全 文 ：第 40卷第 3期 西南民族大学学报·自然科学版 May 2014
Journal of Southwest University for NationalitiesNatural Science Edition ___________________________________________________________________
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收稿日期：2014-03-25
通讯作者：陈智华(1961-), 男, 汉族, 陕西咸阳人, 教授, 博士, 研究方向: 生物多样性保护.
doi: 10.3969/j.issn.1003-4271.2014.03.02
川西北高原野生垂穗披碱草遗传多样性的 ISSR分析
郑经红 1, 陈仕勇 2, 陈智华 2, 李世丹 2, 钟金城 1
(1. 西南民族大学青藏高原研究院, 四川 成都 610041; 2. 西南民族大学生命科学与技术学院, 四川 成都 610041)
摘 要: 采用 ISSR分子标记技术对25份来自川西北高原的野生垂穗披碱草(Elymus nutans Griseb.)种质进行遗传多样性
研究. 研究结果如下: (1)筛选出 10条 ISSR引物对 25份材料共扩增出 120条清晰的条带, 其中多态性条带 85条, 多态
性条带比率为 70.8%; 每条引物扩增条带数变化为 9-17 条, 平均每条引物总扩增的带数为 12 条, 其中多态性的条带数
变幅为 3-16 条, 平均每条引物的多态性条带数为 8.5 条. (2)供试的 25 份垂穗披碱草种质间的遗传相似系数变幅为
0.703-0.974, 平均值为 0.828, 供试材料间表现出了丰富的遗传多样性. (3)基于遗传相似系数对供试材料进行了聚类分析
和主成分分析, 聚类分析结果可以将供试的野生垂穗披碱草种质资源分明显分成 3类, 聚类分析结果与材料的地理来源
间具有一定的相关性.
关键词: 垂穗披碱草; 遗传多样性; ISSR; 种质保护
中图分类号: S811.5; S812 文献标识码: A 文章编号: 1003-4271(2014)03-0330-06
垂穗披碱草(Elymus nutans Griseb.), 又名钩头草、弯穗草, 是禾本科小麦族披碱草属的一种重要的多年生草
本植物[1-2]. 野生垂穗披碱草资源主要分布于我国的华北、西北、西南包括青藏高原等区域. 垂穗披碱草具有较
强的生态适应性和抗逆特性如具有极强的抗旱性和耐寒性, 其生境也包括了沟谷、滩地、高山林缘带、灌丛草
甸及高山草甸等. 该草草质柔软、无刚毛、无刺毛、无异味, 饲用价值较高, 是一种优良的禾本科饲草[3]. 同时
它也是草原和草甸等群落的重要组成成分, 具有较好的生态价值. 目前它与披碱草属的另外一种饲草老芒麦均
是青藏高原等高寒牧区退化草地改良及人工草地建设中应用最为广泛的牧草种类, 具有非常重要的推广应用价
值. 但是目前我国审定登记的垂穗披碱草品种仅有“甘南”、“康巴”、“阿坝“三个品种. 其中“甘南”、“康巴”两个
品种年代较久, 品种退化较严重, 它们已经远不能满足生态建设及草地畜牧业发展的需要, 所以亟待加快垂穗
披碱草种质资源的收集、创新及综合评价研究.
简单序列重复区间扩增多态性(Inter-simple sequence repeat, ISSR)是一种基于PCR技术的高效的分子标记[4].
相应的ISSR引物可直接在植物基因组中进行PCR扩增, 扩增产物可以用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳检测.
ISSR分子标记技术可以高效、快速及灵敏地检测出基因组DNA的多态性, 无需预先知道基因组DNA中的序列信
息即可检测. 同时, PCR扩增出的谱带丰富且具有良好的重复性, 操作过程简便、成本较低, 也适合于大样本的
检测. 目前, ISSR分子标记技术已经在植物种群遗传学、种质资源遗传评价、分类学与系统发生学等方面得到了
迅速而广泛的应用[5]. 目前已在小麦族中的披碱草属、仲彬草属等资源的遗传多样性评价、系统发育与演化等方
面得到成功的应用[6-7]. 目前, 对于野生垂穗披碱草种质资源的遗传评价方面的研究报道还较少, 特别是对来自
川西北高原分布的野生垂穗披碱草资源遗传多样性的研究还较少. 本研究采用ISSR分子标记技术对收集自川西
北高原的野生垂穗披碱草种质资源进行遗传多样性分析, 为川西高原野生垂穗披碱草种质资源的收集、保护及
育种开发等提供有益的参考.
1 材料与方法
1.1 供试材料
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试验收集了来自青藏高原东缘地区四川甘孜和阿坝的25份野生垂穗披碱草资源, 材料的编号和具体来源情
况如表1所示.
