电泳迁移
率成反比 , 估计扩增产物的分子量的大小 。 对同一
引物不同模板的电泳结果 , 迁移率相同的带为分子
量相同的 R A P D 带 , 所有模板都具有的带为公共
带 , 表示无多态性 , 其余为多态带 , 表示有多态
性 。 RADP 为显性标记 , 将有条带的个体记为 1 ,
没有的记为 0 , 缺失的计为一 1 。
计算遗传参数 :
种质间的相似系数为简单匹配系数 ( S M , is m -
p l e mat
e
h i
n g ) MS 系数= (叶d ) l (+a 6忱+d )
其中 , a 表示比较的双方状态都为 “ 1” 的性状
的个数 , 称为正匹配 ; b , 。 表示比较的双方状态
分别为 “ 1” 和 ` ,0’ ,的性状的个数 , 称为错匹配 ; d 表
示比较的双方状态都为 “ 一 1” 的性状的个数 , 称为
负匹配 。
本实验相似系数采用的公式为 :
Ja e e a dr ,8 e oe if e i e n t ( JAC CA
,
l 9() 8 )
:
天 ij习 (+a b+c )
公式中火 ij 代表两个材料 i 和 j 之间的遗传相
似系数 , a 为两个材料共有的条带数 , 6 为材料 i
有而材料 j 没有的条带数 , 。 为材料j 有而材料 i没
有的条带数 。
2 结果与分析
.2 1 引物筛选
取四个不同品种的草地早熟禾材料为模板 , 用
最佳反应体系对 50 条引物进行 CP R 扩增 , 依据
扩增条带结果对引物做出筛选 。 原则是扩增条带数
多且清晰 , 并具多态性的引物。
Z J R A P D 多态性分析
本实验用 iB o as ia 公司的 5 0 条随机引物进行
多态性筛选 , 4 31 个引物 (占 86 . 2% )没有产生能检
测的产物 ; 69 个引物能产生多态性带 , 仅选能得
到清晰扩增带的 46 个引物进行扩增 。 结果见图
l
,
2
0
由图 1 , 2 可见 , 每个引物都获得 了基因组
DN A 指纹图谱 , 其多态性随引物的不同而表现出
差异 , 并且不同引物对不同材料的指纹图谱和扩增
条带数差异很大 ; 同一引物在不同材料上具有不同
的指纹图谱 。 不同引物得到的扩增条带数在 l 一 9
第 3期 高丽娜等 :草地早熟禾种质资源遗传多样性的 A R PD鉴定与分类研究
条之间 , 每个引物平均扩出 .4 3条带 , 扩增条带数
最多的引物是 BCI O , W 12 , X 02 等 ; 最少的引物为
U 14
,
B B 17
,
v l s
,
W 20
。
4 6个引物在 32 份材料中
共产生分子量不同的 197 个 R A P D 标记 . 其中单态
性带 2 条 , 占 1 . 01 % , 多态性带 19 5 条 , 占 98 .5 % 。
说明草地早熟禾植物品种间遗传背景的复杂性 。
图 1 引物 U0 3扩增的 RA P D 圈谱
F哈 1 RA .I D uaI p am P助 ed by U 03 P d m e r
图 2 引物 B F 09 扩增的 RA P D 圈谱
F呛. 2 R A PD 姗p . 州肠ed by B F09 p d m e r
2 3 种间遗传关系
Jac c adr 成 对 品种 的相 似系数介 于 0
.
