全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 10 期 2011 年 10 月

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白藜芦醇对人 γδT 细胞生长和杀伤功能的影响
陈 玲，陈复兴，刘军权，周忠海，吕小婷，朱 云*，张 娟
中国人民解放军第九七医院 中心实验科，江苏 徐州 221004
摘 要：目的 探讨白藜芦醇对人外周血 γδT 细胞生长和杀伤功能的影响。方法 用异戊烯焦磷酸法体外扩增人 γδT 细胞，
不同浓度的白藜芦醇作用 γδT 细胞后，MTT 法检测 γδT 细胞生长情况，流式细胞术检测给药前后 γδT 细胞杀伤功能相关标
志物颗粒酶 B、穿孔素和 CD107a 的表达。结果 人外周血单核细胞（PBMC）培养 10 d 后，γδT 细胞比例从扩增前的 3.12%
增至 80.46%；白藜芦醇浓度为 0.2～12.5 μmol/L 时能促进 γδT 细胞生长，其中以 1.56 μmol/L 作用最明显，使细胞增殖率高
出对照组约 15.90%；白藜芦醇 1.56 μmol/L 可上调 γδT 细胞杀伤功能相关标志物颗粒酶 B、穿孔素、CD107a 表达，随着给
药浓度增高，γδT 增殖及其颗粒酶 B、穿孔素、CD107a 表达逐渐降低。结论 白藜芦醇在一定浓度范围内可促进 γδT 细胞
增殖，且增强 γδT 细胞杀伤功能相关标志的表达，这可能是其抗肿瘤作用机制之一。
关键词：白藜芦醇；γδT 细胞；细胞生长；颗粒酶 B；穿孔素；CD107a
中图分类号：R282.710.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)10 - 2056 - 04
Effects of resveratrol on human γδT cell growth and killing function
CHEN Ling, CHEN Fu-xing, LIU Jun-quan, ZHOU Zhong-hai, LV Xiao-ting, ZHU Yun, ZHANG Juan
Department of Central Laboratory, 97th Hospital of PLA, Xuzhou 221004, China
Abstract: Objective To investigate the effect of resveratrol on hunman γδT cell growth and killing function. Methods Using the
isopentenylpyrophosphate medthod to cultivate human peripheral blood γδT cell in vitro. Effect of resveratrol on γδT cell growth at
different concentrations was observed by MTT, flow cytometry was used to detect the γδT cell granzyme B, perforin, and CD107a
related to killing function before and after administration. Results γδT cells were amplified from 3.12% to 80.46% after human
peripheral blood mononuclear cells (PBMC) being cultured for 10 d. The certain concentration (0.2－12.50 μmol/L) of resveratrol
could promote the growth of γδT cell. At the concentration of 1.56 μmol/L, resveratrol could promote γδT cells most significantly with
proliferation rate 15.90% higher than that in the control group, and at this concentration resveratrol could significantly up-regulate the
expression of granzyme B, perforin, and CD107a related to killing function of γδT cells. With the increasing concentration of
resveratrol, the proliferation of γδT cells and the expression of granzyme B, perforin, and CD107a were reduced. Conclusion
Resveratrol at certain concentration could promote γδT cell proliferation and enhance the expression of its related markers with killing
function, which is one of the antitumor mechanisms.
