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羽扇豆醇对胰腺癌细胞株SW1990及γδT细胞生长的影响



全 文 :www.wjgnet.com

wcjd@wjgnet.com
世界华人消化杂志 2011年10月8日; 19(28): 2958-2962
ISSN 1009-3079 (print) ISSN 2219-2859 (online)
研究快报 RAPID COMMUNICATION
羽扇豆醇对胰腺癌细胞株SW1990及γδT细胞生长的影响
罗冠琴, 朱炳喜, 陈复兴, 刘军权, 黄 菲, 吕小婷
®
■背景资料
近年来研究发现
γδT细胞以MHC
非限制方式杀伤
肿瘤细胞在免疫
监视中具有重要
作用, γδT细胞识
别谱广泛, 对肿瘤
细胞的识别不需
要抗原提呈细胞
加 工 处 理 . 因 此 ,
γδT细胞已成为肿
瘤患者过继免疫
治疗的一个新的
候选效应细胞. 国
外研究表明, 羽扇
豆醇抗胰腺癌的
作用, 但是对γδT
细胞作用尚无报
道. 因此, 本课题
组研究羽扇豆醇
对γδT细胞生长的
影响及杀伤胰腺
癌细胞株SW1990
作用的影响.
罗冠琴, 徐州医学院 江苏省徐州市 221002
朱炳喜, 徐州医学院附属医院消化内科 江苏省徐州市 221002
陈复兴, 刘军权, 黄菲, 吕小婷, 中国人民解放军第九七医院
实验科 江苏省徐州市 221004
作者贡献分布: 课题设计由罗冠琴、朱炳喜、陈复兴及刘军权
完成; 研究过程操作由罗冠琴、刘军权、黄菲及吕小婷完成; 数
据分析由罗冠琴与刘军权完成; 本论文写作由罗冠琴与朱炳喜
完成.
通讯作者: 朱炳喜, 主任医师, 221002, 江苏省徐州市, 徐州医学
院附属医院消化科. 82200496 @163.com
电话: 0516-85802084
收稿日期: 2011-07-31 修回日期: 2011-09-08
接受日期: 2011-10-02 在线出版日期: 2011-10-08
Effect of lupeol on the growth
of human pancreatic cancer
SW1990 cells and γδT cells
Guan-Qin Luo, Bing-Xi Zhu, Fu-Xing Chen,
Jun-Quan Liu, Fei Huang, Xiao-Ting Lv
Guan-Qin Luo, Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002,
Jiangsu Province, China
Bing-Xi Zhu, Department of Gastroenterology, the Affili-
ated Hospital of Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002,
Jiangsu Province, China
Fu-Xing Chen, Jun-Quan Liu, Fei Huang, Xiao-Ting Lv,
Department of Central Laboratory, the 97th Hospital of Chi-
nese PLA, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China
Correspondence to: Bing-Xi Zhu, Associate Professor,
Department of Gastroenterology, the Affi liated Hospital of
Xuzhou Medical College, Xuzhou 221002, Jiangsu Prov-
ince, China. 82200496 @163.com
Received: 2011-07-31 Revised: 2011-09-08
Accepted: 2011-10-02 Published online: 2011-10-08
Abstract
AIM: To explore the effect of lupeol on the grow-
th of human pancreatic cancer SW1990 cells and
γδT cells.
METHODS: Peripheral blood γδT cells, expanded
in vitro, were used in our study. After SW1990
and γδT cells were incubated with different con-
centrations of lupeol for different durations (24,
48 and 72 h), cell growth was determined by
MTT assay. A blank control and a solvent con-
trol were run simultaneously.
RESULTS: The Lupeol at doses of 0.4-200 µg/mL,
there are significant differences of growth hu-
man pancreatic cancer cell line SW1990 cells be-
tween the groups of 24, 48, 72 h and blank con-
trol group, the solvent control group (P < 0.05),
