全 文 ：▲在读硕士研究生
△通信作者。副教授，硕士研究生导师;E － mail:laomike2002@ so-
hu． com
三裂鼠尾草素对人 γδT细胞杀伤结肠癌
SW － 620 细胞的影响
陈洋1▲，费素娟2，周燏3，吕小婷3，刘军权3，陈复兴3，吴克俭2△
1徐州医学院临床学院(江苏徐州 221002);2徐州医学院附属医院消化内科(江苏徐州 221002);3中国人民解放
军第九七医院中心实验室(江苏徐州 221004)
【摘要】 目的 探讨三裂鼠尾草素对人 γδT细胞杀伤结肠癌 SW － 620 细胞的影响。方法 分离健康人外
周血单个核细胞，异戊烯焦磷酸法体外扩增 γδT细胞，不同浓度三裂鼠尾草素诱导人 γδT细胞 72 h，CCK8 法检测
γδT细胞增殖率，乳酸脱氢酶释放法检测诱导后 γδT 细胞对 SW － 620 细胞的杀伤活性，流式细胞术检测诱导后
γδT细胞穿孔素(PFP)、颗粒酶 B(GraB)、CD107a的表达，Western blot检测诱导后 γδT细胞 p － EＲK1 /2 的表达情
况。结果 经培养 10 d，γδT细胞比例由 4. 32%增加至 83. 63%。三裂鼠尾草素浓度为 0. 047 7 ～ 195 pmol /L 时
γδT细胞增殖率显著升高(P ＜ 0. 05) ，浓度为 0. 191 ～ 195 pmol /L时 γδT细胞对 SW － 620 细胞的杀伤活性显著增
加(P ＜ 0. 05)。经三裂鼠尾草素诱导 72 h，γδT细胞 PFP、GraB、CD107a的表达显著升高(P ＜ 0. 05)。三裂鼠尾草
素浓度为 0. 763 ～ 195 pmol /L时 γδT细胞 p － EＲK1 /2 的表达显著增加(P ＜ 0. 05)。结论 在一定浓度范围内三
裂鼠尾草素能够促进人 γδT细胞增殖，增强其对结肠癌细胞 SW －620 的杀伤活性，其机制可能与 PFP、GraB的表
达上调和 p － EＲK1 /2 信号通路活化有关。
【关键词】 三裂鼠尾草素;γδT细胞;结肠癌细胞;细胞增殖;杀伤活性
Effects of salvigenin on human γδT cell killing of colon cancer cell lines SW － 620． CHEN Yang☆，FEI Su － juan，
ZHOU Yu，LV Xiao － ting，LIU Jun － quan，CHEN Fu － xing，WU Ke － jian． ☆Clinical College，Xuzhou Medical College，
Xuzhou 221002，China
Corresponding author:WU Ke － jian． E － mail:laomike2002@ sohu． com
【Abstract】 Objective To investigate the effects of salvigenin on human γδT cell killing of colon cancer cell lines
SW －620．Methods Peripheral blood mononuclear cells were separated from healthy subjects and isopentenyl pyrophos-
phate method was used to amplify γδT cells in vitro． After γδT cells were cultured with different concentrations of salvige-
nin for 72 h，CCK8 assay was used to assess the proliferation of γδT cells． Lactate dehydrogenase release assay was ap-
plied to measure the cytotoxic activity of γδT cells to colon cancer cells in vitro． Flow cytometry was performed to detect
the expression of granzyme B (GraB) ，perforin (PFP)and CD107a of γδT cells after treatment． Western blot assay was