Key words: resveratrol; γδT cell; cell growth; granzyme B; perforin; CD107a
白藜芦醇是一种含有 类结构的非黄酮类多酚
化合物，广泛存在于葡萄、虎杖、决明子和花生等
天然植物中[1]。白藜芦醇对多种肿瘤细胞有较强抑
制作用[2-3]，随着对白藜芦醇抗肿瘤作用的深入研
究，发现其不仅能直接抑制肿瘤生长，还能促进机
体淋巴细胞增殖，增强其杀伤肿瘤细胞的活性。γδT
细胞主要分布于黏膜和上皮组织内，具有较强的抗
感染、抗肿瘤、维持免疫耐受和调节免疫应答等作
用。本实验观察白藜芦醇对体外培养的 γδT 细胞生
长的影响，并通过检测 γδT 细胞杀伤功能相关标志
物穿孔素（perforin）、颗粒酶 B（granzyme B）、
CD107a 的表达，研究白藜芦醇对 γδT 细胞杀伤功
能的影响。
1 材料
1.1 药品与试剂
白藜芦醇（质量分数＞99%，批号 038k5202）、

收稿日期：2011-03-23
基金项目：南京军区科技创新经费资助项目（08MA039）
作者简介：陈 玲（1985—），女，山东人，检验师，学士学位，从事肿瘤生物治疗工作。Tel: 13645225827 E-mail: chenlingcl2@yahoo.cn
*通讯作者 朱 云 Tel: (0516)83349005 E-mail: Zhuyun65@126.com
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异戊烯焦磷酸（IPP）、MTT、二甲基亚砜（DMSO），
Sigma 公司产品；胰蛋白酶、RPMI 1640，Gibco 公
司产品；人 AB 血清，徐州市血站提供；胎牛血清
和淋巴细胞分离液，中国科学院血液病研究所提供；
白细胞介素-2（IL-2），厦门特宝生物公司产品；异
硫 氰 酸 荧 光 素 标 记 的 抗 人 γδT 细 胞 受 体
（TCR-γδ-FITC）、藻红蛋白（PE）标志的穿孔素、颗粒
酶B和CD107a均购自杭州联科生物公司；乳酸脱氢
酶（LDH）试剂盒，日本世诺临床诊断制品株式会
社产品。
1.2 仪器
ST—360 酶标仪，上海科华实验系统有限公司；
Encore自动生化分析仪，北京希亚克技术有限公司；
流式细胞仪（分析软件 CellQuest），美国 BD 公司。
2 方法
2.1 γδT 细胞培养与鉴定
按文献方法[4]培养 γδT 细胞。取健康献血者外
周静脉血 100 mL，抗凝，分离白细胞层后置于淋巴
细胞分离液上，以 1 800 r/min 离心 15 min，吸取单
个核细胞层，用生理盐水洗 3 次（1 500 r/min 离心，
每次 10 min），加入到 RPMI l640 培养液中（含 IL-2
2×105 U/L、100 ml/L 胎牛血清、50 ml/L 人 AB 血
清和 IPP 3 mg/L），调整细胞密度为 1×108/L，置
75 cm2 细胞培养瓶中，于 37 ℃、5%CO2 培养箱中
培养，根据细胞生长情况及时添加培养液。收集培
养 10 d 的贴壁生长细胞进行细胞检测和其他实验。
2.2 对 γδT 细胞生长的影响
将培养 10 d的 γδT细胞配成 5×107/L的细胞悬
液，接种于 96 孔板，200 μL/孔，再加入不同浓度
的白藜芦醇（终浓度分别为 100、50、12.5、1.56、
0.2 μmol/L），每个浓度设 5 个复孔，另设不加药物
的对照组及无细胞的空白孔。继续培养 48 h 后，每
孔加人 MTT 20 μL，37 ℃培养 4 h 后弃上清，每孔
加入 DMSO 150 μL，轻轻震荡 10 min 充分溶解，
在酶标仪上于 540 nm 波长测定各孔吸光度（A）值，
按上述方法重复操作 5 次，求平均值，计算细胞生
长率。
生长率＝A 给药组 / A 对照组
2.3 对 γδT 细胞颗粒酶 B、穿孔素的影响