however, no difference had been observed in
each groups of three separated times. Harvested
7 d, γδT cells had expanded to 80.2% from 3.61%.
in the groups of 24, 48 and 72 h, the effects
turned to be advantageous and then depressed
as the dose was increasing. there are no differ-
ences between the groups of 24 h and blank con-
trol group, the solvent control group. there are
signifi cant differences between the groups of 48,
72 h and blank control group, the solvent control
group (P < 0.05).
CONCLUSION: Lupeol suppressed the growth
of SW1990 cells, but produced a facilitative ef-
fect fi rst and then inhibitory effect on the growth
of γδT cells.
Key Words: Lupeol; SW1990 cells; γδT cells
Luo GQ, Zhu BX, Chen FX, Liu JQ, Huang F, Lv XT.
Effect of lupeol on the growth of human pancreatic cancer
SW1990 cells and γδT cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi
2011; 19(28): 2958-2962
摘要
目的: 探讨羽扇豆醇对人胰腺癌细胞SW1990
及γδT细胞生长的影响.
方法: 采用本实验室体外扩增人外周血γδT细
胞, 用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度
的羽扇豆醇在不同时间段对人γδT细胞和人
胰腺癌细胞SW1990生长的影响. 本实验分3
组: 空白对照组、溶剂对照组和实验组, 时间
段分24、48、72 h组.
结果: 羽扇豆醇浓度在0.4-200 µg/mL时羽扇
豆醇对人胰腺癌细胞SW1990在24、48、72 h
各组与空白对照组和溶剂对照组相比差异有
统计学意义(P <0.05). 而24、48、72 h3组比较
差异无统计学意义. γδT细胞培养7 d从扩增前
的3.61%增加到80.2%, 羽扇豆醇对γδT细胞在
24、48、72 h随浓度的增加先增值后抑制作
用. 24 h与空白对照组和溶剂对照组比较差异
无统计学意义. 48、72 h各组与空白对照组和
■同行评议者
刘超, 副教授, 中
山 大 学 孙 逸 仙
纪 念 医 院 肝 胆
胰外科 ; 吴泰璜 ,
教 授 , 山 东 省 立
医 院 肝 胆 外 科
罗冠琴, 等. 羽扇豆醇对胰腺癌细胞株SW1990及γδT细胞生长的影响 2959
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■研发前沿
γδT细胞以MHC
非限制性方式杀
伤肿瘤细胞, 现已
报告用扩增的自
身γδT细胞对人胃
癌、淋巴瘤和晚
期肾癌进行了治
疗, 初步结果是安
全有效地 . 因此 ,
如何在体内外大
量快速扩增, 重点
是增强γδT细胞杀
伤活性, 深入探讨
其作用机制是目
前致力于研究的
问题.
溶剂对照组相比差异有统计学意义(P <0.05).
结论: 羽扇豆醇对人胰腺癌细胞SW1990有抑
制作用, 对γδT细胞随着浓度增加有先促进后
抑制作用.
关键词: 羽扇豆醇; 胰腺癌细胞SW1990; γδT细胞
罗冠琴, 朱炳喜, 陈复兴, 刘军权, 黄菲, 吕小婷. 羽扇豆醇对胰
腺癌细胞株SW1990及γδT细胞生长的影响. 世界华人消化杂志
2011; 19(28): 2958-2962
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0 引言
胰腺癌是恶性程度极高的消化系肿瘤, 大约80%
胰腺癌在确诊时已经失去手术机会[1], 这部分患
者只能采取包括化疗、放疗、生物治疗、支持
治疗等各种综合治疗手段来延长患者的生存时
间, 近年来肿瘤的生物治疗成为研究的热点. 羽
扇豆醇是一种三砧类化合物, 在多种水果, 蔬菜
以及某些植物中能提取, 如芒果、藕节、夹竹
桃、马齿觅、榕树皮中可以提取. 随着对羽扇
豆醇生物活性研究的深入, 其在医药领域获得
了广泛的重视[2]. 近年来羽扇豆醇抗肿瘤作用被
国外学者重视并用于研究, 国内研究甚少. 本文
重点研究羽扇豆醇对人胰腺癌细胞SW1990和
人γδT细胞的生长的影响, 探讨其抗胰腺癌作用.
1 材料和方法
1.1 材料 人胰腺癌癌细胞株S W1990(中国
科学院上海细胞所 , 本室传代 ) ; 羽扇豆醇
(lupeol)(Sigma公司); RPMI 1640培养基、小牛
血清、胰蛋白酶(G i b c o公司); 四甲基偶唑蓝
(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)(Sigma公司); 抗人