used to test p － EＲK1 /2 expression in the treated γδT cells． Ｒesults After ten days of culture，the proportion of γδT
cells increased from 4. 32% to 83. 63% ． When salvigenin concentration was between 0. 047 7 pmol /L and 195 pmol /L，
the proliferation rate of γδT cells increased remarkably (P ＜ 0. 05)． When the concentration was between 0. 191 pmol /L
and 195 pmol /L，the cytotoxic activity of γδT cells to SW －620 cells enhanced significantly (P ＜ 0. 05)． After induction
with salvigenin for 72 h，expressions of GraB，PFP and CD107a were significantly higher (P ＜ 0. 05)． When salvigenin
concentration was between 0． 763 pmol /L and 195 pmol /L，expression of p － EＲK1 /2 was significantly elevated． Conclu-
sion At suitable concentrations，salvigenin can promote proliferation of human γδT cells and increase their cytotoxic ac-
tivity against colon cancer cell SW － 620． A possible mechanism may be up － regulated expressions of PFP and GraB and
activation of the p － EＲK1 /2 signaling pathway．
【Key words】 salvigenin;γδT cell;colon cancer;cell proliferation;cytotoxic activity
结肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，尽管手术
切除、放化疗等可以改善患者的生存率［1 － 2］，但在实践
中我们发现这些治疗手段均存在一定的局限性和不
足，5 年生存率仅为 50% ～ 70%。免疫治疗能够增强
患者抗肿瘤免疫反应，且不良反小、安全稳定，可有效
提高生存率，改善患者生活质量，已成为继手术、放化
疗后治疗肿瘤的第 4 种模式。活化的 γδT细胞具有广
谱抗肿瘤活性，对机体有免疫保护作用，近年来 γδT细
胞已成为一种新的免疫治疗候选细胞［3 － 5］。因此，如
何有效提高 γδT细胞的增殖率、增强其杀伤活性对临
床免疫治疗有重要意义。黄酮类化合物可以激活免疫
细胞对肿瘤细胞的免疫应答来杀伤肿瘤细胞［6］。三裂
鼠尾草素是一种黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗
肿瘤生长等多种药理活性［7 － 8］，但是其对免疫细胞的
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DOI:10.13820/j.cnki.gdyx.2015.22.002
影响鲜有报道。2014 年 2—12 月，本研究通过观察三
裂鼠尾草素作用后 γδT细胞的体外增殖情况及对结肠
癌 SW － 620 细胞的杀伤活性，推测三裂鼠尾草素能够
增强 γδT细胞抗肿瘤效应，并尝试探讨其机制，为三裂
鼠尾草素参与 γδT细胞抗肿瘤免疫治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1． 1 细胞及主要试剂、仪器 三裂鼠尾草素购自
Ｒuibio公司，人结肠癌细胞株 SW － 620 购自上海细胞
生物研究所，人 AB 血清购自徐州市血站，胰蛋白酶、
ＲPMI 1640 购自 Gibco公司，胎牛血清和淋巴细胞分离
液购自中国科学院血液病研究所，IL － 2 购自厦门特宝
