全 文 ：doi:10． 3969 / j． issn． 1006-5709． 2015． 10． 005 论著·胃癌
第一作者简介:王军生，硕士研究生，研究方向:消化系肿瘤的基础与临
床研究。E-mail:57844291@ qq． com
通讯作者:吴克俭，副教授，硕士生导师，研究方向:消化系肿瘤的基础
与临床研究。E-mail:laomike2002@ sohu． com
三裂鼠尾草素在 CIK 细胞增殖及其胃癌细胞杀伤中的
作用
王军生，吴克俭，刘军权，陈复兴，陈永强，周 燏，颜学兵
徐州医学院附属医院消化内科，江苏 徐州 221006
【摘要】 目的 分析三裂鼠尾草素在 CIK细胞增殖中的作用，探讨其在 CIK细胞对胃癌细胞 SGC-7901 杀伤活性的影响及作用机
制。方法 分离健康人体外周血单个核细胞，体外多种刺激因子共同诱导为 CIK细胞;予不同浓度三裂鼠尾草素分别加入 CIK 细
胞，于 24、48、72 h后 CCK8 法检测 CIK细胞增殖率;流式细胞术检测 CIK细胞颗粒酶 B(GranzymeB，GraB)、穿孔素(Perforin，PFP)、
CD107a的表达;Western blotting检测 CIK细胞 β-catetin、P-EＲK1 /2 和 P-AKT 的表达;乳酸脱氢酶释放法检测三裂鼠尾草素对 CIK
细胞杀胃癌细胞株的活性。结果 三裂鼠尾草素诱导 48 h 后，CIK 细胞 3． 2 ～ 102． 4 pmol /L 浓度组增殖明显(P ＜ 0． 05) ;
25． 6 pmol /L浓度组 GraB、PFP、CD107a和 β-catetin、P-EＲK1 /2 和 P-AKT的表达显著高于对照组(P ＜ 0． 05) ;且对 SGC-7901 的杀伤
活性较对照组增强(P ＜ 0． 05)。结论 三裂鼠尾草素在一定浓度范围内能够促进 CIK细胞增殖，并增强其对胃癌细胞 SGC-7901 的
杀伤活性，其机制可能与活化 β-catetin、P-EＲK1 /2、P-AKT和上调 PFP、GraB、CD107a的表达有关。
【关键词】 三裂鼠尾草素;胃癌细胞;CIK细胞;杀伤活性
中图分类号:Ｒ735． 2 文献标识码:A 文章编号:1006 － 5709(2015)10 － 1179 － 04 收稿日期:2015-02-27
The role of Salvigenin in CIK cells proliferation and to kill gastric cancer cells
WANG Junsheng，WU Kejian，LIU Junquan，CHEN Fuxing，CHEN Yongqiang，ZHOU Ju，YAN Xuebing
Department of Gastroenterology，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221006，China
【Abstract】 Objective To investigate the role of Salvigenin in CIK cells proliferation and investigate the possible
mechanism and effect of CIK cells on the activity of gastric cancer cells SGC-7901． Methods The healthy human pe-
ripheral blood mononuclear cells were separated，and CIK cells were inducted under a variety of stimulating factors in
vitro，and then add CIK cells in different concentrations of Salvigenin． The CIK cells proliferation rate was detected by
CCK8 method after 24，48，72 hours，the expression of GraB，PFP，CD107a by flow cytometry，the expression of β-ca-
tetin，P-EＲK1 /2 and P-AKT by Western blotting and the activity of Salvigenin about CIK cells kill gastric cancer cell
strain by LDH release mothod． Ｒesults Induced 48 hours later with Salvigenin，CIK cells proliferation significantly in
concentration 3． 2 to 102． 4 pmol /L group (P ＜ 0． 05) ，the expression of GraB，PFP，CD107a，β-catetin，EＲK1 /2 and