TCR-γδ-FITC购自杭州联科生物(immunotech,
France); 恒温CO2培养箱公司、倒置显微镜(德
国Wilovert公司); 超净工作台、低温离心机 (北
京希亚克技术有限公司).
1.2 方法
1.2.1 羽扇豆醇原液配制: 羽扇豆醇纯度≥95%
购于Sigma公司. 用温无水乙醇和二甲基亚砜
(DMSO)按1∶1比例混匀, 配制原液浓度为10 g/L,
放入-20 ℃冰箱储存, 以备使用.
1.2.2 γδT细胞的培养、鉴定和纯度检测: 按本实
验室[3]建立的方法进行, 将培养第5天的DC用终浓
度为10 µmol/L的唑来膦酸预处理48 h后收集DCs,
生理盐水洗涤1次,用含IL-2 400 U/mL、10%小牛
血清的RPMI 1640培养基将DCs配成1×103/mL
的细胞悬液, 与用相同培养基配成1×104/mL的
自身PBMC等体积混合(细胞比例为1∶10), 于
37 ℃, 50 mL/L CO2细胞培养箱中培养,每2 d半
量换培养基 1次 , 同时调整细胞密度至 1×
105/m L. 收集不同培养时间的γδT细胞进行相
关功能检测.
1.2.3 人胰腺癌细胞株SW1990的培养: 将复苏后
的细胞配成2×105/mL的细胞悬液, 置于细胞培
养瓶中, 在37 ℃, 50 mL/L CO2条件下培养, 2-3 d
更换细胞培养液, 细胞达80%瓶底时, 以0.02%
EDTA消化脱壁. 收集细胞, 800 r/min离心3 min,
弃去上清备用.
1.2.4 羽扇豆醇对人胰腺癌细胞SW1990和人γδT
细胞生长的影响: 将收集的对数生长期胰腺癌
细胞SW1990配成3×104/mL的细胞悬液, 接种于
96孔板中, 0.2 mL/孔, 加入羽扇豆醇(浓度分别
为200、100、50、25、12.5、6.25、3.2、1.6、
0.8、0.4 mg/L). 人γδT细胞配成1×105/mL的细
胞悬液, 接种于96孔板中, 0.2 mL/孔, 加入羽扇
豆醇(浓度分别为400、200、100、50、25、
12.5、6.25、3.2、1.6、0.8 mg/L). 同时设空白和
溶剂(每孔加入与溶解羽扇豆醇的等量溶剂)对
照组, 每组设5个复孔. 继续孵育24、48、72 h后
每孔加人MTT(5 g/L)液20 µL,37 ℃孵育4 h后弃
上清, 每孔加入DMSO 150 µL,轻轻震荡10 min
使甲瓒充分溶解, 在540 nm波长酶标仪上测定
各孔吸光度值(A ). 每试验重复3次. 求其平均值.
细胞生长抑制率IR(%) = (对照A )-(实验A值)/(对
照A )×100%, 增殖率 = 实验A值-对照A值/对照
A值×100%.
统计学处理 采用SPSS16.0软件, 进行统计
学处理, 计量资料使用mean±SD表示, 采用单
因素方差分析(One-way ANOVA), 两两比较使
用S-N-K法或者Duncan法, 检验水准α = 0.05,
P <0.05为差异有统计学意义.
2 结果
2.1 γδT培养形态学及纯度 人外周血单个核细
胞(PBMC)在γδT细胞培养基中培养24 h即可见
贴壁生长, 48 h后集落开始变大, 培养7 d可见大
的集落和单个贴壁生长细胞, 单个细胞可见细
胞呈条梭状, 也有少量浮悬生长细胞. 收集培养
7 d时的细胞进行流式细胞术检测并分析结果.
PBMC未培养前γδT细胞数为3.61%, 培养7 d的
γδT细胞数为80.2%(图1).
2 . 2 不 同 浓 度 的 羽 扇 豆 醇 对 人 胰 腺 癌 细 胞
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■相关报道
陈复兴等研究发
现 体 外 培 养 的
γ δT 细 胞 对 多 种
消化系肿瘤人胃
癌、胰腺癌、肝
癌细胞株均有较
强 的 杀 伤 作 用 .
且 γ δT 细 胞 杀 伤
肿瘤主要通过颗
粒酶、穿孔素、
Fas/FasL途径起
作用. Corvaisier
等发现γδT细胞对
自身肿瘤细胞和
异体肿瘤细胞均
有杀伤活性, 而对
自身正常细胞无
杀伤作用, 这种杀
伤是MHC非依赖
性的, 并与γδTCR
刺激物的产生和
ICAM-1表达密切
相关.
SW1990不同时间段生长的影响 羽扇豆醇浓度
在0.4-200 mg/L时能够显著抑制SW1990细胞
的生长, 且随着浓度的增加抑制率呈上升趋势,
24、48、72 h 3个时间段羽扇豆醇对SW1990细
胞的抑制率无明显统计学差异(图2). 24、48、
72 h各组的A值与空白对照组和溶剂对照组相比
较均具有统计学意义(P <0.05).空白对照与溶剂
对照组比较无统计学意义(表1).
2.3 不同浓度的羽扇豆醇对人γδT细胞不同时间
段生长的影响 羽扇豆醇对人γδT细胞24、48、
72 h浓度从0.8-12.5 mg/L时对人γδT细胞的生长
呈促进作用, 随着浓度的升高增值率升高; 在浓
度12.5-100 mg/L时对促进人γδT细胞的生长现象
逐渐减弱. 羽扇豆醇浓度在100-400 mg/L时对人
γδT细胞生长起抑制作用. 图示48、72 h浓度为
12.5 mg/L时其增值率最高(图3). 羽扇豆醇对人
γδT细胞MTT测得A值分析, 24 h与空白对照组
比较无统计学意义, 48、72 h与空白对照组比较
有统计学意义(P <0.05), 48与72 h比较无统计学
意义, 空白对照组与溶剂对照组比较无统计学
意义(表2).
表 1 不同浓度羽扇豆醇作用24、48、72h后对SW1990细胞生长的影 (mean±SD)