1.2 DNA提取
将垂穗披碱草的种子剥去外稃后在冰箱中低温保存处理 24h, 然后置于光照培养箱中 24℃条件下发芽, 待
供试的种子发芽后将幼苗转移到实验的瓦盆中. 数周后待其开始分蘖且叶片较多时取其较嫩的叶片提取基因组
DNA. 植物基因组总 DNA的提取采用改良的 CTAB法进行[8]. 最后提取的植物 DNA采用 1.0%的琼脂糖凝胶电
泳法和紫外分光光度计法及检测其纯度和浓度.
表 1 供试材料表
Table 1 the material used in the study
序号
Code
编号
No.
来源地
Origins
序号
Code
编号
No.
来源地
Origins
1 205221 四川 阿坝 14 PI 619520 四川 红原
2 205229 四川 阿坝 15 PI 639862 四川 康定
3 Y2227 四川 巴塘 16 W622107 四川 康定
4 205120 四川 稻城 17 Y2081 四川 康定
5 205116 四川 稻城 18 Y2084 四川 康定
6 205089 四川 稻城 19 205106 四川 理塘
7 205096 四川 稻城 20 205143 四川 理塘
8 Y2120 四川 德格 21 Y2110 四川 炉霍
9 Y2122 四川 德格 22 PI 619521 四川 炉霍
10 Y2126 四川 德格 23 Y2095 四川 乾宁
11 PI 619569 四川 德格 24 Y2097 四川 乾宁
12 Y2155 四川 甘孜 25 205218 四川 壤塘
13 205097 四川 红原
1.3 引物筛选
试验选取四个经电泳检测质量较高材料的 DNA进行 ISSR引物的筛选. 经 PCR及电泳分析后, 选择多态性
较好、条带清晰的引物用作后续 ISSR的研究分析. 最后试验挑选了其中的 10条多态性好及条带较清晰引物, 筛
选出的引物情况如表 2所示.
1.4 ISSR扩增和电泳
本试验扩增程序和反应体系参照Ma等[9]的试验进行. 反应体系总体积20μL, 其中含1×PCR buffer(10mol/L
Tris-HCl, 50mmol/L KCl, 0.1% Triton X-100, 1.5mol/L MgCl2), 0.2mmol/L dNTPs, 5pmol引物, 30 ng模板DNA, 1U
Taq DNA聚合酶(北京天根公司). PCR扩增在PTC-200 PCR仪上进行扩增, 扩增程序: 94 ℃ 5 min(预变性); 94 ℃
30S(变性), 51.3 ℃ 45 S(退火), 72 ℃ 2min(延伸), 45个循环; 最后72 ℃延伸10min; 4 ℃保存.
PCR扩增的产物在 6%浓度的聚丙烯酰胺凝胶中(丙烯酰胺: 甲叉=19: 1, 7.5mol/L尿素, 1×TBE缓冲液)进行
分离并采用银染法进行条带检测[10]. 每个样品上样 6μL, 以 D2000 Marker(北京天根公司)为对照, 在 DYCZ-20D
电泳仪(北京六一)上采用 80W 恒定功率条件进行电泳. 首先预电泳 30min, 然后加样电泳 1h, 电泳结束后再用
0.1%的 AgNO3进行银染色, 并在 Na2CO3弱碱显影液中进行显色, 电泳结果采用数码相机照相保存及分析.
1.5 数据统计与分析
在 ISSR电泳分析图谱中, 选择条带清晰且重复性较好的进行分析, 同时将实验扩增产物的每一个条带均视
为一个位点, 然后统计本研究中扩增的总位点数及多态性位点数. 按照条带的有、无分别进行赋值, 有带的记为
1, 无带的则记为 0. 本研究中供试材料间的遗传相似系数GS值则按照Nei-Li的方法进行计算. 其相关的计算公
式为: GS=2Nij/(Ni+Nj), 其中 Nij为供试物种材料 i和 j中共有的扩增位点的数目, Ni表示材料 i中出现的扩增位
点的数目, Nj代表材料 j中出现的扩增位点的数目. 另外, 在分析软件 NTSYS 2.1中, 根据不同材料间的遗传相
似系数 GS值采用不加权成对群算术平均法(UPGMA)进行聚类分析和主成分分析[11].
2 结果与分析
第 40卷
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2.1 ISSR标记多态性
本试验筛选出了10条扩增条带清晰、多态性较好的引物对25份野生垂穗披碱草种质资源进行了ISSR电泳分
析. 本试验中10条引物共扩增出了120条清晰的条带, 其中多态性条带为85条, 多态性条带比为70.8%. 每条引
物扩增的条带数变幅为9-17条, 平均扩增的条带数为12条; 其中条带引物扩增的多态性条带数变幅为3-16条, 平
均值为8.5条(如表2所示). 本试验ISSR电泳扩增出的片段长度大小约在200-2000bp之间(如图1所示). ISSR分子标
记在垂穗披碱草资源遗传多样性评价中表现出了较好的效果.