生物公司，抗人 γδT细胞受体(anti － γδTCＲ)、PE 标记
的颗粒酶 B(granzyme B，GraB)及穿孔素(perforin，
PFP)和 APC 标记的 CD107a 抗体均购自杭州联科生
物，乳酸脱氢酶试剂盒购自日本市诺临床诊断制品株
式会社，FACS Caliber流式细胞仪购自 BD公司。
1． 2 实验方法
1． 2． 1 人 γδT细胞的培养 取健康献血者末梢抗凝
血 20 mL，加入淋巴细胞分离液，2 000 r /min 离心 15
min，吸取单个核细胞层，生理盐水洗涤 3 遍(1 500 r /
min，10 min /次)。加人含 IL － 2(2 × 105 U /L)、胎牛血
清(100 mL /L)、人 AB 血清(50 mL /L)和异戊烯焦磷
酸(3 μg /L)的 ＲPMI 1640 培养液中，调整细胞浓度为
1 × 108·L －1，置于 75 cm2 细胞培养瓶，于 37℃、5%
CO2 培养箱中培养，根据细胞生长情况及时更换培养
液。收集培养 10 d 后的细胞，McAb 荧光标记后进行
流式细胞术检测。
1． 2． 2 结肠癌细胞株 SW － 620 的培养 将复苏后的
结肠癌 SW － 620 细胞放入细胞培养瓶中，加入 15 mL
含 10%小牛血清的 ＲPMI 培养液，在 37℃、5% CO2 条
件下培养，2 ～ 3 d 更换培养液，待细胞铺满瓶底时，使
用 2. 5 g /L的胰蛋白酶消化脱壁收集细胞，1 500 r /min
离心 3 min，弃去上清液，生理盐水反复吹打混匀，计数
后用于实验。
1． 2． 3 CCK8 法检测三裂鼠尾草素对人 γδT细胞生长
的影响 取培养 10 d的 γδT细胞，分别以每孔 5 × 104
个细胞接种于 96 孔板，根据三裂鼠尾草素不同终浓度
(0、0. 011 9、0. 044 7、0. 191、0. 763、3. 05、12. 2、48. 8、
195 pmol /L)分为 9 组。待细胞贴壁后加药，每组设 3
个复孔。孵育 72 h 后，每孔加入 CCK8 10 μL，37℃孵
育 4 h后，于酶标仪 450 nm 处检测各孔吸光度(OD)
值，计算细胞生长增殖率，并绘制生长曲线。每组实验
重复 3 次，取平均值。增殖率(%)=(实验组 OD值 －
对照组 OD值)/对照组 OD值 × 100%。
1． 2． 4 流式分析仪检测三裂鼠尾草素作用后 γδT 细
胞 PFP、GraB、CD107a的表达 取经过不同终浓度(0、
0. 191、0. 763、3. 05、12. 2、48. 8、195 pmol /L)的三裂鼠
尾草素诱导 72 h后的人 γδT细胞，PBS洗涤 3 遍，调整
细胞浓度为 1 × 107·mL －1，取细胞悬液 100 μL，置流
式分析专用试管。每管加入 anti － γδTCＲ － FITC 20
μL，避光孵育 30 min。加入 100 μL固定液室温避光孵
育 15 min，PBS 洗涤，1 500 r /min 离心 5 min，弃上清
液。检测 CD107a的管加入 APC 标记的鼠抗人 anti －
CD107a 5 μL;检测 GraB、PFP 的管加 100 μL 破膜剂
B，同时分别在试管中加入 anti － GraB － PE、anti － PFP －
PE各 5 μL;均设置同型对照抗体管，用来设门确定阴
性范围和补偿。室温避光孵育 15 min，PBS洗涤，2 000
r /min离心 5 min，弃上清液，PBS 1 mL 重悬细胞，流式
细胞仪分析各管 PFP、GraB、CD107a 的表达。每组实
验重复 3 次，取平均值。
1． 2． 5 乳酸脱氢酶释放法检测三裂鼠尾草素作用后
γδT细胞对结肠癌 SW － 620 细胞的杀伤活性 取培养
10 d的 γδT细胞，调整为 2 × 108·L －1，每孔 3 mL接种
于 6 孔板，根据三裂鼠尾草素终浓度(0、0. 191、0. 763、
3. 05、12. 2、48. 8、195 pmol /L)分为 7 组，待细胞贴壁后
加药培养 72 h，收集 γδT细胞作为效应细胞，对数生长
期的 SW － 620 细胞作为靶细胞，将效应细胞和靶细胞
分别调整成浓度为 2. 0 × 109·L －1和 1. 0 × 108·L －1的
细胞悬液，等体积混合，使效靶细胞比例为 20∶1，置于
37℃、5% CO2 培养箱中孵育 6 h，以 1 800 r /min 离心
10 min，收集上清液，全自动生化分析仪 340 nm波长下