羽扇豆醇浓度(µg/L) SW1990细胞A 值 24 h 48 h 72 h
空白对照组 0.1627±0.0025 0.1353±0.006 0.1425±0.0049
溶剂对照组 0.1653±0.032 0.1360±0.041 0.1419±0.003
0.4 0.1450±0.003a 0.1283±0.002a 0.1230±0.0015a
0.8 0.1440±0.005a 0.1273±0.0015a 0.1180±0.0045a
1.6 0.1433±0.0051a 0.1263±0.0025a 0.1200±0.002a
3.125 0.1427±0.0025a 0.1260±0.003a 0.1193±0.0025a
6.25 0.1363±0.002a 0.1250±0.001a 0.1163±0.025a
12.5 0.1357±0.003a 0.1230±0.002a 0.1160±0.001a
25 0.1230±0.001a 0.1230±0.0036a 0.1140±0.004a
50 0.1110±0.001a 0.1160±0.003a 0.1117±0.002a
100 0.1057±0.006a 0.1067±0.0035a 0.1100±0.001a
200 0.0827±0.0116a 0.0880±0.005a 0.0837±0.032a
aP<0.05 vs 空白对照组.
100 101 102 103 104
3.61%
0



40



8
0


1
20


1
60


2
00
GD FITC
Co
un
ts
A
100 101 102 103 104
80.2%
0



40



8
0


12
0


16
0


20
0
GD FITC
Co
un
ts
B
图 1 PBMC培养前后γδT细胞百分数. A: 培养前; B: 培养后.
60
50
40
30
20
10
0