P-AKT was significantly higher than control group in 25． 6 pmol /L concentration group (P ＜ 0． 05)． Conclusion
Salvigenin can promote CIK cells proliferation and enhance the activity of gastric cancer cells SGC-7901 in the certain
concentration range，the mechanism may be related to the activity of the β-catetin，P-EＲK1 /2，P-AKT and the up-regu-
lation of the expression of PFP，GraB，CD107a．
【Key words】 Salvigenin;Gastric cancer cells;CIK cells;Killing activity
胃癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人
类健康，肿瘤过继细胞免疫治疗成为治疗胃癌的新途
径之一，其主要是利用肿瘤患者的自身免疫细胞达到
治疗的目的［1］。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-
induced killer cells，CIK)是一种重要的免疫效应细胞，
具有抗肿瘤活性。但如何获得足够数量并具有高活性
的 CIK 细胞已成为治疗有效与否的关键［2］。三裂鼠
尾草素(Salvigenin)有促进细胞凋亡、免疫调节功能，
具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性［3］。本实
验通过观察三裂鼠尾草素对 CIK 细胞增殖及对胃癌
细胞 SGC-7901 杀伤活性的影响，进而探讨其可能的
机理。
1 材料与方法
1． 1 材料 主要试剂:人胃癌 SGC-7901 细胞株(上
海细胞研究所) ;PerCP-Cy 5． 5标记的 CD3 抗体和
FITC标记的 CD56 抗体、PE 标记的穿孔素(Perforin，
PFP)、颗粒酶 B(GranzymeB，GraB)和 APC 标记的
CD107a 抗体(杭州联科生物公司) ;IL-15 和 IL-21
(Ｒ＆D公司) ;CD3 mAb(上海免疫研究所) ;CD28 mAb
(苏州大学生物技术研究所) ;鼠抗人 β-catetin、P-
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EＲK1 /2，兔抗人 Bcl-2 和 P-AKT抗体(CST公司)。
1． 2 方法
1． 2． 1 CIK细胞的培养:取健康者外周抗凝血 100 ml，
分离得到单个核细胞，调整细胞数为 5 × 108 /L，加
入 PPMI 1640 培养液，接种于 6 孔细胞培养板，每
孔 5 μl，置 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养 24 h 后收集
细胞，调整细胞数为 5 × 108 /L，用 PPMI 1640 完全培养
液接种于 6 孔板，于 37 ℃、5% CO2 培养箱中培养，每
2 d 换培养基(含 IL-15、IL-21、CD28)1 次，采用 FCM
检测 CIK细胞表型 CD3 + CD56 +表达。
1． 2． 2 CCK8 法检测三裂鼠尾草素对 CIK 细胞生长
的影响:收集培养 10 d 的 CIK 细胞，1 × 108 /L 细胞数
接种于 96 孔板，200 μl /孔，加入三裂鼠尾草素［终浓
度为 0(空白对照组)、0． 1、0． 2、0． 4、0． 8、1． 6、3、6、12． 8、
25． 6、51． 2、102． 4、204． 8、409． 6、819． 2、1 638． 4 pmol /L］，
孵育 24、48、72 h 后，加入 CCK8，孵育后，于酶标仪
450 nm处检测各孔吸光值(OD)。
1． 2． 3 FCM 检测三裂鼠尾草素对 CIK 细胞中
CD107a、GraB和 PFP表达的影响:收集培养 10 d CIK
细胞分别接种于 6 孔板，加入三裂鼠尾草素［终浓度分
别为 0(空白对照组)、0． 4、1． 6、6． 4、25． 6、102． 4 pmol /L］，
FCM检测 CD107a、GraB和 PFP的含量。
1． 2． 4 LDH 释放法检测 CIK 细胞杀伤活性:按已建
立的 LDH释放法［4］进行检测。收集培养 10 d 的 CIK
细胞，加入三裂鼠尾草素(终浓度分别为 0、0． 4、1． 6、
6． 4、25． 6、102． 4 pmol /L) ，同时设 FCM 检测 CIK 细胞
表型 CD3 + CD56 +表达 FCM检测 CIK细胞表型 CD3 +
CD56 +表达，取胃癌 SGC-7901 细胞株，使效应细胞和