测定吸光度值(A值) ，计算杀伤活性。杀伤活性(%)=
(实验组 A值 －效应细胞自然释放组 A 值)/(靶细胞
最大释放组 A值 －靶细胞自然释放组 A值)× 100%。
1． 2． 6 Western blot 检测三裂鼠尾草素对人 γδT 细胞
p － EＲK1 /2 的表达影响 取培养 10 d的 γδT细胞，配
成浓度为 5 × 108·L －1的细胞悬液，接种于 6 孔板，每
孔 3 mL，根据三裂鼠尾草素不同终浓度(0、0. 763、
3. 05、12. 2、48. 8、195 pmol /L)分为 6 组，待细胞贴壁后
加药培养 72 h，收集人 γδT 细胞，加入细胞裂解液，收
集细胞总蛋白。BCA 法测蛋白浓度，按每泳道蛋白样
品 40 μg加入 SDS － PAGE样品孔内，电泳、转膜、孵育
一抗和二抗，Image J软件分析灰度值。
1． 3 统计学方法 采用 SPSS 16. 0 统计软件，多组间
比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD检验。
2 结果
2． 1 γδT细胞的培养结果 γδT 细胞体外培养 10 d
后，细胞比例由培养前的 4. 45%增加到 90. 14%，见图
1;倒置显微镜下观察发现人 γδT 细胞数量明显增多，
聚集成团可见大的细胞集落和单个贴壁生长的细胞，
细胞形态呈梭形，见图 2。
2． 2 三裂鼠尾草素对 γδT 细胞增殖的影响 γδT 细
胞经不同浓度的三裂鼠尾草素作用 72 h 后发现，当三
裂鼠尾草素浓度在 0. 047 7 ～ 195 pmol /L 时，γδT 细胞
增殖率显著高于浓度在 0 pmol /L时(P ＜ 0. 05) ，且呈
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A:培养前;B:培养 10 d后
图 1 γδT细胞比例
图 2 培养 10 d的 γδT细胞形态(× 200)
剂量依赖性，浓度在 12. 2 pmol /L时 γδT细胞增殖率达
到最高峰，浓度超过 12. 2 pmol /L时增殖率开始出现下
降趋势。见表 1。
2． 3 三裂鼠尾草素对 γδT 细胞 PFP、GraB、CD107a
表达的影响 γδT细胞经不同浓度的三裂鼠尾草素作
用 72 h后发现，当三裂鼠尾草素浓度在 0. 763 ～ 12. 2
表 1 各浓度三裂鼠尾草素作用后 γδT
细胞增殖率(n = 3) (珋x ± s)%
浓度 增殖率 浓度 增殖率
0 pmol /L 0． 00 ± 0． 00 3． 05 pmol /L 44． 06 ± 2． 23*
0． 011 9 pmol /L 4． 19 ± 3． 27 12． 2 pmol /L 48． 63 ± 2． 44*
0． 047 7 pmol /L 14． 64 ± 2． 21* 48． 8 pmol /L 34． 02 ± 2． 36*
0． 191 pmol /L 18． 55 ± 2． 89* 195 pmol /L 29． 71 ± 2． 85*
0． 763 pmol /L 29． 65 ± 3． 15*
* 与 0 pmol /L比较 P ＜ 0. 05
pmol /L时，γδT细胞 PFP 的表达率显著高于浓度在 0
pmol /L时(P ＜ 0. 05) ，浓度在 3. 05 pmol /L时表达率最
高;当三裂鼠尾草素浓度在 0. 191 ～ 195 pmol /L 时，
γδT细胞 GraB 的表达率显著高于浓度在 0 pmol /L 时
(P ＜ 0. 05) ，浓度在 0. 763 pmol /L时表达率最高;当三
裂鼠尾草素浓度在 0. 763 ～ 48. 8 pmol /L 时，γδT 细胞
CD107a的表达率显著高于浓度在 0 pmol /L 时(P ＜
0. 05) ，浓度在 0. 763 pmol /L 时表达率达高峰。见图
3 ～ 5 和表 2。
2． 4 三裂鼠尾草素诱导的 γδT 细胞对结肠癌 SW －
620 细胞的杀伤活性 γδT 细胞经不同浓度的三裂鼠
尾草素作用 72 h 后发现，当三裂鼠尾草素浓度在
0. 191 ～ 195 pmol /L时，γδT细胞对 SW － 620 细胞的杀
伤活性显著高于浓度在 0 pmol /L 时(P ＜ 0. 05) ，当浓
度在 0. 191 ～ 3. 05 pmol /L 时，杀伤活性随着浓度升高
而增强，当浓度为 3. 05 pmol /L 时，γδT 细胞的杀伤活