表 2 10个 ISSR引物序列及扩增结果
Table 2 The sequences and amplification results of 10 primers in the study
引物
Primers
序列
Sequence(5-3)
扩增总数
Total bands
多态带
polymorphic bands
多态性比率
The percentage of
polymorphic bands (%)
UBC807 (AG)8T 9 3 33.3%
UBC808 (AG)8C 15 10 66.7%
UBC811 (GA)8T 9 8 88.9%
UBC818 (CA)8G 10 6 60.0%
UBC835 (AG)8YC 13 5 38.4%
UBC840 (GA)8YT 13 13 100%
UBC844 (CT)8RC 14 11 78.6%
UBC845 (CT)8RG 10 7 70.0%
UBC848 (CA)8RG 17 16 94.1%
UBC873 (GGAGA)3 10 4 40.0%
Mean 12 8.5
Total 120 85 70.8%
图 1 引物 UBC807对 25份垂穗披碱草的扩增图
Fig.1 PCR amplification patterns of primer UBC807 in 25 Elymus nutans
2.2 遗传相似系数及聚类分析
在 NTSYS软件中基于 Dice遗传相似系数(GS值)计算出 25份野生垂穗披碱草种质间的遗传相似性系数变
幅为 0.703-0.974, 其中供试材料的平均 GS 值为 0.828, 供试野生垂穗披碱草表现出了丰富的遗传多样性. 在本
研究中供试材料Y2227(四川巴塘)与Y2110(四川炉霍)的供试材料之间的遗传相似系数GS值最小为 0.703, 这也
表明了这两份垂穗披碱草种质间的遗传距离较远, 它们间的亲缘关系也相对较远; 同时地理来源均来自于四川
康定的W622107和 Y2081这两份供试材料间的遗传相似系数 GS值最高为 0.9744, 这也表明了这两份供试垂穗
披碱草种质的遗传距离最小, 供试材料间的亲缘关系也相对较近.
基于不同供试材料间的 Dice 遗传相似系数值, 采用 UPGMA 法对供试的垂穗披碱草材料进行了聚类分析
(如图 2 所示). 从聚类图中可以看出 25 份供试的垂穗披碱草材料被明显地分成 3 个大类, 聚类分析与其地理来
源表现出了一定的相关性. 第一类主要包括四川阿坝(205221、205229)、稻城(205116、205089、205096)、德格
(Y2120、Y2126、PI619569)、甘孜(Y2155)以及红原(205097、PI619520)的 11份材料; 该类材料主要分布在川西
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北高原的边缘地带. 第二类主要包括四川康定(PI639862、W622107、Y2081)、理塘(205106、205143)、炉霍
(PI619521、Y2110)、壤塘(205218)以及乾宁(Y2095、Y2097)的 10份材料; 此类材料主要分布在川西北高原的中
南部. 第三类包括了四川康定(Y2084)、德格(Y2122)、巴塘(Y2227)以及稻城(205120)的 5份材料; 该类的材料的
聚类从地理来源上看较混杂, 和地理来源的相关性不是很大. 这可能与材料间具有相似的小生境有关, 材料间
发生了趋同变异.
图 2 25份垂穗披碱草材料基于遗传相似系数的 UPGMA聚类图
Fig.2 UPGMA dendrogram of 25 Elymus nutans based on genetic similarity coefficients
2.3 主成分分析
在NTSYS软件中基于Dice遗传相似系数对供试垂穗披碱草材料进行主成分分析, 并根据前三个主成分进行
绘图(如图3所示). 在主成分分析图中, 供试材料间的关系较近者其在图中的位置便较近, 相反其亲缘关系较远
者其在图中的位置也较远. 供试的垂穗披碱草种质材料中来自同一地区或者相近地理来源的材料基本能够划分
在一起. 这也表明了在本研究中聚类分析的结果与主成分分析的结果基本保持一致. 另外, 本研究中的主成分
分析图也更加直观地反映了供试的垂穗披碱草种质材料间的亲缘关系.
图 3 25份垂穗披碱草基于 ISSR标记的主成份分析
Fig.3 The principal coordinate analysis of 25 Elymus nutans based on ISSR data
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
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3 讨论
3.1 川西北高原野生垂穗披碱草 ISSR标记的遗传多样性
ISSR分子标记由于其快简便、快速、稳定性和重复性较好等特点广泛地应用于植物遗传研究的各个方面. 在
本研究中, 筛选出的10条效果较好的ISSR引物能够在25份供试材料中扩增出120条清晰的条带, 这其中包括了
多态性条带85条, 多态性条带比率为70.8%, 其揭示了川西北高原野生垂穗披碱草资源具有丰富的遗传多样性.