将培养 10 d的 γδT细胞配成 1×108/L的细胞悬
液，接种于 6 孔培养板中，5 mL/孔，再加入不同浓
度的白藜芦醇（终浓度分别为 12.5、1.56、0.2、0
μmol/L），每个浓度设 3 个复孔。48 h 后收集 γδT
细胞，PBS 洗 3 次后再用 PBS 调整细胞数为 1×
107/mL，取 100 μL，加入抗人 TCR-γδ-FITC 20 μL，
室温避光培养 15 min，用 PBS 洗涤，加入 100 μL
破膜剂 A，室温避光培养 15 min，PBS 再洗后每管
加入破膜剂 B 100 μL、颗粒酶 B-PE 抗体 5 μL（或
加入穿孔素-PE 抗体 20 μL 用于穿孔素的检测），共
同培养 15 min，PBS 洗涤，加入 PBS 400 μL 后用
流式细胞仪检测，每个标本分析细胞≥1×104个。
2.4 对 γδT 细胞 CD107a 的影响
将培养 10 d 的 γδT 细胞配成 1×108/L 的细胞悬
液，分别接种于 6 孔细胞培养板中，5 mL/孔，加入
不同浓度的白藜芦醇（终浓度分别为 12.5、1.56、0.2
μmol/L），每个浓度设 3 个复孔。48 h 后收集 γδT 细
胞，PBS 洗涤 3 次后再用 PBS 调整细胞数为 1×
107/mL，取 100 μL，加入抗人 TCR-γδ-FITC 20 μL、
抗人 PE-CD107a 5 μL，室温避光培养 15 min，PBS
洗涤，加入 PBS 400 μL 后用流式细胞仪检测。
2.5 统计学处理
采用 SPSS 16.0 软件进行统计学处理，数据以
sx ± 表示，组间比较采用独立样本 t 检验。
3 结果
3.1 γδT 细胞形态学观察和纯度检测
外周血单核细胞（PBMC）在 γδT 细胞培养基
中培养 24 h即可见贴壁生长，48 h后集落开始变大，
培养 10 d 可见大的集落和单个贴壁生长的细胞，单
个细胞可见其呈条梭状，也有少量呈浮悬状（图 1）。
收集培养前后细胞进行 mAb 荧光标志后用流式细
胞术检测。培养前 γδT 细胞为 3.12%；培养 10 d 后
γδT 细胞为 80.46%。

图 1 γδT 细胞形态学观察
Fig. 1 Morphological observation of γδT cells
3.2 对 γδT 细胞生长的影响
白藜芦醇浓度为 0.2～12.5 μmol/L 时，促进 γδT
细胞生长，其中以 1.56 μmol/L 作用最明显，使细胞
增殖增加（15.90±5.44）%，与对照组比较差异显
著（P＜0.05）；当白藜芦醇浓度高于 12.5 μmol/L 时，

培养 48 h 培养 10 d
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对 γδT 细胞生长表现出抑制作用，浓度升高至 100
μmol/L 时抑制率达（78.89±4.74）%。结果见图 2。
3.3 对 γδT 细胞的颗粒酶 B、穿孔素、CD107a 的
影响
经白藜芦醇 0.2～12.5 μmol/L（在此浓度范围促
进 γδT 细胞生长）作用 48 h 后，γδT 细胞中颗粒酶
B、穿孔素、CD107a 的表达均明显高于对照组（P＜
0.01）。结果见表 1。

与对照组比较：*P＜0.05
*P<0.05 vs control group
图 2 白藜芦醇对 γδT 细胞生长的影响 ( 5=± n , sx )
Fig. 2 Effect of resveratrol on γδT cells growth ( 5=± n , sx )
表 1 白藜芦醇对 γδT 细胞穿孔素、颗粒酶 B 和 CD107a
表达的影响 ( 3=± n , sx )
Table 1 Effect of resveratrol on granzyme B, perforin,