靶细胞比例为 10∶ 1，按 LDH 试剂盒说明书要求操作，
在生化分析仪 340 nm处测定吸光度值(A)。
1． 2． 5 Western blotting:Western blotting 检测三裂鼠
尾草素作用前后 CIK 细胞 β-catetin、P-EＲK1 /2 和 P-
AKT的表达。
1． 3 统计学方法 采用 SPSS 13． 0 软件进行单因素
方差分析，P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 CIK细胞的培养 培养前，外调血单位核细胞
(peripheral blood monouclear cells，PBMC)中 CD3 +
CD56 + T细胞比例 ＜ 4%，培养 10 d 后 CD3 + CD56 + T
细胞比例增至 45． 20%，与培养前比较，显微镜观察可
见培养第 10 天的 CIK 细胞，细胞体积增大，呈圆形或
椭圆形，包膜光滑，细胞数量增多，部分形成集落，FCM
检测 CIK细胞表型 CD3 + CD56 +表达如图 1 所示。
2． 2 CCK8 检测结果 相同浓度的三裂鼠尾草素作
用后，48 h时 CIK细胞增殖达最高峰，与 24 h、72 h 组
比较，差异有统计学意义(P ＜ 0． 05) ;与对照组比较，
浓度为 1． 6 ～ 204． 8 pmol /L 的三裂鼠尾草素诱导 CIK
细胞 24 h、48 h、72 h 后，CIK 细胞增殖明显(P ＜
0． 05) ;三裂鼠尾草素浓度为 409． 2 ～ 1 638． 4 pmol /L
时，CIK细胞增殖率为负值，与对照组相比，差异有统
计学意义(P ＜ 0． 05，见图 2)。
图 1 CIK细胞的培养:扩增前和扩增第 10 天 CIK细胞 FCM
分析
Fig 1 The cultivation of CIK cells:before the amplification
and the FCM analysis of CIK cells on the tenth day
注:与对照组比较，* P ＜ 0． 05;相同浓度时，与 24、72 h组比较，
▲P ＜ 0． 05。
图 2 三裂鼠尾草素对 CIK细胞增殖率的影响
Fig 2 The effect of Salvigenin on the proliferation rate of
CIK cells
2． 3 FCM 检测结果 三裂鼠尾草素作用 CIK 细胞
48 h后，CIK细胞 GraB、PFP和 CD107a 的表达不同程
度升高，25． 6 pmol /L浓度组与对照组比较，差异均有
统计学意义(P ＜ 0． 05) ;各实验组中，25． 6 pmol /L 组
GraB、PFP 和 CD107a 的表达最高，与其他浓度组相
比，差异有统计学意义(P ＜ 0． 05，见图 3)。
2． 4 杀伤活性检测结果 三裂鼠尾草素的浓度在
1 ． 6 ～ 25． 6 pmol /L作用 CIK细胞 48 h后，对胃癌细胞
株的杀伤活性显著高于对照组，差异有统计学意义(P ＜
0． 05) ;浓度在 25． 6 pmol /L 时杀伤活性达最高峰，为
96． 75%，与对照组比较，差异有统计学意义(P ＜
0． 05，见图 4)。
2． 5 Western blotting检测结果 三裂鼠尾草素作用
CIK细胞 48 h后，CIK 细胞 β-catetin、P-EＲK1 /2、Bcl-2
和 P-AKT的表达不同程度升高，在浓度为 25． 6 pmol /L
时，β-catetin、P-EＲK1 /2、Bcl-2 和 P-AKT 的表达均高
于对照组(P ＜ 0． 05，见图 5 ～ 6)。
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注:与对照组比较，* P ＜ 0． 05;与 25． 6 pmol /L组相比，△P ＜ 0． 05。
图 3 三裂鼠尾草素作用 48 h后，CIK细胞 GraB、PFP、CD107a表达的 FCM结果
Fig 3 Expressions of Gra B，PFP，CD107a of CIK cells in FCM after 48 hours with Salvigenin effect
注:与对照组比较，* P ＜ 0． 05。
图 4 三裂鼠尾草素作用 CIK细胞 48 h后，CIK细胞对胃癌细胞株杀伤活性的影响;图 5 三裂鼠尾草素作用 CIK细胞 48 h后的
蛋白表达;图 6 三裂鼠尾草素作用后 CIK细胞 β-catenin、P-EＲK1 /2、Bcl-2 和 P-AKT灰度值比较
Fig 4 Effect of CIK cells on the activity of gastric cnacer cell lines after 48 hours with Salvigenin effect;Fig 5 Expression of pro-