本研究中ISSR标记的多态性与相关研究中的RAPD的多态性效果相当, 但是ISSR的稳定性和重复性明显好于
RAPD技术[12]. 另外, 本研究中的10条ISSR引物能够将25份材料分开, 为种质资源的鉴定等研究提供了一定的
参考. 所以, 本研究也表明ISSR分子标记技术在垂穗披碱草种质资源的遗传评价、种质鉴定等中应用是行之有
效的.
3.2 川西北高原野生垂穗披碱草的遗传变异
目前, 不同的技术和方法均在不同程度上揭示了不同地区内垂穗披碱草种质资源的遗传多样性.如马啸等[13]
采用酸性聚丙烯凝胶电泳分析了来自于青藏高原等地区的33份野生垂穗披碱草种质的醇溶蛋白遗传多样性, 其
研究结果揭示了供试的垂穗披碱草材料间具有丰富的醇溶蛋白遗传多样性. 张建波等[14]也同样采用酸性聚丙烯
凝胶电泳分析了川西北高原不同垂穗披碱草种质的醇溶蛋白遗传特性, 其结果也揭示了该地区内垂穗披碱草种
质资源具有丰富的醇溶蛋白遗传多样性, 同时其聚类分析与供试材料的海拔间表现出了一定的相关性. 邓竹佳
等[12]采用RAPD技术也揭示了28份来自川西北的野生垂穗披碱草的遗传变异和分化情况. 这些研究结果与本研
究的结果基本一致, 均不同程度地揭示了野生垂穗披碱草资源的遗传变异和分化, 为垂穗披碱草资源的进一步
创新和利用提供了参考.
3.3 川西北高原野生垂穗披碱草种质资源的保护
对野生植物资源进行遗传多样性等评价, 可以为相关物种资源的保护和利用提供重要的参考[15]. 目前的一
些研究都表明了川西北高原野生垂穗披碱草具有丰富的遗传特性, 但是随着沙化、退化、盐碱化等生态环境的
不断恶化, 其野生优异基因资源等都不同程度的受到破坏和丧失, 所以非常有必要对其制定合理的保护和利用
策略. 杨智永等[16]研究了川西北若尔盖地区的垂穗披碱草种群分化及其性状的遗传规律, 结果发现其在细胞学
核型和生物学性状上存在显著的差异; 其种群分化成了不同的气候生态型及生物生态型. 严学兵等[17]研究了来
自青海、甘肃地区9个垂穗披碱草种群的遗传变异及其地理分化因素, 结果发现海拔是影响其遗传结构的主要因
素. Chen等[15]也分析了来自我国西部包括青藏高原地区垂穗披碱草的遗传和地理分化, 研究发现地理隔离及海
报等生态因子对其遗传变异和分化具有重要的作用. 本研究中ISSR分析结果也揭示了川西北高原野生垂穗披碱
草资源在其相近的生态地理区域内表现出了一定的遗传相似性. 所以本研究也建议在川西北地区垂穗披碱草应
该按照不同的生态地理区域进行保护和利用. 另外, 关于经纬度、海拔等因子在野生垂穗披碱草种质资源遗传变
异中的作用和重要性仍待进一步的研究和综合分析.
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Assessment of genetic diversity of Elymus nutans in northwest plateau of Sichuan
province using ISSR markers
ZHENG Jing-hong1, CHEN Shi-yong2, CHEN Zhi-hua2, LI Shi-dan2, ZHONG Jin-cheng1
(1. Institute of Qinghai-Tibet Plateau, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.;
2. School of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)
Abstract: The genetic diversity of 25 Elymus nutans wild accessions from northwest plateau of Sichuan province was
investigated using 10 ISSR primers. A total of 120 were detected, of which a total of 85 bands were polymorphic. The amplified
bands for each primer were ranged from 9 to 17, in an average of 12. Likewise, the polymorphic bands for each primer varied
from 3-16 bands with a mean of 8.5 bands. The genetic similarity (GS) values based on ISSR data ranged from 0.703-0.974
with a mean of 0.828, indicating a rich genetic diversity. The cluster analysis (UPGMA) and principle component analysis
(PCA) based on ISSR data showed that all 25 Elymus nutans could be divided into three groups, which showed some
correlation with the geographical origins of E. nutans.
Key words: Elymus nutans; genetic diversity; ISSR; germplasm conservation