(%
)
0 0.4 0.8 1.6 3.125 6.25 12.5 25 50 100 200
羽扇豆醇(mg/L)
24 h
48 h
72 h
图 2 不同浓度的羽扇豆醇对SW1990细胞生长的影响.
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罗冠琴, 等. 羽扇豆醇对胰腺癌细胞株SW1990及γδT细胞生长的影响 2961
■应用要点
本文研究发现羽
扇豆醇在体外能
够 促 进 γ δT 细 胞
的 增 殖 , 有 益 于
羽扇豆醇应用于
肿瘤的过继免疫
治 疗 , 并 提 供 了
临床治疗肿瘤的
用药依据.
3 讨论
羽扇豆醇是一种三砧类天然植物提取物, 既往研
究表明, 羽扇豆醇在抗炎止痛、抗氧化等方面有
很好的药理作用, 而且毒性很低, 具有良好的临
床应用潜力, 受到国内外学者的广泛关注[2]. 近几
年其抗肿瘤作用受到重视, 有研究表明羽扇豆
醇对黑色素瘤、前列腺癌、皮肤癌、肝癌都有
抗癌作用[4]. 对于羽扇豆醇抗胰腺癌的作用, 国
内外报道较少. 本研究用四甲基偶氮唑蓝(MTT)
法检测不同浓度的羽扇豆醇在不同时间段对人
胰腺癌细胞SW1990生长的影响, 实验表明羽扇
豆醇浓度在0.4-200 mg/L时能够显著抑制胰腺
癌细胞SW1990的生长, 且随着浓度的增加抑制
率呈上升趋势, 24、48、72 h各组的A值与空白
对照组和溶剂对照组相比较均具有统计学意义
(P <0.05). 本实验提示羽扇豆醇对人胰腺癌细胞
SW1990有抑制作用, 其机制可能与羽扇豆醇下
调cFLIP的表达、增加caspase-8蛋白的活性、
增强TRAIL对胰腺癌细胞的促凋亡作用有关[5].
人 γ δ T细胞在 P B M C淋巴细胞中仅占
0.5%-5.0%, 大多为CD4-CD8-. γδT细胞主要分布
于皮肤、小肠、食管、肺、生殖器官及皮下组
织. 外周血中的γδT细胞约占人体总γδT细胞的
90%以上, 他识别磷酸化抗原和一些应激分子以
及激蛋白的同源分子, 他识别抗原分子不受MHC
分子限制, 在固有免疫中发挥重要作用[6,7]. 近年
来γδT细胞是免疫学的一个研究热点, 国内外学
者对其分化和功能进行了广泛深入的研究[8,9]. 对
其功能研究多集中在抗感染和抗肿瘤等方面[10,11],
γδT细胞的抗肿瘤功能与细胞表达的穿孔素、颗
粒酶B和NKG2D受体及γδT细胞分泌的细胞因子
有关. 在诱导机体固有免疫应答和在肿瘤细胞的
预治方面具有重要的作用[12]. Kobayashi等[13]用自
身γδT细胞治疗7例晚期肾癌, 结果证明治疗是安
全的, 治疗后能明显增加血中γδT细胞数量和诱
发抗肿瘤反应. γδT细胞识别谱广泛, 对肿瘤细胞
的识别不需要抗原提呈细胞加工处理, 没有MHC
限制性. 因此, γδT细胞已成为肿瘤患者过继免疫
治疗的一个新的候选效应细胞. 研究已证实, 在
直肠癌、肾癌、肝癌和乳腺癌等实体瘤的肿瘤
浸润淋巴细胞(TIL)中存在有γδT细胞并具有抗肿
瘤作用[14,15]. Bani等[16]研究发现羽扇豆醇对T细胞
生长有抑制作用, Balb/c小鼠每日口服羽扇豆醇
12.5-200 mg/kg, 可抑制CD4+和CD8+细胞数量. 随
着研究的不断深入, 发现培养的外周血γδT细胞
在体外同样具有较强的广谱抗肿瘤作用[17-19], 羽
扇豆醇对γδT细胞的作用国内外未有研究. 本实
表 2 不同浓度羽扇豆醇作用24、48、72 h后对人γδT细胞生长的影响 (mean±SD)