125
~
.0 7 14
, 结果表明 , 不同品种之间具有较大的异质
性 ; 成对品种相似系数最高为 口, 与 X Z ; 平均相似
系数最高的是 H Z , 最低的为 二 , `表明 H : 与其它品
种的遗传距离最小 , 亲缘关系最近 , 而 C: 与其它
品种的遗传距离最大 , 亲缘关系最远 。
利用 NST Y S一CP 2 . l la 软件 , 对 R AP D 扩增结
果转化的 l , 0 , 一 1数据进行聚类 。 J a c adr 聚类结
果见图 3 . 表 2o
由图 3 可以看出 , 供试材料在 0 .4 34 的相似
系数处被分为 5 个组群 : 第一大组群包括 18 个
品种 , 它们是 JZ 、 Q、 、 o 、 、 x Z 、 n 3 、 G 3 、 2L 、
肠 、 Y ; 、 H : 、 玩 、 F , 、 几 、 M : 、 C . 、 Z , 、 N Z 、 N : ;
第二大组群包括 3个品种 , 它们是 F Z 、 K . 、 R ;
第三大组群包括 2 个品种 , 它们是 认 、 A ; 第
四大 组群包括 8 个 品种 , 它们是 J . 、 U : 、 B 4 、
W ,
、
B ,
、
B Z
、
X .
、
K 3 ; 丹麦的两个品种 K 3 和 B ,
包括在内 , 说明丹麦品种与这 6 个美国品种的
亲缘关系 比较 近 ; 第五大组群包括 1 个品种 ,
它是 C : 。 在 32 份草地早熟禾材料中 , 有 18 份
聚在了第一大组类中 , 8 份聚在 了第四大组类
中 , 只有 6 份被独立分配在三个组群中 , 说明
欧美引进品种亲缘关系较近 , 遗传基础较为狭
窄 。 黑龙江省的乡土野生品种 A 与其它品种的
相似系数并没表现为最小 , 说明它与欧美栽培
品种间存在一定的亲缘关系 , 即在欧美栽培品
种中存在中国血统 。
东 北 农 业 大 学 学 报 第 8 3卷
z Jq o l凡 D 3肠 Y l眺 F M IC从 N K巧 G’ A JU氏 W IB Ixc z
圈 3 Ja。 , 川 遗传相似系数所得班类
月 .9 3 S at 伪川 cs 八洲dI妇 or j a c aC dr 招e en dC 动画山时 yt 倒口目叨 3 2 eK . tCU匆 加以娜门臼 。 目d , 曰门 勿 R A P D
裹 2 用 RA P D分析 32 个草地早熟禾品种的
J a以别闭 班类结果
aT ble Z a 幽扭 r m . II扭 ot 32 价 n奴幻 翻侧笔的侧留
c川廿v 翻门 勿 R A P D
类 a a8 聚类结果 cl 以 e r esr ul 切
儿、 Q, 、 0 , 、兀 、肠 、岛 、肠 、与 、 Y , 、 H: 、肠 、 F , 、肠 、 M . 、 C , 、
Z 一
、
N
Z 、 N -
凡、 K l 、 已
.G
、
A
J .
、
U .
、
B
. 、
W .
、
B
. 、乌 、 X : 、价
c
. 长期以来对品种的真伪和纯度鉴定 , 通常以
形态学标记为主要方法 , 随着生产的发展和水平的
提高及草地早熟和品种数量的增加 , 品种间的形态
差别越来越小 , 从外表形态上很难进行区分 , 以
RA DP 标记为主 , 辅之以其它标记来对草地早熟禾
种质资源进行遗传 多样性研究和品种鉴定 , 能做
到准确快速 、 操作简单 、 标记丰富 , 是品种分类和
鉴定的一种行之有效的方法 。
111
参 考 文 献
V C :
-二- - - - ~ ~ ~ ~ ~ - - - - - - - ~ ~ ~ ~ ~ - - - - -
3 结 论
a
. 本研究初步建立了适合草地早熟禾的最佳
RADP 反应体系和反应条件 , 扩增出了稳定 、 清晰
的 DN A 谱带 , 为进一步种质资源的收集和鉴定奠
定了分子基础 。
h 遗传相似性计算结果表明 , 不同品种力司具有.
较大的异质性 , 32 个品种被分配到 5 个组群中 , 其中
欧美引进品种的亲缘关系较近 , 遗传基础较为狭窄 。
汇1 1 Jo hson n R C , Jdhn . ro n W J, OG lob C .T Ch~ `
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第 3期 高丽娜等 : 草地早熟禾种质资源遗传多样性的 RA P D鉴定与分类研究 32 9
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