tein of CIK cells after 48 hours with Salvigenin effect;Fig 6 Comparsion of β-catenin，P-EＲK1 /2，Bcl-2 and P-AKT grey value
after Salvigenin effect
3 讨论
CIK细胞是同时表达 CD3 和 CD56 两种膜蛋白分
子的免疫细胞，具有 T 淋巴细胞的抗肿瘤活性和非主
要组织相容性复合性(major histocompatibility complex，
MHC)限制性杀瘤特点，是肿瘤过继细胞免疫治疗中
的一种免疫效应细胞［5］。CIK 细胞增殖速度快，具有
杀瘤活性与杀瘤谱广特点，目前 CIK 细胞已应用于多
种肿瘤的治疗［6］。三裂鼠尾草是天然多酚类化合物，
属于黄酮类类似物，Noori等［3］研究发现三裂鼠尾草素
对荷瘤小鼠作用后抑制肿瘤生长速率，肿瘤体积变小，
调节免疫反应，提高抗肿瘤效力。Ｒafatian 等［7］研究
发现在氧化应激诱导人成神经细胞瘤 SH-SY5Y 细胞
的细胞凋亡和自噬过程中，三裂鼠尾草素可通过细胞
凋亡蛋白酶途径的独立抗氧化活性，促进细胞凋亡和
自噬活动的增强。本研究通过不同浓度三裂鼠尾草素
在体外诱导人 CIK细胞，发现在三裂鼠尾草素浓度为
1． 6 ～ 204． 8 pmol /L时，可明显促进 CIK 细胞增殖，浓
度为 25． 6 pmol /L时，CIK 细胞增殖率达最大值，当三
裂鼠尾草素浓度超过 819． 2 ～1 638． 4 pmol /L，CIK细胞
增殖出现明显抑制，这一效应呈现较明显剂量依赖关
系，提示三裂鼠尾草素对 CIK 细胞的增殖作用有浓度
窗现象。
PFP和 GraB均可存在于活化的 CTL 和 NK 细胞
胞质颗粒中，其介导的细胞毒途径是 CTL 和 NK 细胞
抗肿瘤的主要方式之一［8］。PFP 释放后当 Ca2 +存在
时，在靶细胞上聚合形成活性孔道，在靶细胞膜内外形
成明显的渗透压反差，导致靶细胞胀裂而死，GraB 也
可以通过此 PFP形成孔道进入靶细胞，诱导靶细胞凋
亡［9-10］。T细胞表面的 CD107a分子，与 T细胞活化以
后脱颗粒过程相关，其比值可以直接反应该效应细胞
具有的特异性杀伤活性［11-12］。本实验中发现三裂鼠
尾草素能够促进 CIK 细胞 GraB、PFP 和 CD107a 的表
达，从而增强了 CIK细胞对胃癌细胞的杀伤活性。
β-catenin的活化可激活 Erk分子，进而上调 Bcl-2
的表达，促进免疫细胞的存活，从而控制自身免疫应答
反应［13］。Bcl-2 蛋白家族直接调节线粒体膜的渗透性
从而调节细胞色素 C，发挥抗凋亡和促凋亡的作
用［14］。本实验发现三裂鼠尾草素可促进 CIK 细胞 β-
catetin、EＲK1 /2、Bcl-2 和 P-AKT 的表达，三裂鼠尾草
素在浓度为 1． 6 ～ 25． 6 pmol /L 时随着浓度的提高而
增强 CIK 细胞 Bcl-2 的表达，且对 CIK 细胞的增殖及
杀伤活性均有明显的促进作用。因此可以推断，三裂
鼠尾草素对 CIK 细胞的增殖及对肿瘤细胞的杀伤作
用与激活 β-catetin、EＲK1 /2 和 Bcl-2 信号通路的表达
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密切相关，在上述各信号通路中是否具有共同的调节
靶点亟待进一步研究。本实验中 CIK 细胞的 AKT 表
达也上调，三裂鼠尾草素可能还通过 PI3K /AKT 信号
传导通路进一步影响 T 细胞的增殖、分化，从而增强
对肿瘤细胞的杀伤作用。
综上所述，三裂鼠尾草素能够促进 CIK 细胞的增
殖，从而有效提高 CIK 细胞对胃癌细胞的杀伤活性，
其机制可能与三裂鼠尾草素激活 β-catetin、EＲK1 /2、
Bcl-2、P-AKT信号通路，上调 CIK 细胞中 GraB、PFP、
CD107a的表达有关。以上实验结果为三裂鼠尾草素
用于肿瘤的免疫治疗提供了实验依据，也为草药单体
在免疫细胞的培养应用中提供实例。
参考文献
［1］ Ma Y，Xu YC，Tang L，et al． Cytokine-induced killer(CIK)cell therapy
for patients with hepatocellular carcinoma:efficacy and safety［J］． Exp
Hematol Oncol，2012，1(1) :11．
［2］ Tumeh PC，Koya ＲC，Chodon T，et al． The impact of ex vivo clinical
grade activation protocols on human T-cell phenotype and function for
the generation of genetically modified cells for adoptive cell transfer
therapy［J］． J Immunother，2010，33(8) :759-768．
［3］ Noori S，Hassan ZM，Yaghmaei B，et al． Antitumor and immunomod-