性达到最强，浓度在 12. 2 ～ 195 pmol /L 时杀伤活性逐
渐下降。见表 3。
A:IgG2b同型对照;B:0 pmol /L;C:3. 05 pmol /L
图 3 各浓度三裂鼠尾草素作用后 γδT细胞 PFP的表达
A:IgG1 同型对照;B:0 pmol /L;C:0． 763 pmol /L
图 4 各浓度三裂鼠尾草素作用后 γδT细胞 GraB的表达
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A:IgG1 同型对照;B:0 pmol /L;C:0． 763 pmol /L
图 5 各浓度三裂鼠尾草素作用后 γδT细胞 CD107a的表达
表 2 各浓度三裂鼠尾草素作用后 γδT细胞 PFP、GraB、
CD107a的表达率(n = 3) (珋x ± s)%
浓度 PFP GraB CD107a
0 pmol /L 61． 19 ± 3． 51 52． 25 ± 2． 44 52． 13 ± 2． 66
0． 191 pmol /L 64． 11 ± 2． 62 59． 91 ± 3． 97* 57． 39 ± 2． 94
0． 763 pmol /L 67． 47 ± 4． 42* 68． 08 ± 2． 31* 67． 69 ± 5． 11*
3． 05 pmol /L 72． 18 ± 2． 10* 65． 17 ± 5． 59* 64． 15 ± 5． 26*
12． 2 pmol /L 67． 59 ± 2． 15* 64． 13 ± 4． 17* 60． 75 ± 2． 48*
48． 8 pmol /L 65． 60 ± 2． 33 61． 12 ± 2． 90* 60． 50 ± 2． 11*
195 pmol /L 64． 19 ± 2． 50 58． 87 ± 1． 90* 57． 42 ± 4． 09
* 与 0 pmol /L比较 P ＜ 0. 05
表 3 各浓度三裂鼠尾草素作用后 γδT细胞对
结肠癌细胞的杀伤活性(n = 3) (珋x ± s)%
浓度 杀伤活性 浓度 杀伤活性
0 pmol /L 30． 83 ± 5． 18 12． 2 pmol /L 55． 67 ± 6． 19*
0． 191 pmol /L 48． 29 ± 3． 96* 48． 8 pmol /L 49． 74 ± 4． 36*
0． 763 pmol /L 50． 11 ± 4． 33* 195 pmol /L 45． 28 ± 4． 80*
3． 05 pmol /L 60． 27 ± 3． 47*
* 与 0 pmol /L比较 P ＜ 0. 05
2． 5 三裂鼠尾草素对 γδT细胞 p － EＲK1 /2 表达的影
响 γδT细胞经不同浓度的三裂鼠尾草素作用 72 h后
发现，当三裂鼠尾草素浓度在 0. 763 ～ 195 pmol /L 时，
γδT 细胞 p － EＲK1 /2 的表达量显著高于浓度在 0
pmol /L时(P ＜ 0. 05) ，且浓度在 3. 05 pmol /L时表达量
最高。见图 6 和表 4。
1:0 pmol /L;2:195 pmol /L;3:48. 8 pmol /L;4:12. 2 pmol /L;5:3. 05
pmol /L;6:0. 763 pmol /L
图 6 各浓度三裂鼠尾草素作用后 γδT细胞 p － EＲK1 /2 的表达
表 4 各浓度三裂鼠尾草素作用后 γδT细胞
p － EＲK1 /2 的表达量(n = 3) 珋x ± s
浓度 p － EＲK1 /2 浓度 p － EＲK1 /2
0 pmol /L 0． 758 ±0． 058 12． 2 pmol /L 1． 524 ±0． 118*
0． 763 pmol /L 1． 439 ±0． 145* 48． 8 pmol /L 1． 415 ±0． 045*
3． 05 pmol /L 1． 951 ±0． 187* 195 pmol /L 1． 352 ±0． 098*
* 与 0 pmol /L比较 P ＜ 0. 05
3 讨论
过继免疫细胞疗法(adoptive cell － based immuno-
therapy)为体外扩增自体或者异体免疫效应细胞，尤其
是 T淋巴细胞，功能鉴定后回输到肿瘤患者体内，引起
针对肿瘤细胞的过继性免疫杀伤［9］。γδT 细胞是 T 淋
巴细胞的重要亚群，属于非特异性免疫细胞，能够以主
要组织相容性复合物非限制性方式直接识别多种肿瘤