羽扇豆醇浓度(µg/L) γδT细胞A 值 24 h 48 h 72 h
空白对照组 0.0850±0.0210 0.0753±0.0095 0.0867±0.0068
溶剂对照组 0.0880±0.0450 0.0761±0.0122 0.0834±0.0356
0.4 0.1033±0.0069 0.1003±0.0101 0.1480±0.0170a
0.8 0.1047±0.0015 0.1140±0.0140a 0.1440±0.0400a
1.6 0.0960±0.0144 0.1200±0.0070a 0.1580±0.0300a
3.125 0.1033±0.0196 0.1360±0.0220a 0.1760±0.0800a
6.25 0.0993±0.0286 0.1370±0.0240a 0.1640±0.0300a
12.5 0.0770±0.0200 0.1117±0.0225 0.1760±0.0800a
25 0.0730±0.0050 0.1013±0.0127 0.1690±0.0200a
50 0.0667±0.0176 0.0863±0.0015 0.1093±0.0104
100 0.0640±0.0199 0.0740±0.0195 0.0700±0.0098
200 0.0673±0.1069 0.0730±0.0173 0.0690±0.0020
aP<0.05 vs 空白对照组.
图 3 不同浓度的羽扇豆醇对γδT细胞生长的影响.
140
120
100
80
60
40
20
0
-20
-40



(%
)
0 0.8 1.6 3.2 6.25 12.5 25 50 100 200 400
羽扇豆醇(mg/L)
24 h
48 h
72 h
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验采用体外扩增人外周血γδT细胞, 探讨不同浓
度的羽扇豆醇在不同时间段对人γδT细胞的影
响, 发现羽扇豆醇在24、48、72 h浓度从0.8-12.5
mg/L时对γδT细胞的生长呈促进作用, 随着浓度
的升高增值率升高; 在浓度12.5-100 mg/L时对促
进γδT细胞的生长现象逐渐减弱. 所以羽扇豆醇
对γδT细胞的增殖作用有浓度和时间的关系.本实
验结果显示羽扇豆醇对γδT细胞的最佳增殖作用
在72 h 12.5 mg/L时. 关于羽扇豆醇是否增强γδT
细胞的杀伤活性, 及其对γδT细胞的信号通路的
机制将在今后的研究中深入探讨.
本研究表明羽扇豆醇有促进人γδT细胞体
外增殖的作用, 羽扇豆醇具有抗胰腺癌的作用.
通过本研究现象, 我们推测可在体外培养胰腺
癌患者γδT细胞时选择适当浓度羽扇豆醇和培
养一定时间以增加免疫细胞数量和功能, 再回
输给胰腺癌患者, 可提高肿瘤生物治疗的效果.
本研究为羽扇豆醇在胰腺癌患者生物免疫治疗
中的应用提供了一定的理论依据, 羽扇豆醇治
疗胰腺癌的确切机制及体内实验结果仍需进一
步研究.
4 参考文献
1 Loos M, Kleeff J, Friess H, Büchler MW. Surgical
treatment of pancreatic cancer. Ann N Y Acad Sci
2008; 1138: 169-180
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编辑 曹丽鸥 电编 何基才
■同行评价
本 文 分 析 合 理 ,
条 理 分 明 , 参 考
文 献 恰 当 , 研 究
有一定意义.