ulatory effects of salvigenin on tumor bearing mice［J］． Cell Immunol，
2013，286(1-2) :16-21．
［4］ Liu JQ，Han HM，Chen FX． LAK cell activity was detected by lactate
dehydrogenase kit［J］． Journal of Clinical Laboratory Science，1995，
13(2) :83．
刘军权，韩慧敏，陈复兴． 用乳酸脱氢酶试剂盒检测 LAK细胞活
性［J］． 临床检验杂志，1995，13(2) :83．
［5］ Introna M，Franceschetti M，Ciocca A，et al． Ｒapid and massive ex-
pansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells:an innova-
tive proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood
transplantation ［J］． Bone Marrow Transplant， 2006， 38 (9) :
621-627．
［6］ Shu X，Li X，Whang ZY． The present research situation and progress
of CIK cells in gastric cancer therapy［J］． Med J Chin PAPF，2013，
24(6) :526-528．
舒心，李幸，汪治宇． 胃癌 CIK细胞治疗的研究现状及进展［J］．
武警医学，2013，24(6) :526-528．
［7］ Ｒafatian G，Khodagholi F，Farimani MM，et al． Increase of autophagy
and attenuation of apoptosis by Salvigenin promote survival of SH-SY5Y
cells following treatment with H2O2［J］． Mol Cell Biochem，2012，
371(1-2) :9-22．
［8］ Ma J，Li XH，Gao CJ，et al． The variety of the mＲNA expression of
perforin，granzyme B by expanded NK cells with different cytokines
from human peripheral blood［J］． Chin J Microbiol Immunol，2009，
29(4) :336-339．
马健，李晓红，高春记，等． 人外周血 NK细胞在细胞因子刺激下
扩增后穿孔素、颗粒酶 B基因表达的变化［J］． 中华微生物学和免
疫学杂志，2009，29(4) :336-339．
［9］ Liu CC，Walsh CM，Young JD． Perforin:structure and function［J］．
Immunol Today，1995，16(4) :194-201．
［10］ Smyth MJ，Trapani JA． Granzymes:exogenous proteinases that in-
duce target cell apoptosis［J］． Immunol Today，1995，16(4) :202-
206．
［11］ Parkinson-Lawrence EJ，Dean CJ，Chang M，et al． Immunochemical
analysis of CD107a (LAMP-1) ［J］． Cell Immunol，2005，236(1-
2) :161-166．
［12］ Aktas E，Kucuksezer UC，Bilgic S，et al． Ｒelationship between
CD107a expression and cytotoxic activity［J］． Cell Immunol，2009，
254(2) :149-154．
［13］ Charo J，Finkelstein SE，Grewal N，et al． Bcl-2 overexpression en-
hances tumor-specific T-cell survival ［J］． Cancer Ｒes，2005，65
(5) :2001-2008．
［14］ Borner C． The Bcl-2 protein family:sensors and checkpoints for life-
or-death decisions［J］． Mol Immunol，2003，39(11) :615-647．
(责任编辑:马 军)
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