and CD107a in γδT cells ( 3=± n , sx )
组 别 C /
(μmol·L−1)
穿孔素/
%
颗粒酶 B/
%
CD107a/
%
对照 − 51.78±3.53 72.76±3.66 31.97±3.60
0.20 91.03±2.79** 91.32±3.62** 77.34±3.25**白藜芦醇
1.56 98.18±1.33** 98.03±1.06** 81.39±4.12**
12.50 95.35±3.32
** 95.85±2.53** 79.14±2.64**
与对照组比较：**P＜0.01
**P<0.01 vs control group
4 讨论
白藜芦醇是一种天然化合物，结构类似于雌激
素已烯雌酚，是植物为抵抗外界刺激，如紫外线、
真菌与病毒感染或机械损伤而产生的一种植物抗毒
素[1]。白藜芦醇具有抗氧化作用，可调节脂类代谢、
保护心脑血管，还具有抗炎、抗菌、抗过敏、抗肿
瘤等多种药理作用，且无明显不良作用，具有重要
的药用价值。有研究表明，白藜芦醇通过阻断多种
炎症反应信号通路的分子表达 [5]和降低细胞的
COX-2 活性[6]发挥抗肿瘤作用；Fulda 等[7-9]进行的
体外研究也证实，白藜芦醇能诱导多种肿瘤细胞凋
亡。随着研究的不断深入，人们发现白藜芦醇还能
通过促进淋巴细胞增殖、多种细胞因子释放[10-12]，
上调免疫细胞中 NKG2D 的表达[13]，来增强免疫细
胞的杀伤功能。
γδT 细胞最早从肺癌浸润淋巴细胞中发现，随
着研究的不断深入，发现其主要分布在皮肤、小肠、
食管、肺等上皮组织内，在免疫调节、肿瘤免疫监
视和特异性初次免疫应答中起重要作用[14]。γδT 细
胞杀伤肿瘤细胞的主要机制是通过识别表达在肿瘤
细胞表面的磷酸化抗原和 NKG2D、MICA/B、
uLBPs、FI-ATP 合酶等配体识别肿瘤细胞，再释放
穿孔素、颗粒酶 B 和 Fas/FasL 杀伤肿瘤细胞。穿孔
素存在于细胞毒性 T 淋巴细胞、天然杀伤（NK）
细胞和 γδT 细胞胞质的细胞毒颗粒中，当这些细胞
与靶细胞接触后可释放穿孔素，在靶细胞膜上形成
多聚穿孔素管状通道，导致靶细胞溶解破坏[15]。颗
粒酶 B 是杀伤性 T 淋巴细胞和 NK 细胞颗粒中最重
要的丝氨酸蛋白酶，其通过 caspases 依赖途径直接
进入核途径及不依赖 caspases 的胞质途径杀伤靶细
胞[16]。CD107a 与 T 细胞和 NK 细胞介导的靶细胞
溶解密切相关，实验证明 CD107a 的表达可作为其
细胞毒活性的一个敏感指标[17]。
本实验结果显示，白藜芦醇为 0.20～12.5
μmol/L 能促进 γδT 细胞增殖，当浓度大于 12.5
μmol/L 时抑制 γδT 细胞生长，且抑制率随浓度的升
高而增加，这与 Boscolo[12]报道的相一致。当白藜
芦醇浓度低于 1.56 μmol/L 时，经流式细胞仪检测发
现穿孔素、颗粒酶 B、CD107a 的表达均增高，且具
有浓度相关性；大于 1.56 μmol/L，γδT 细胞免疫表
型的表达随浓度的升高而递减，这种“浓度窗”现
象为该药的临床应用提供了参考。本实验证实白藜
芦醇抗肿瘤作用存在着多种作用机制，为今后白藜
芦醇在肿瘤免疫治疗中的应用提供依据。低浓度白
藜芦醇诱导 γδT 细胞提高杀伤活性除与颗粒酶 B、
穿孔素、CD107a 表达增强外，是否还与白藜芦醇
促进细胞 ICAM-1 高表达等其他因素有关尚待进一
步研究。
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对照 0.20 1.56 12.50 50.00 100.00
白藜芦醇 / (μmol·L−1)
140
120
100
80
60
40
20
0
*
生
长
率
/%

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