抗原，具有广谱抗肿瘤活性，在体内外均可抑制多种肿
瘤生长［3 － 5］。以往的研究已经证实，γδT细胞对结肠癌
细胞系具有杀伤作用，却对正常结肠细胞无反
应［10 － 13］。因此，以 γδT细胞为基础的结肠癌过继性免
疫治疗具有良好的发展前景。
三裂鼠尾草素是一种黄酮类化合物，目前认为其
具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤的作用。ＲAFATIAN 等［8］研
究发现三裂鼠尾草素能够抑制细胞凋亡，具有抗氧化
能力;而一项在小鼠动物模型的研究发现，三裂鼠尾草
素有抗肿瘤活性，可以抑制乳腺肿瘤的增殖［7］。但其
对于体外诱导 γδT细胞增殖作用及其对免疫功能的影
响鲜见报道。本研究发现三裂鼠尾草素在体外可以促
进人 γδT 细胞的增殖，并且呈浓度依赖性。经三裂鼠
尾草素诱导 72 h后，随着浓度的升高，γδT细胞的增殖
率逐渐上升，尤其 12. 2 pmol /L 浓度时，增殖率达到最
高峰;当浓度超过 12. 2 pmol /L 时，增殖率开始逐渐下
降。这表明三裂鼠尾草素对 γδT细胞的增殖作用存在
浓度窗现象，适当浓度可以促进 γδT细胞的增殖，高浓
度反而对细胞生长有抑制作用。我们推测这与三裂鼠
尾草素细胞毒性有关，三裂鼠尾草素浓度过高时会降低
γδT细胞的活性，直接杀死或者诱导 γδT细胞凋亡。
本研究采用乳酸脱氢酶释放法检测 γδT细胞杀伤
活性，结果表明，三裂鼠尾草素能够增强 γδT细胞的杀
伤活性，且杀伤活性随着浓度的增加而增强，在 3. 05
pmol /L时最显著。γδT细胞主要通过 PFP －颗粒酶和
Fas /FasL途径发挥细胞毒效应。PFP 是一种细胞毒性
物质，可存储于胞浆颗粒中，可在靶细胞膜上形成“孔
道”，颗粒酶即丝氨酸蛋白酶，可通过“孔道”进入胞
内，激活 caspases 酶，直接裂解靶细胞细胞内底物，诱
导线粒体损伤，促使靶细胞凋亡［14］。本研究结果显示，
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经三裂鼠尾草素处理 72 h 后，在一定浓度范围内，γδT
细胞的 PFP、GraB的表达明显高于浓度为 0 pmol /L 时，
且随着浓度的增加而增多，当达到最高峰后逐渐下降，
这与三裂鼠尾草素诱导后 γδT细胞的杀伤活性变化基
本一致。因此我们推测三裂鼠尾草素能够增强 γδT细
胞的抗肿瘤活性，其机制可能与 PFP、GraB表达上调有
关。既往研究认为人外周血 γδT 细胞 CD107a 的表达
是 γδT细胞细胞毒活性的一个重要功能标志物，与其
抗肿瘤活性呈正相关［11，15］。本研究显示，经三裂鼠尾
草素处理 72 h后，γδT细胞 CD107a的表达明显高于浓
度为 0 pmol /L时，与 PFP、GraB 的表达变化及杀伤活
性的改变基本一致，进一步佐证了三裂鼠尾草素能够
增强 γδT细胞细胞毒活性。
近年来研究发现，细胞外信号调节激酶(EＲK1 /2)
是 MAPK家族的重要成员，磷酸化的 EＲK(p － EＲK)
是其活化形式，可介导细胞外刺激引起的信号传递，在
细胞增殖过程中具有重要作用［16］。有报道指出 γδT
细胞的活化与增殖效应与激活 EＲK1 /2 信号通路有
关，阻断 EＲK1 /2 信号通路可显著抑制细胞增殖效应。
本研究结果表明，在三裂鼠尾草素浓度为 0. 763 ～ 195
pmol /L时，γδT细胞 p － EＲK1 /2 的表达强度高于浓度
为 0 pmo /L时，而此浓度范围内三裂鼠尾草素促 γδT
细胞增殖作用最为明显。因此我们推测三裂鼠尾草素
促 γδT细胞增殖作用可能与其使 p － EＲK表达升高有
关，适当浓度的三裂鼠尾草素能够激活 EＲK1 /2 信号
通路促进 γδT细胞的增殖，进而增强机体免疫反应。
综上所述，三裂鼠尾草素不仅能够促进 γδT 细胞
的增殖，而且可以增强其对结肠癌细胞的杀伤活性，推
测机制可能与 γδT细胞 PFP、GraB表达上调及 EＲK信
号通路的活化有关。这为三裂鼠尾草素联合 γδT细胞
应用于结肠癌免疫治疗提供了理论依据和剂量参考。
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(收稿日期:2015 － 03 － 11 编辑:陈嘉伟)
·9243·广东医学 2015 年 11 月 第 36 卷第 22 期 Guangdong Medical Journal Nov． 2015，Vol． 36，No． 22